白背葉楤木根皮中總黃酮提取工藝

張新軍，張明強，包劉媛，馬仲煉

（昭通學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000）

白背葉楤木（Aralia chinensis L.var.nuda Nakai），為五加科楤木屬楤木(Aralia chinensis)的原變種植物，楤木屬植物全世界共有40 余種，主要分布在亞洲，少量產(chǎn)于北美洲，我國的楤木屬植物資源極其豐富，多達(dá)30 余種，主要分布在云南、貴州、四川、遼寧、湖北、河北、廣東、安徽、江西等省[1]，其中白背葉楤木在云南昭通的大關(guān)、彝良、永善、威信等縣有野生，同時也有大量人工種植，在春季3-5月和冬季反季生產(chǎn)中，由頂芽萌發(fā)形成的鮮嫩芽苞，即為刺老苞，是珍貴的野生木本蔬菜[2-3]。

近年來，研究人員從楤木屬植物中分離出多糖、有機酸、黃酮類、香豆素、木脂素、苯丙烯類、木質(zhì)素、生物堿、揮發(fā)油、芳香化合物等數(shù)百種單體化合物，另外還有許多微量元素及其它無機礦物質(zhì)元素[4-5]?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明：黃酮對人體的生物代謝活動具有密切的關(guān)系，具有抗氧化、降低膽固醇、改善血液循環(huán)等多種功能[6]。學(xué)者已從長白楤木、刺老苞、龍牙楤木等楤木屬植物中提取出總黃酮并開展了藥理方面的研究[7-12]。然而白背葉楤木相關(guān)方面的研究未見報道，故本文以白背葉楤木根皮為材料，測定總黃酮含量及優(yōu)化提取工藝，旨在為白背葉楤木資源合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與儀器

1.1 材料與試劑

白背葉楤木試驗材料于2019年5月，取自于云南省昭通市昭陽區(qū)蘇家院騾馬河水庫旁密林中。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（（中國藥品生物制品鑒定所，批號：100080-201811）；無水三氯化鋁、95%乙醇、99.97%無水乙醇等，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）、UV759 紫外可見分光光度儀（上海奧譜勒儀器有限公司）、粉碎機、真空抽濾機（SHZ-D（Ⅲ））、博訊電熱鼓風(fēng)干燥箱、水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、容量瓶、圓底燒瓶、抽濾瓶、冷凝管、移液槍（力辰科技）、移液管、玻璃棒、漏斗等。

2 方法

2.1 樣品選擇與處理

用自來水將白背葉楤木根洗凈，剝下根皮→切成小片段（1-3 cm）→在108℃下殺青1 h →85℃下烘24 h →粉碎機粉碎1-2 min →精確稱取原料粉末→倒入圓底燒瓶中→加入對應(yīng)濃度的乙醇溶液→水浴加熱回流濃縮提取→過濾→樣品處理溶液（裝瓶標(biāo)記待用）。

2.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的制備定

準(zhǔn)確稱取0.0100 g 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇超聲溶解5 min，并定容至50 mL 的容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，裝入棕色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 線性關(guān)系考察與黃酮得率計算

2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別移取質(zhì)量濃度0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、2 mL、2.25 mL、2.5 mL 于25 mL 容量瓶中，各加入l0%的AlCl3溶液1 mL，50%的乙醇溶液定容，搖勻，避光顯色30 min 后，于360 nm 波長下測定吸收值，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）。結(jié)果以吸光度A 對濃度C 作最小二乘法回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.1207X-0.002，R2=0.9994，線性范圍為0.0000～2.5000 mg/L。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 白背葉楤木根皮中的總黃酮得率計算

按上述2.1 的試驗方法進(jìn)行操作，得到樣品溶液后，各加入l0%的AlCl3溶液1 mL，分別加0%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液定容，搖勻，避光顯色30 min 后于紫外分光光度計中測定其吸光度，按下列的公式計得算出楤木根皮中的總黃酮得率：

式中C 為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算所得的總黃酮質(zhì)量濃度（mg/L），V 為反應(yīng)體系總體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，M 為樣品質(zhì)量（mg）。

2.4 穩(wěn)定性試驗

按上述2.1 的試驗方法進(jìn)行操作，提取得樣品處理液；精確吸取2 mL 的樣品處理液于25 mL 容量瓶中，加入10%AlCl3溶液1 mL，用50%的乙醇定容至刻度線，于室溫條件下每隔10 min 測定一次吸光值，分析RSD 值。

2.5 精密度試驗

按上述2.1 的試驗方法進(jìn)行操作，提取得到一定濃度的樣品溶液6 份，各加入10%AlCl3溶液1 mL，用對應(yīng)濃度的乙醇定容至刻度線處并充分搖勻，連續(xù)測定6 次其吸光度，然后分析數(shù)據(jù)的RSD 值。

2.6 加樣回收率試驗

按上述2.1 的試驗方法進(jìn)行操作，得到一定濃度的樣品處理液，然后精確吸取已知總黃酮含量的樣品溶液6 份，分別加入質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和10% 的AlCl3溶液，避光顯色30 min 后；按上述操作方法在紫外分光光度計中測定其吸光度，然后依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出總黃酮含量，最后根據(jù)加樣回收公式計算出其回收率。

