石墨烯基第三代電化學(xué)酶生物傳感器

張 玲, 陳紅壯, 陳 雪, 徐佳佳, 任志宇, 潘 凱, 張 謙

(1. 沈陽師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 沈陽 110034;2. 黑龍江大學(xué) 化工與材料學(xué)院, 哈爾濱 150080; 3. 遼寧大學(xué) 化學(xué)院, 沈陽 110036)

0 引 言

電化學(xué)酶生物傳感器是將酶反應(yīng)特異性與電化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)合起來的一種傳感器[1]。電化學(xué)酶生物傳感器具有成本低、易于使用、結(jié)構(gòu)簡單、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)不同的媒介體, 電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展歷史可分為三代。 在第一代生物傳感器中, 氧氣充當(dāng)酶和電極之間電子傳遞的中介[2]。 然而,第一代生物傳感器存在著應(yīng)用電勢過高、氧氣干擾、制備過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。 第二代生物傳感器借助電子媒介體進(jìn)行電子傳遞, 克服了第一代傳感器的一些缺點(diǎn), 如消除了對氧氣的依賴、顯著降低了應(yīng)用電位等。 然而,電子媒介體在促進(jìn)了電極和酶之間的電子轉(zhuǎn)移的同時(shí), 也促進(jìn)了各種干擾反應(yīng)[3]。 在第三代生物傳感器中,電子轉(zhuǎn)移可以直接在電極和氧化還原蛋白之間進(jìn)行[4]。 氧化還原蛋白本身作為電催化劑, 可促進(jìn)電極和底物分子之間的電子轉(zhuǎn)移,在這一過程中不涉及媒介體。 與基于媒介體的生物傳感器不同, 直接電子轉(zhuǎn)移使這種生物傳感器具有更好的傳感器性能, 主要表現(xiàn)在抗干擾性強(qiáng)、生物相容性好、靈敏度高、反應(yīng)體系簡單等方面。

近年來,在第三代生物傳感器的構(gòu)建方面,人們一直致力于開發(fā)通用、穩(wěn)定的、能夠保持蛋白質(zhì)活性的載體作為電極修飾材料以促進(jìn)氧化還原蛋白質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移。研究表明,碳納米材料具有導(dǎo)電性強(qiáng)、生物相容性好等特點(diǎn),是一種很有發(fā)展前景的蛋白質(zhì)載體材料。

相比于碳納米管等其他碳納米材料,石墨烯具有更優(yōu)越的電性能和更大的比表面積[5]。石墨烯不僅可以作為連接電極表面和酶的“連接臂”以實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移,還可以增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)的響應(yīng)。然而,石墨烯在水中分散度不足,疏水性較強(qiáng),容易形成不可逆的團(tuán)聚體[6],極大地限制了這一材料的應(yīng)用。因此,石墨烯的功能化成為生物傳感器開發(fā)中的關(guān)鍵一步。在適當(dāng)功能化的基礎(chǔ)上,將各種官能團(tuán)引入到石墨烯表面,不僅使石墨烯具有親水性和生物相容性,而且可以賦予石墨烯新的功能?；诖?本文將重點(diǎn)介紹幾種不同材料修飾的石墨烯基電化學(xué)酶生物傳感器。

1 不同材料修飾的石墨烯基電化學(xué)酶生物傳感器

1.1 有機(jī)分子修飾的石墨烯基酶生物傳感器

有機(jī)分子表面活性劑是分散石墨烯的常用穩(wěn)定劑。研究發(fā)現(xiàn),表面活性劑的疏水尾部可以通過疏水作用吸附在石墨烯表面,而親水頭則朝向水相。由于表面活性劑分子的吸附,改性石墨烯是穩(wěn)定的,通過靜電力互相排斥聚集,可以有效防止石墨烯的重新聚集。例如:2012年,Wen[7]利用表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與石墨烯制備了一種高靈敏度的一氧化氮(NO)生物傳感器。該生物傳感器的制備方法如圖1所示。該生物傳感器對NO的檢出限可達(dá)6.75×10-9M。

圖1 Hb-CS/GR-CTAB/GCE的組裝示意圖Fig.1 Scheme of the assembly process of Hb-CS/GR-CTAB/GCE

