銀杏葉復(fù)方干預(yù)大鼠脾虛證的代謝組學(xué)初步研究

岳 穩(wěn)，李 焰，鄧 凡，李 婷，潘佳佳，黃 杰，邱龍新

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364000；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建福州 350000；3.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000；4.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖 364000）

脾為五臟之一，“主運(yùn)化”為其最主要、最基本的功能，是指對飲食物質(zhì)的消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等過程，脾虛通常導(dǎo)致這些過程紊亂[1]。四君子湯出自宋代《太平惠民合劑局方》，是調(diào)節(jié)脾胃功能的經(jīng)典方劑。甄畢賢等[2]研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯對脾虛大鼠存在的脂類代謝、氨基酸代謝等多種代謝紊亂具有一定的治療效果；Yan 等[3]運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究推測線粒體中的脂肪酸延長和脂肪酸代謝可能是四君子湯干預(yù)脾虛證的主要代謝途徑。銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，味甘、苦、澀，性平，歸心、肺經(jīng)，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂等功能[4]。本課題組在前期研究中用銀杏葉與四君子湯增減配伍，將銀杏葉與黨參、茯苓、白術(shù)、黃芪等中藥組合制成復(fù)方制劑，證實(shí)銀杏葉復(fù)方提高了脾虛證小鼠腸道吸收功能，還可改善脾虛性斷奶仔豬腸道黏膜形態(tài)，對脾虛性腹瀉斷奶仔豬的肝脾損傷具有修復(fù)作用[5-6]。為進(jìn)一步探究銀杏葉復(fù)方的作用機(jī)理，本試驗(yàn)基于大鼠脾虛證模型，經(jīng)與傳統(tǒng)固本方劑-四君子湯比較，采用LC-MS 代謝組學(xué)技術(shù)，篩選銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證的相關(guān)差異代謝物，并構(gòu)建相關(guān)代謝通路，為應(yīng)用中藥調(diào)控脾虛、開發(fā)抗病促壯中藥飼料添加劑提供思路，為開發(fā)銀杏葉為主要原料的新獸藥產(chǎn)品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 24 只體重（200±20）g 雄性清潔級SD大鼠購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證編號：SCXK（閩）2016-0002。

1.2 試驗(yàn)藥品 銀杏葉、黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、砂仁、陳皮、甘草購自龍巖市人民醫(yī)院，利血平注射液（廣東邦民制藥廠有限公司，1 mg/mL），甲醇、乙腈、乙酸銨和氨水純度均為LC-MS 級（CNW Technologies），L-2-氯苯丙氨酸（純度≥98%，上海恒柏生物科技有限公司）。

1.3 銀杏葉復(fù)方和四君子湯的制備 藥物的制備方法參照課題組前期研究[7]，銀杏葉復(fù)方由銀杏葉、黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、砂仁、陳皮按一定比例組成，四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草按2:2:2:1 比例組成，均制成含2 g/mL 生藥的濃縮液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠脾虛證模型的建立 大鼠脾虛證模型的建立依據(jù)中醫(yī)脾虛證診斷參考標(biāo)準(zhǔn)[8]，選擇利血平造脾虛模型，通過動物試驗(yàn)，以大鼠明顯消瘦、肌瘦無力、食欲下降、便溏瀉下、精神萎靡、毛色粗亂、蜷縮聚集等明顯脾虛體征為脾虛證模型復(fù)制成功，確定大鼠脾虛證模型使用利血平劑量為0.6 mL/kg。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將24 只清潔級健康雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、脾虛模型組、四君子湯組（作陽性對照）和銀杏葉復(fù)方組，每組6 只。對照組給予生理鹽水，分別灌胃（10 mL/kg）和皮下注射（0.6 mL/kg）；脾虛模型組給予生理鹽水灌胃（10 mL/kg）和皮下注射利血平（0.6 mL/kg），四君子湯組灌服四君子湯（10 mL/kg）同時皮下注射利血平（0.6 mL/kg），銀杏葉復(fù)方組灌服銀杏葉復(fù)方（10 mL/kg）同時皮下注射利血平（0.6 mL/kg），于第3 天出現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道相符的脾虛癥狀[9]。每日觀察試驗(yàn)動物精神狀態(tài)和體態(tài)特征，連續(xù)12 d。

