葉面噴施過氧化氫對桑樹抗旱生理的影響

李 健，陳 英，李 琲，農艷豐

（百色學院，廣西百色 533000）

桑樹在中國資源豐富，種植廣泛，是養(yǎng)蠶的直接原料來源，種桑養(yǎng)蠶的農業(yè)生產方式在中國具有悠久的歷史[1-2]。作為一種重要的經濟作物，桑樹除具有清肺祛熱、明目抗菌的藥用價值外，還具有十分高的經濟價值[3-4]。廣西是全國最大的桑樹種植基地，近年來種桑養(yǎng)蠶已經成為廣西百色市貧困戶增收致富的重要產業(yè)，但百色桑蠶業(yè)因地理環(huán)境的特殊性，桑樹主要種植于沒有灌溉條件的山地及旱坡地上，干旱嚴重影響了桑樹的正常生長和發(fā)育，嚴重制約了桑蠶業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。因此，研發(fā)桑樹的抗旱栽培技術是保證百色桑蠶產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措。

干旱脅迫是造成全球作物產量損失的主要原因，降低了大多數(shù)主要作物的平均產量。與其他環(huán)境脅迫一樣，干旱脅迫的常見影響是氧化損傷。在干旱脅迫下，植物會生成并累積大量滲透調節(jié)物質來提高其體內的滲透壓以減少水分流失，維持體內水分代謝，減少干旱給植物帶來的傷害?？扇苄蕴?、可溶性蛋白等是植物體內重要的滲透調節(jié)物質。植物在受到干旱脅迫時，其體內的生理生化特性會發(fā)生一系列的變化來抵御干旱環(huán)境對自身造成的傷害，而外源調節(jié)物質能在一定程度上去彌補植物內源物質調節(jié)機制的缺陷，從而提高植物的耐脅迫能力。干旱會導致植物體內活性氧（ROS）的產生失去平衡，例如超氧化物（O2）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH）和單線態(tài)氧（O2）與其清除潛力[5]。ROS 過量產生是植物在生物和非生物脅迫條件下的普遍現(xiàn)象，可引起大分子和細胞結構的氧化損傷，導致植物生長發(fā)育受到抑制，甚至死亡。在所有ROS 中，H2O2作為應激信號轉導通路的核心參與者與對非生物和生物脅迫的耐受性相關，還能夠作為信號分子在植物對逆境的適應過程中發(fā)揮作用[6]。Guler 和Pehlivan[7]以盆栽大豆為材料，在施加干旱脅迫后，將1 mmol·L-1H2O2或蒸餾水噴灑到每株植物的葉子上，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫降低了葉水勢、相對水分含量和光合色素含量，但增強了脂質過氧化和內源性H2O2濃度。相比之下，外源性H2O2改善了干旱脅迫下的水分狀況、色素含量和脂質過氧化。與單獨的干旱處理相比，外源性H2O2降低了內源性H2O2濃度。在干旱期間，H2O2預處理誘導了所有抗氧化酶活性，其程度大于對照的葉片，表明低劑量H2O2預處理通過誘導抗氧化系統(tǒng)來減輕水分損失和H2O2含量并提高干旱脅迫耐受性。Terzi等發(fā)現(xiàn)外源H2O2預處理通過增加玉米幼苗中的可溶性糖、脯氨酸和多胺水平來誘導滲透脅迫耐受[8]。而干旱條件下噴施H2O2，可使萱草保持更高的葉片相對含水量和氣孔密度以及更低的葉片相對電導率和氣孔開度，使部分品種萱草的抗旱性得到了顯著提高[9]。此外，H2O2直接調節(jié)參與植物防御和相關途徑的眾多基因的表達，如抗氧化酶、防御蛋白和轉錄因子[10]。