除了非共價(jià)方法,利用化學(xué)還原石墨烯或氧化石墨烯上存在的含氧官能團(tuán),通過共價(jià)修飾也可以將有機(jī)分子修飾到石墨烯上。例如:Zheng等[8]通過共價(jià)改性制備了3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)功能化石墨烯。其中,APTES既可作為石墨烯的分散劑,又可作為氣相色譜電極和石墨烯的胺類表面改性劑。以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)為交聯(lián)劑,將葡萄糖氧化酶(GOD)共價(jià)鍵合到石墨烯功能化電極上,制成GOD/APTES-graphene/GC電極。在商業(yè)人工血糖檢測的線性標(biāo)準(zhǔn)范圍1.4～27.9 mM內(nèi),進(jìn)一步驗(yàn)證了所開發(fā)的生物傳感器對血糖的檢測效果,它可作為糖尿病血糖監(jiān)測的理想選擇。同時(shí),該生物傳感器表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,當(dāng)生物傳感器在室溫下的干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存時(shí),前3周生物傳感器響應(yīng)信號(hào)沒有下降,后2周的信號(hào)只下降了12%。

1.2 聚合物修飾的石墨烯基酶生物傳感器

將聚合物與石墨烯復(fù)合,由于石墨烯可以在聚合物基體中形成導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò),因而復(fù)合材料會(huì)表現(xiàn)出較石墨烯更好的導(dǎo)電性能。不同的研究小組已經(jīng)用不同的聚合物對石墨烯進(jìn)行了表面修飾,以構(gòu)建第三代電化學(xué)酶生物傳感器[9-11]。

2019年,Zhang等[12]采用一步電沉積的方法制備了電化學(xué)還原氧化石墨烯-聚賴氨酸復(fù)合膜(ERGO-PLL)。以ERGO-PLL為載體,通過固載葡萄糖氧化酶(GOx)構(gòu)建了葡萄糖傳感器,并研究了其直接電子轉(zhuǎn)移性能和酶催化活性。循環(huán)伏安掃描結(jié)果表明,GOx表現(xiàn)出一對明確的可逆氧化還原峰,通過計(jì)算得到該傳感器的電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)為18.7 s-1,這表明固載于ERGO-PLL的GOx與底層電極之間成功實(shí)現(xiàn)了直接電子轉(zhuǎn)移。此外,該酶生物傳感器具有良好的電催化活性,線性檢測范圍為0.005～9.0 mM,檢出限為2.0 μM。

1.3 無機(jī)納米粒子修飾的石墨烯基酶生物傳感器

研究表明,將無機(jī)納米粒子與石墨烯復(fù)合制備得到的新型材料,可以協(xié)同加速固定化酶與電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移,降低電化學(xué)過程中的過電壓,進(jìn)一步提高石墨烯的電化學(xué)性能。各種無機(jī)納米粒子已被納入到石墨烯復(fù)合物的二維結(jié)構(gòu)中[13-15]。

2010年,Dey等[16]開發(fā)了以鉑納米粒子-石墨烯納米復(fù)合材料為電極材料固載膽固醇氧化酶(ChOx)和膽固醇酯酶(ChEt)的雙酶傳感器。該生物傳感器的制備方法如圖2所示,即采用H2PtCl6在水溶液中原位還原的方法,用鉑納米粒子修飾石墨烯納米片。結(jié)果表明,納米復(fù)合修飾電極能在0.4 V電位下有效催化H2O2電化學(xué)氧化,其正電位相對于Pt電極少100 mV以上。所制備的生物傳感器可以對膽固醇和膽固醇酯進(jìn)行線性響應(yīng),線性范圍寬,靈敏度高。

圖2 (a) 石墨烯納米片-Pt基生物傳感器對膽固醇酯進(jìn)行生物傳感的機(jī)理; (b) 鉑納米粒子修飾石墨烯納米片的FESEM圖像; (c) 膽固醇酯生物傳感器的安培響應(yīng)

1.4 生物分子修飾的石墨烯基酶生物傳感器

生物分子改性的石墨烯已經(jīng)作為電極材料用于構(gòu)建性能優(yōu)異的生物傳感器[17-18]。

2018年,Silva等[19]基于還原氧化石墨烯(rGO)和乙酰膽堿酯酶(AChE)開發(fā)了一種新型、靈敏的電化學(xué)生物傳感器,并成功應(yīng)用于食品樣品中農(nóng)藥胺甲萘的檢測。在最佳的微分脈沖伏安條件下,獲得了納米摩爾的檢出限,實(shí)現(xiàn)了番茄中胺甲萘的測定。實(shí)驗(yàn)表明,乙酰膽堿酯酶可以有效地固定在還原氧化石墨烯表面,這為農(nóng)藥分析提供了一種低成本的傳感器。