1.6 血漿采集和代謝物提取 試驗(yàn)結(jié)束后，采用腹腔注射10%水合氯醛方法將大鼠麻醉，逐只于腹主動脈采血2 mL 置于肝素鈉抗凝管中，3 000 r/min 室溫離心10 min，分裝于1.5 mL EP 管中，-80℃保存。

血漿樣本代謝物的提取參照文獻(xiàn)[10-11]方法進(jìn)行，取100 μL 抗凝血，加入400 μL 含有內(nèi)標(biāo)的提取液（甲醇:乙腈體積比為1:1，內(nèi)標(biāo)濃度2 μg/mL），渦旋混勻30 s，冰水浴超聲5 min，-20℃靜置1 h，4℃、12 000 r/min離心15 min，取出250 μL 上清于EP 管中，在真空濃縮器中干燥提取物，向干燥后的代謝物加入200 μL 提取液（乙腈:水體積比為1:1）復(fù)溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min，4℃、12 000 r/min 離心15 min，取出75 μL 上清于2 mL 進(jìn)樣瓶，每個樣本各取10 μL 混合成QC 樣本，取75 μL 上機(jī)檢測。

超高效液相色譜儀（1290-UHPLC，Agilent）、色譜柱（acquity UPLC BEH amide 1.7 μm 2.1×100 mm，Waters）的控制按照下列的流動相參數(shù)進(jìn)行分析，經(jīng)色譜條件優(yōu)化，流動相A 為含25 mmol/L 氨水及25 mmol/L乙酸銨的水，B 為乙腈。梯度洗脫：0 min，95% B；0.5 min，95% B；7 min，65% B；8 min，40% B；9 min，40% B；9.1 min，95% B；12 min，95% B；體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

高分辨質(zhì)譜儀（Triple TOF-6600，AB Sciex）在軟件（Analyst TF-1.7，AB Sciex）控制下基于IDA 功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100 的分子離子進(jìn)行采集對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，15 張二級譜圖每50 ms。ESI 離子源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓（GS1）、輔助氣壓及氣簾氣壓分別為60 Psi、60 Psi 和35 Psi；溫度：600℃，噴霧電壓：5 000 V（正離子模式）或-4 000 V（負(fù)離子模式）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用ProteoWizard 軟件將質(zhì)譜原始轉(zhuǎn)成mzXML 格式；使用XCMS 做保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊，minfrac 設(shè)為0.5，cutoff設(shè)為0.6；同時使用R 程序包和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。以PCA 和OPLS-DA 進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，以變量投影重要度（Variable Importance in the Projection，VIP）大于1.0 且t檢驗(yàn)P＜0.05 且物質(zhì)二級匹配的打分（MS2 score）大于0.9 為篩選條件，結(jié)合文獻(xiàn)和代謝物數(shù)據(jù)庫HMDB、PubChem、KEGG 進(jìn)行檢索，確定相關(guān)代謝差異物。

組別之間差異代謝物的定量值，計(jì)算歐式距離矩陣（Euclidean distance matrix），構(gòu)建熱力圖，以完全連鎖方法進(jìn)行聚類。將初步篩選的血漿中銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)差異代謝物分別輸入MetaboAnalyst 數(shù)據(jù)庫（https://www.metaboanalyst.ca）構(gòu)建相關(guān)代謝通路，根據(jù)通路富集路徑拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選通路拓?fù)浞治龅玫降挠绊懸蜃樱≒athway impact）大于0.1 為潛在的靶標(biāo)路徑。

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿樣本的主成分分析 脾虛模型組與對照組血漿樣本PCA 結(jié)果如圖1 所示，正離子模式時模型對X 變量的解釋性（R2X）=0.657，負(fù)離子模式R2X=0.746，表明模型具有較高可靠性和預(yù)測能力。對照組和脾虛模型組的散點(diǎn)完全分開，且各自在一定范圍內(nèi)聚集，說明用利血平造模后，脾虛證大鼠的生理代謝環(huán)境受到明顯干擾，偏離正常大鼠生理代謝途徑。

