野生昭通獼猴桃中維生素C的提取及含量測(cè)定

程立君，王世敏，田 虹，賈臣?jí)?，劉健?/p>

（昭通學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000）

昭通獼猴桃（Actinidia rubus Levl.）屬獼猴桃科（Antinidiacese）獼猴桃屬（Actinidia），一種漿果類藤本植物，又名藤梨、奇異果等，《本草綱目》中記載：“其形如梨，其色如桃，而獼猴喜食，故有諸名”[1]。獼猴桃的口感好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受人們的歡迎，其中維生素C（VC）的含量普遍高于一般的水果，享有 “世界珍果”之稱。VC 又名抗壞血酸，一種含6 個(gè)碳原子的酸性多羥基化合物，是無(wú)色無(wú)味的片狀晶體，易溶于水[2]。它是人體所需要的不可或缺的一部分，是維持人體機(jī)能的一種重要的維生素[3]，缺乏VC 會(huì)導(dǎo)致多種病癥的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致壞血病、心臟及脾臟損傷等疾病[4]。

昭通市氣候適宜獼猴桃的生長(zhǎng)，野生獼猴桃資源豐富，其中昭通獼猴桃分布較廣，果實(shí)酸甜可口，果肉營(yíng)養(yǎng)豐富[2]，開發(fā)利用前景較好，但目前開發(fā)利用程度較低。本研究對(duì)野生昭通獼猴桃中VC 超聲提取的方法進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定，以期為將來(lái)的研究開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

野生獼猴桃2019年10月采集于昭通市昭陽(yáng)區(qū)盤河鄉(xiāng)。

1.2 試劑

鉬酸銨、草酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、抗壞血酸、偏磷酸、醋酸、苯酚、無(wú)水乙醇、濃硫酸、95%乙醇、葡萄糖等均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

AX224ZH/E型電子天平（奧豪儀器有限公司）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UV-2450（日本島津有限公司）、UV759 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）、Km-1030C 型超聲波清洗機(jī)（廣州科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、HL/T20MM 型立式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器有限公司）、BCD-470WDPG 型冰箱（青島海爾股份有限公司）、RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、HH.S21-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、202-0 型臺(tái)式干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），LGJ-10D 型真空冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的提取流程

VC 的提取工藝流程如下：昭通獼猴桃→去皮→研磨→超聲提取→過(guò)濾→得待測(cè)液。

稱取3.0000 g 去皮獼猴桃置于研缽中，加入10 mL 草酸（0.05 mol/L）-EDTA（0.15 mol/L）溶液和10 mL 水充分研磨后，超聲提取后定容至250 mL，搖勻后過(guò)濾，加入少許活性炭吸附色素后再次過(guò)濾，即得提取液。

2.2 VC 含量的測(cè)定

VC 含量測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法，參照柳青等人[5]的方法進(jìn)行。以VC 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光值為縱坐標(biāo)（Y）建立多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）的線性回歸方程為y = 0.016x - 0.002，R2=0.9990，VC 對(duì)照品質(zhì)量濃度的線性范圍為0 ～14 μg/mL，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品中VC 濃度，依據(jù)公式（1）計(jì)算樣品中還原型VC 含量。

圖1 705 nm 下VC 標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中：W—還原型VC 含量（mg/100 g）；C—待測(cè)液中還原型VC 的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1：提取液總體積（mL）；V2：測(cè)定時(shí)樣品體積（mL）；M—獼猴桃樣品重量，g。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)VC 提取量的影響

分別設(shè)置料液比（m:v）為1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30、1∶36 g/mL 六個(gè)梯度，按2.1 的方法，在30℃下超聲提取30 min 后過(guò)濾，濾液按2.2 方法測(cè)定VC 含量，每組設(shè)3 次重復(fù)。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)VC 提取量的影響

在篩選得到的最佳料液比基礎(chǔ)上，分別設(shè)置提取時(shí)間5、10、15、20、25、30 min 六個(gè)梯度，按2.1 的方法，在30℃下超聲提取后過(guò)濾，濾液按2.2 方法測(cè)定VC 含量，每組設(shè)3 次重復(fù)。

2.3.3 提取溫度對(duì)VC 提取量的影響

在篩選得到的最佳料液比和提取時(shí)間基礎(chǔ)上，分別設(shè)置提取溫度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃六個(gè)梯度，按2.1 的方法，超聲提取后過(guò)濾，濾液按2.2 方法測(cè)定VC 含量，每組設(shè)3 次重復(fù)。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），以料液比A、提取時(shí)間B、提取溫度C 為自變量，以野生昭通獼猴桃中VC 含量為響應(yīng)值（Y），進(jìn)一步優(yōu)化昭通獼猴桃VC 的提取，每組設(shè)3 次重復(fù)。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平表

3.結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1.1 不同料液比對(duì)VC 提取量的影響

不同料液比對(duì)野生昭通獼猴桃VC 提取量的影響見(jiàn)圖2。由圖2 可知，不同料液比條件下，昭通獼猴桃中VC 的提取量之間存在顯著差異（F=121.5429，P＜0.01）。隨著料液比的升高提取量隨之增加，當(dāng)料液比為1∶24 時(shí)，VC 提取量達(dá)到最高（121.66 mg/100 g），之后料液比繼續(xù)升高，VC提取量略有下降，表明提取的最佳料液比1∶24。

圖2 料液比對(duì)VC 提取量的影響

3.1.2 不同提取時(shí)間對(duì)VC 提取量的影響

不同提取時(shí)間對(duì)野生昭通獼猴桃VC 提取量的影響見(jiàn)圖3。由圖3 可知，提取時(shí)間對(duì)昭通獼猴桃中VC 的提取量有顯著影響，方差分析結(jié)果顯示F=148.6085，P＜0.01。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)VC 提取量逐漸上升，超聲提取25 min 時(shí)，VC 提取量達(dá)到最高（125.06 mg/100 g），之后維持穩(wěn)定。