1.5 基于石墨烯碳納米管的酶生物傳感器

碳納米管(CNTs)和石墨烯作為一維和二維納米碳材料的代表,在結(jié)構(gòu)和性能上是互補(bǔ)的[20]。例如,化學(xué)還原的石墨烯通常導(dǎo)電率約為100～200 Sm-1,比導(dǎo)電的單壁CNTs(通常為1×104Sm-1)低2個(gè)數(shù)量級。近年來,通過一維碳納米管和二維石墨烯的結(jié)合設(shè)計(jì)的層次結(jié)構(gòu)復(fù)合材料在電化學(xué)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[21]。研究發(fā)現(xiàn),CNTs不僅可以有效地增加石墨烯的間距,防止納米片的不可逆團(tuán)聚,還可以彌補(bǔ)石墨烯與石墨烯之間的電子轉(zhuǎn)移缺陷,增加電解液與電極的接觸面積[22]。

2020年,Zou等[23]利用離子功能化石墨烯(G-IL)和CNTs制備了一種具有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料,開發(fā)了一種新型雙酶葡萄糖傳感器。其主要工作是通過氧化石墨烯的環(huán)氧基團(tuán)與離子液體的胺基發(fā)生親核開環(huán)反應(yīng),將正電荷引入石墨烯表面,使其表面形成正電荷層,靜電斥力使石墨烯層間間距增大,阻止石墨烯片團(tuán)聚,進(jìn)而將石墨烯成功剝離成單層,從而在水中具有極佳的分散性。G-IL與CNTs共混后,形成了三維結(jié)構(gòu),CNTs像導(dǎo)線一樣插入石墨烯薄片之間,進(jìn)一步提高了石墨烯的分散性和穩(wěn)定性。其中,石墨烯片為固定2種酶提供了較大的表面積,碳納米管顯著降低了電子轉(zhuǎn)移電阻。在固載葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶之后,該葡萄糖傳感器對葡萄糖顯示出良好的電催化活性,響應(yīng)范圍為0.004～5 mM,檢出限為3.99×10-7M。

1.6 雜原子摻雜石墨烯基酶生物傳感器

元素?fù)诫s是調(diào)整石墨烯本質(zhì)性質(zhì)的有效策略。研究表明,摻雜石墨烯可以調(diào)整石墨烯的電子性能[24-25]。以N摻雜石墨烯材料為例,氮摻雜石墨烯表現(xiàn)出與未摻雜石墨烯截然不同的電子性能。2010年,Wang等[26]首次構(gòu)建了一種氮摻雜石墨烯基電化學(xué)生物傳感器用于測定葡萄糖。其中,氮摻雜石墨烯是通過氮等離子體處理化學(xué)還原石墨烯而得到的,該方法具有簡單、快速、可調(diào)等特點(diǎn)。通過控制等離子體暴露時(shí)間,可以很容易在0.11%～1.35%調(diào)節(jié)氮摻雜率。制備的N摻雜石墨烯具有良好的電催化活性。在H2O2還原方面,與氣相色譜電極相比,N摻雜石墨烯電極在循環(huán)伏安圖中的還原峰正移400 mV,電流增強(qiáng)20倍。固載葡萄糖氧化酶(GOD)后,在N摻雜石墨烯-GOD電極上可以得到一對明確的、準(zhǔn)可逆的氧化還原峰,對應(yīng)于氧化還原酶的直接電化學(xué)反應(yīng)。由于N摻雜石墨烯的費(fèi)米勢發(fā)生了變化,且通過摻雜提高了電子轉(zhuǎn)移效率,因而N摻雜石墨烯基酶電極獲得的氧化還原峰電流遠(yuǎn)高于未摻雜石墨烯電極。由于N摻雜石墨烯具有良好的生物相容性和導(dǎo)電性,該生物傳感器表現(xiàn)出較高的靈敏度和選擇性,可用于濃度低至0.01 mM的葡萄糖的檢測。

2 結(jié) 論

用CTAB等有機(jī)分子、聚賴氨酸等聚合物、Pt等無機(jī)納米粒子、乙酰膽堿酯酶等生物分子、碳納米管等對石墨烯進(jìn)行修飾,或者通過氮等雜原子摻雜可以有效實(shí)現(xiàn)石墨烯的功能化。石墨烯功能化拓寬了石墨烯在第三代電化學(xué)酶生物傳感器中的應(yīng)用范圍,使得石墨烯基電化學(xué)生物傳感器在臨床診斷、衛(wèi)生保健檢測和環(huán)境監(jiān)測方面具有巨大的應(yīng)用前景。

致謝感謝沈陽師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目的支持。