圖1 各組血漿樣本PCA 得分圖

各組血漿樣本及QC 樣本PCA 結(jié)果如圖2 所示，模型評價信息正離子模式R2X=0.625，負(fù)離子模式R2X=0.690，表明模型可靠性和預(yù)測能力較高。不同模式下各組間散點(diǎn)均有不同程度的分離，組內(nèi)在一定范圍緊湊聚集。四君子湯組和銀杏葉復(fù)方組散點(diǎn)均向?qū)φ战M散點(diǎn)靠近，且銀杏葉復(fù)方組更緊湊聚集，比四君子湯組更靠近對照組，說明四君子湯和銀杏葉復(fù)方均能有效干預(yù)脾虛證大鼠的代謝過程。

2.2 血漿樣本的正交偏最小二乘判別分析 為篩選得到由組間差異而形成的潛在標(biāo)記物，減少干擾因素對相似性聚類分析的影響，在脾虛證模型基礎(chǔ)上，使用有監(jiān)督的模式識別方法OPLS-DA 進(jìn)一步區(qū)分銀杏葉復(fù)方組與脾虛模型組的血漿代謝模式的變化。脾虛模型組對對照組、脾虛模型組對銀杏葉復(fù)方組血漿樣本OPLS-DA 結(jié)果如圖3 所示，樣本均處于95%置信區(qū)間內(nèi)，區(qū)分顯著。OPLS-DA 模型評價信息，脾虛模型組對對照組：正離子模式R2X=0.488，R2Y=0.996，Q2=0.927，負(fù)離子模式R2X=0.609，R2Y=0.993，Q2=0.953；脾虛模型組對銀杏葉復(fù)方組：正離子模式R2X=0.401，R2Y=0.991，Q2=0.441，負(fù)離子模式R2X=0.399，R2Y=0.985，Q2=0.572，表明該模型穩(wěn)定，預(yù)測良好。

圖2 各組血漿樣本及QC 樣本PCA 得分圖

2.3 差異代謝物的篩選 大鼠血漿中銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)代謝差異物篩選結(jié)果如表1 所示，正離子模式下14 種物質(zhì)，負(fù)離子模式下15 種物質(zhì)，主要是多巴胺、L-脯氨酸、羥脯氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、花生四烯酸等。

由表2 可知，與對照組相比，脾虛模型組中含量降低的相關(guān)差異代謝物質(zhì)主要有甜菜堿、磷酸膽堿、棕櫚酰溶血卵磷脂等（P＜0.01）及脯氨酸、4-硝基苯酚等（P＜0.05），升高的物質(zhì)主要有犬尿酸、?；侨パ跄懰帷⑶柿字╠18:1/18:0）等（P＜0.01）及胞嘧啶、多巴胺、L-犬尿酸等（P＜0.05）。與脾虛模型組相比，在四君子湯組中含量下調(diào)的相關(guān)差異代謝物質(zhì)主要有胞嘧啶、2'-脫氧尿苷等（P＜0.01）及多巴胺、犬尿酸、脫氧胞苷等（P＜0.05），上調(diào)的物質(zhì)主要有十三烷酸等（P＜0.05）。與脾虛模型組相比，在銀杏葉復(fù)方組中含量下調(diào)的相關(guān)差異代謝物質(zhì)主要有胞嘧啶、多巴胺、犬尿酸等（P＜0.01）及?；侨パ跄懰?、D-鳥氨酸等（P＜0.05），上調(diào)的物質(zhì)主要有甜菜堿、棕櫚酰溶血卵磷脂等（P＜0.05）。