3 試驗結(jié)果與分析

3.1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

按2.4 試驗方法得出，供試品溶液完全顯色的最佳時間為30 min，且在4 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，其RSD等于2.06%，如表1所示，說明此試驗方法具有較好的可行性。

表1 穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)

3.2 精密度試驗結(jié)果

通過精密度試驗得其RSD 值等于0.21%（n=6），表明該儀器精密度良好，測出的數(shù)據(jù)可靠性較好，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗

3.3 加樣回收率試驗結(jié)果

在完成加樣回收試驗操作步驟后，進(jìn)行吸光度測定，并依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出其總黃酮含量，然后根據(jù)回收率公式計算出加樣回收率，RSD值為0.14%，由此可知，本方法具有良好的加樣回收效果，如表3所示。

表3 加樣回收率

3.4 單因素試驗結(jié)果分析

3.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取效果的影響

當(dāng)液料比50∶1（mL/g）、提取溫度為70℃、提取時間30 min，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，白背葉楤木總黃酮提取率呈先增后減的變化趨勢，其中50%乙醇溶液提取率最高，提取率為1.12%，而濃度為95%的乙醇提取效果最差，提取率僅為0.75%。產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能是由于楤木根皮中的其他成分比黃酮類化合物更易溶于95%的乙醇溶液中，影響了黃酮類化合物的溶出，結(jié)果見表4。

表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取效果的影響

3.4.2 液料比對總黃酮提取效果的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度為70℃、提取時間30 min，由表5 可得：隨著液料比的增加，其黃酮提取率呈先增后減的變化趨勢；當(dāng)料液比為1∶90 g/mL 時，其提取率最佳，為1.19%；原因可能是，當(dāng)楤木根提取液中的料液比為1∶90 g/mL時，總黃酮得率已接近飽和。所以，再增大其料液比，提取率也無明顯變化，還可能會導(dǎo)致其它成分的大量溶出，對目標(biāo)物的溶出造成不利的影響。故以下單因素試驗中的料液比均選擇1∶90 g/mL。

表5 液料比對總黃酮提取效果的影響

3.4.3 提取溫度對總黃酮提取效果的影響

為探究不同溫度對白背葉楤木根皮中總黃酮提取率的影響，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為90∶1（mL/g），提取時間為30 min，設(shè)置了5 個不同溫度，結(jié)果如表6所示。

表6 不同提取溫度對總黃酮提取效果的影響

由表6 可知，隨著提取溫度的不斷增加，總黃酮提取率也呈不斷遞增的趨勢，當(dāng)提取溫度為97.8℃時，提取率最大，為1.45%。原因可能是隨著溫度不斷升高，溶液越接近沸點，故使其溶質(zhì)與溶劑的接觸就更充分，溶劑的滲透作用也越強，相關(guān)溶質(zhì)的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞度越強，所以提取效果也就越好。

3.4.4 提取時間對總黃酮提取效果的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為90∶1（mL/g），提取溫度為97.8℃，觀察提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如表7所示，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率呈先增后穩(wěn)的變化趨勢。當(dāng)提取時間為240 min 時，其黃酮的提取率就達(dá)到了最大，為1.67%。

表7 不同提取時間對總黃酮提取效果的影響

3.5 提取白背葉楤木根皮中總黃酮的正交試驗

由單因素試驗所得出的最佳試驗條件，進(jìn)行L9,34正交試驗，因素水平表設(shè)計如表8所示。

表8 正交試驗因素水平表

正交試驗（L9,34）結(jié)果如表，在影響總黃酮提取率的4 個因素中，溫度影響最大，其余三個因素對總黃酮提取率的影響大小依次為：液料比＞乙醇濃度＞提取時間。提取總黃酮的最佳工藝參數(shù)組合為A1B3C3D3，即：乙醇濃度40%、液料比1∶100 g/mL、提取溫度97.8℃、提取時間3.5 h，在這個最佳試驗條件下，測得總黃酮提取率為1.86%。

表9 白背葉楤木根皮中總黃酮提取的正交試驗結(jié)果表

4 結(jié)論

白背葉楤木為五加科楤木屬的珍貴木本蔬菜，在昭通分布廣泛，其春季嫩莖葉稱為刺老苞，為餐桌上的高等鮮蔬，深受老百姓喜愛，同時，白背葉楤木根皮具有較高的藥用價值。其同屬長白楤木、遼東楤木、云南楤木根莖葉中均含有豐富的黃酮類物質(zhì)，而作為高原特色藥食兼用植物白背葉楤木未見相關(guān)報道，本實驗以白背葉楤木根皮為材料，分別研究乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素對總黃酮得率的影響，在單因素研究基礎(chǔ)上，通過正交實驗確定了黃酮的最佳提取條件組合。結(jié)果表明各因素對白背葉楤木根皮中總黃酮提取率的影響程度有差異，影響最大的是提取溫度，其次是液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間，最佳提取條件組合為乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、液料比1∶100 g/mL、提取溫度97.8℃、提取時間3.5 h，在這個最佳實驗條件下，黃酮提取率最高為1.86%。