圖3 提取時(shí)間對(duì)VC 提取量的影響

3..1.3 不同提取溫度對(duì)VC 提取量的影響

不同提取溫度對(duì)野生昭通獼猴桃VC 提取量的影響見(jiàn)圖4。由圖4 可知，不同提取溫度條件下，昭通獼猴桃中VC 的提取量之間存在顯著差異（F=580.9722，P＜0.01）。VC 提取量隨著提取溫度的上升出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度20℃時(shí)提取量最低，為114.42 mg/100 g；提取溫度在30℃時(shí)，VC 提取量達(dá)到最高（130.13 mg/100 g），可能是因?yàn)槌曁崛r(shí)低溫下VC 浸出率較低，但溫度過(guò)高VC 又容易出現(xiàn)氧化。

圖4 提取溫度對(duì)VC 提取量的影響

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基于單因素篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）3 個(gè)因素為響應(yīng)面變量，以昭通獼猴桃中VC 提取量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken 軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 回歸模型的建立及方差分析

對(duì)表2 中響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到野生昭通獼猴桃中VC 提取量與料液比、提取時(shí)間、提取溫度之間的多元回歸方程為：Y=139.82-0.77A-8.85B+0.99C-2.78AB-2.01AC-7.96BC-21.37A2-11.40B2-14.88C2。該模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果

由表3 可知， 該模型的F 值為11.38，P=0.0021（P＜0.01），表明回歸方程模型是可靠的；決定系數(shù)R2為0.9360，表明模型可以解釋93.60%的總體變異情況，回歸模型相關(guān)性較高。根據(jù)回歸方程的方差分析結(jié)果可知，該模型一次項(xiàng)B 變量的P=0.0077＜0.01，A 變量和C 變量的P 值分別為0.7588 和0.6931，均大于0.05，表明超聲提取時(shí)間對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量有極顯著影響，而料液比和提取溫度對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響不顯著，各因素對(duì)VC 提取量的影響順序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞料液比。交互項(xiàng)AB、AC 的P值分別為0.4391 和0.5722，均大于0.05，表明對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響不顯著；BC 項(xiàng)的P 值為0.0431，小于0.05，表明對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響顯著。二次項(xiàng)A2、B2、C2的P 值分別為0.0003、0.0107、0.0028，表明三者對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量均具有顯著影響。

3.2.3 交互作用分析

兩因素之間交互作用對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響見(jiàn)圖5。曲面中相同VC 含量所對(duì)應(yīng)的各因素值在底面上形成曲線，即為等高線圖。等高線的形狀可以清晰地反映出兩因素交互作用對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量影響的強(qiáng)弱。等高線越接近圓形，說(shuō)明交互作用對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響越弱；等高線越是接近橢圓形，說(shuō)明交互作用對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響越強(qiáng)；在等高線的中心處附近有極值條件的存在。從圖5（a）可以看出，當(dāng)料液比值保持不變時(shí)，昭通獼猴桃中VC 的提取量隨著提取時(shí)間的上升而增大，曲面的斜率較大；當(dāng)提取時(shí)間穩(wěn)居不變時(shí)，隨著液料比值的增大，VC 的提取量曲面斜率較小，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)昭通獼猴桃中維生素C 提取量的影響較為顯著。從圖5（b）可以看出液料比值與提取溫度交互作用形成的曲面較平緩，說(shuō)明其交互作用對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響不顯著。由圖5（c）可以看出提取時(shí)間和提取溫度的交互作用形成的曲面較陡峭，說(shuō)明其交互作用對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)昭通獼猴桃中VC 提取量的影響

3.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Design Expert 軟件分析，在料液比為1∶24、提取時(shí)間22 min、提取溫度29℃的條件下，野生昭通獼猴桃中VC 提取量的預(yù)測(cè)值為141.65 mg/100 g。實(shí)際操作條件下，測(cè)得野生昭通獼猴桃中VC 的含量為139.85 mg/100 g，與理論值相差1.8 mg/100 g，實(shí)驗(yàn)值與理論預(yù)測(cè)值相差不大，證實(shí)了該模型在實(shí)際預(yù)測(cè)上的可用性，說(shuō)明野生昭通獼猴桃中VC 提取工藝條件就可以用響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化。

4.結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)昭通獼猴桃的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化來(lái)提高維生素C的提取量。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：料液比為1∶24 時(shí)，VC 提取量達(dá)到最高（121.66 mg/100 g）；超聲提取25 min 時(shí)，VC 提取量達(dá)到最高（125.06 mg/100 g）；當(dāng)提取溫度在30 ℃時(shí)，VC 提取量達(dá)到最高（130.13 mg/100 g）。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳工藝條件為：料液比為1∶24，提取時(shí)間為22 min，提取溫度為29℃，在此工藝條件下，維生素C 提取量達(dá)139.85 mg/100 g。張維等人對(duì)分布在湖南地區(qū)的26 個(gè)紅心獼猴桃品種中維生素C 測(cè)定結(jié)果顯示其平均含量為106.04 mg/100 g。[6]李躍紅等人對(duì)11 個(gè)不同產(chǎn)地的紅心獼猴桃中維生素 C 測(cè)定結(jié)果其顯示平均含量118.18 mg/100 g。[7]本實(shí)驗(yàn)采用的野生昭通獼猴桃中VC 含量高于兩者研究報(bào)道中的平均值，表明昭通獼猴桃具有較好的開發(fā)價(jià)值，本研究為野生昭通獼猴桃的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。