圖3 各組血漿樣本OPLS-DA 得分圖

2.4 銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證差異代謝物相關(guān)性分析 血漿中銀杏葉復(fù)方干預(yù)大鼠脾虛證差異代謝物相關(guān)性分析結(jié)果見圖4。在相關(guān)性分析圖中最小分支下的物質(zhì)相關(guān)性最強(qiáng)，即一個物質(zhì)含量升高，則與之正或負(fù)相關(guān)性強(qiáng)的物質(zhì)會隨之升高或降低，反之亦然。結(jié)合表2 可以看出，銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證的差異代謝物有較大相關(guān)性，其中，胞嘧啶與脫氧胞苷、多巴胺與L-犬尿酸、順-9-棕櫚油酸與二高-γ-亞麻酸、L-哌啶酸與景天庚酮糖的正相關(guān)性極強(qiáng)，甜菜堿與鞘磷酸（d18:1/18:0）、鞘磷酸（d18:1/18:0）與棕櫚酰溶血卵磷脂、磷酸膽堿與鵝脫氧膽酰?；撬?、纈氨酸與磷酸膽堿負(fù)相關(guān)性極強(qiáng)。

2.5 銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證差異代謝物的層次聚類分析銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)差異代謝物熱力圖如圖5 所示。樣本的聚類結(jié)果表明，對照組、脾虛模型組、四君子湯、銀杏葉復(fù)方組樣本聚類明顯，模型穩(wěn)定。29 種差異代謝物能夠?qū)⒏鹘M區(qū)分，銀杏葉復(fù)方組顏色比四君子湯組顏色更接近于對照組，說明銀杏葉復(fù)方較四君子湯更能有效干預(yù)大鼠脾虛證，進(jìn)一步佐證了PCA 結(jié)果。

2.6 銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)代謝通路分析 銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)代謝通路如圖6 所示、相關(guān)代謝通路分析見表3。由圖6、表3 可知，銀杏葉復(fù)方干預(yù)大鼠脾虛證主要與酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、纈氨酸和亮氨酸及異亮氨酸生物合成、花生四烯酸代謝4條代謝通路有關(guān)。

3 討 論

脾主運(yùn)化水谷精微，胃主腐熟水谷，如脾胃受病，則飲食入胃，水谷不化，精微不布，合污而下，致成腹瀉，中獸醫(yī)辨證多屬脾虛證。通過代謝組學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證會導(dǎo)致動物機(jī)體多種代謝紊亂。如鄒忠杰等[12]對利血平所致的大鼠脾虛證研究發(fā)現(xiàn)，脾虛導(dǎo)致大鼠機(jī)體糖代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和氨代謝發(fā)生異常；楊澤民等[13]研究發(fā)現(xiàn)脾虛證患者在脂類、蛋白質(zhì)、糖類和核酸代謝方面存在明顯異常。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥對脾虛證有較好的療效，運(yùn)用現(xiàn)代藥理學(xué)方法也逐步揭示了中醫(yī)藥物的作用機(jī)理。劉阿娜等[14]研究發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷組分通過糾正脂肪代謝紊亂、腸道功能失調(diào)等一系列代謝紊亂從而發(fā)揮其健脾、利水的功效；黃張杰等[15]研究表明補(bǔ)中益氣湯對脾虛證大鼠的氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和能量代謝水平具有恢復(fù)調(diào)節(jié)作用。本研究表明銀杏葉復(fù)方較四君子湯更能有效干預(yù)脾虛證，主要通過參與氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝來干預(yù)脾虛證。

表1 正、負(fù)離子模式下血漿中銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)差異代謝物

3.1 氨基酸代謝 參與酪氨酸代謝的多巴胺是銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證的顯著差異代謝物。多巴胺是機(jī)體重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，是聯(lián)接神經(jīng)和免疫的重要分子，調(diào)節(jié)機(jī)體正常免疫反應(yīng)，如免疫細(xì)胞的活化、黏附、增殖、細(xì)胞毒以及細(xì)胞因子的分泌等[16-17]。本試驗(yàn)中脾虛模型組大鼠的血漿多巴胺含量顯著高于對照組，說明脾虛證大鼠免疫網(wǎng)絡(luò)紊亂，與課題組前期研究結(jié)果一致[18]，而PCA 得分圖證實(shí)四君子湯和銀杏葉復(fù)方有回調(diào)作用。

精氨酸和脯氨酸代謝通路的差異代謝物是羥脯氨酸和脯氨酸，羥脯氨酸是膠原蛋白生物合成中脯氨酸被羥基化修飾的氨基酸，主要存在于結(jié)締組織蛋白、膠原蛋白中，其羥基基團(tuán)用于維持膠原纖維的穩(wěn)定[19]。脯氨酸在蛋白合成、機(jī)體新陳代謝、傷口愈合、抗氧化反應(yīng)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[20]，代謝產(chǎn)生電子，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧，阻斷細(xì)胞周期、自噬和凋亡[21]。另外，脯氨酸可通過轉(zhuǎn)氨作用生成α-酮戊二酸，參與三羧酸循環(huán)供能。本試驗(yàn)中脾虛模型組大鼠脯氨酸含量顯著低于對照組，而四君子湯組和銀杏葉復(fù)方組的脯氨酸含量較對照組有所增加，說明銀杏葉復(fù)方對脾虛證大鼠的脯氨酸和羥脯氨酸有回調(diào)作用。

參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝通路的差異代謝物為L-異亮氨酸和纈氨酸、纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸統(tǒng)稱為支鏈氨基酸。支鏈氨基酸可促進(jìn)合成其他氨基酸，增加蛋白質(zhì)合成，降低蛋白質(zhì)分解，同時增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能，對畜禽生產(chǎn)具有重要意義[22]。荊園園等[23]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟纈氨酸和α-酮異戊酸等代謝物可能在改善低蛋白日糧造成仔豬生長受限過程中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)中脾虛模型組血漿中L-異亮氨酸和纈氨酸含量極顯著高于對照組，而銀杏葉復(fù)方組極顯著低于脾虛模型組，四君子湯組相比于脾虛模型組也有所減少，表明銀杏葉復(fù)方比四君子湯更能有效糾正脾虛證大鼠纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成的代謝通路異常。

表2 正、負(fù)離子模式下各組血漿中銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)差異代謝物含量（峰面積）

圖4 正、負(fù)離子模式下銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)差異代謝物相關(guān)性分析

圖5 正、負(fù)離子模式下銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)差異代謝物熱力圖

圖6 正、負(fù)離子模式下銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)代謝通路氣泡圖

表3 銀杏葉復(fù)方干預(yù)脾虛證相關(guān)代謝通路分析（Impact＞0.1）

3.2 脂質(zhì)代謝 花生四烯酸是全順式5，8，11，14-二十碳四烯酸，是一種在生物體內(nèi)含量較高，分布最廣的多不飽和必需脂肪酸，其代謝產(chǎn)物是多種疾病的生物標(biāo)志物，主要參與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞信號傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、造血和舒張血管等，主要代謝產(chǎn)物有前列腺素（PG）、血栓素（TX）、白三烯（LT）或羥基脂肪酸（OHFA），發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用[24-25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，脾虛模型組大鼠血漿中花生四烯酸含量極顯著低于對照組，四君子湯組和銀杏葉復(fù)方組較脾虛模型組均有所增高，說明脾虛證大鼠脂質(zhì)代謝發(fā)生了紊亂，這與前人的研究結(jié)果一致，如劉小溪等[26]對脾虛證代謝綜合征大鼠血清蛋白組學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其存在體內(nèi)免疫系統(tǒng)、糖類、脂類代謝紊亂；賈連群等[27]應(yīng)用LC-MS技術(shù)研究脾氣虛、脾陽虛大鼠血清代謝物譜群變化特征，發(fā)現(xiàn)2 個脾虛組血清中花生四烯酸、亞麻酸、十二碳烯酸含量較正常組顯著下降，脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂。以上結(jié)果說明銀杏葉復(fù)方和四君子湯對脾虛證大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂均有調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，銀杏葉復(fù)方干預(yù)大鼠脾虛證的相關(guān)差異代謝物主要為多巴胺、L-脯氨酸、羥脯氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、花生四烯酸等，主要通過酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、纈氨酸和亮氨酸及異亮氨酸生物合成、花生四烯酸代謝干預(yù)脾虛證。