目前關于H2O2在桑樹抗旱調控上的應用還未見報道，因此，本研究根據(jù)前人在其他植物上的相關研究基礎，對桑樹在苗期噴灑一定濃度的H2O2并進行干旱脅迫處理，測定抗旱相關的生理生化指標，旨在通過研究施用不同濃度的H2O2溶液對提高桑樹抗旱生理生化及生長特性的影響效應，為進一步提高桑樹的抗旱栽培技術、培育抗旱品種提供技術支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以桂桑優(yōu)12號實生苗（根部直徑0.5 cm，株高25 cm）為材料，所用過氧化氫為西隴化工產品（30%H2O2），試驗地點為百色學院校內試驗地。

1.2 試驗方法

將生長良好的桑苗移栽于盆中（每盆3 株），30 d后（此時桑苗高約60 cm，每株約12 片完全葉），挑選20 盆長勢較好且大小一致的植株，將其分成10 組（1組2盆）。一組用作正常澆水對照（CK）；剩下的材料分成三個處理（一個處理3組），其中兩個處理分別用兩種濃度的H2O2（用蒸餾水配置成1、2 mmol·L-1，分別為處理2、處理3）對桑苗葉片進行噴灑處理，另一個處理為正常干旱處理（噴施蒸餾水作為對照，為處理1），每天用小噴壺對葉片噴灑一次（以覆蓋全部葉片為準）。對三個處理下的桑苗進行2、4、6 d 的干旱脅迫。試驗分別于干旱2、4、6 d 后對各組處理進行采樣（取中上部完全葉片混合），測量其株高、葉綠素含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量等相關生長生理指標。最后一次取樣后恢復正常供水，7 d后測量復水后桑樹的株高。

1.3 生長及生理指標測定

1.3.1 株高增長率的測定

桑苗種植30 d 后，每處理隨機挑選3 株苗，測量其株高，取平均值。復水7 d 后測量其株高，取平均值，計算株高增長率。

1.3.2 生理指標的測定

葉片葉綠素含量的測定用丙酮乙醇（2∶1）浸提新鮮葉片的方法[11]，POD 活性的測定參考李小芳和張志良的方法[12]，可溶性糖和MDA含量的測定參考林艷等的方法[13]。每個處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 噴施H2O2對桑苗株高的影響

由表1 可見，干旱明顯抑制桑苗的正常生長，噴施H2O2有效緩解了干旱脅迫對桑樹植株生長的抑制作用，其中以1 mmol·L-1H2O2噴灑處理為最佳，復水7 d 后的株高相比干旱前增加了19.48%，2 mmol·L-1H2O2處理的株高增長率也達到18.99%。不噴施H2O2時，株高增長率僅有13.68%，顯著低于噴施H2O2的兩個處理。由此可見，噴灑1、2 mmol·L-1H2O2溶液均有效緩解了干旱對桑樹造成的傷害，從一定程度上有利于植株的正常生長。

表1 噴施H2O2對桑苗株高的影響

2.2 噴施H2O2對干旱脅迫下桑樹葉片葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用的最重要物質，可以將光能轉化為化學能然后將其儲存入植物體內的有機物中，為植物體的生長發(fā)育提供物質基礎。由圖1 可見，與CK 相比，干旱脅迫極大破壞了桑樹葉片的葉綠素，隨著干旱程度的加劇，桑樹葉片葉綠素含量也急劇減少。在干旱2 d 時，三個處理的葉綠素含量沒有顯著差異，但隨著干旱時間的延長，噴施H2O2的兩個處理的葉綠素含量顯著高于處理1（清水對照），其中以1 mmol·L-1H2O2的處理效果最佳，有效緩解了干旱對桑樹葉片葉綠素含量的影響，對于保持桑樹葉片的正常光合作用有較大的促進作用。

圖1 噴施H2O2對干旱脅迫下桑樹葉片葉綠素總含量的影響

2.3 噴施H2O2對干旱脅迫下桑樹葉片POD活性的影響

從圖2 可見，干旱脅迫下，桑樹葉片的POD 活性顯著升高，噴灑H2O2高于處理1（清水對照），在干旱2、4、6 d 時都是1 mmol·L-1H2O2處理下的桑樹葉片的POD 活性最高，且顯著高于噴施2 mmol·L-1H2O2的處理，三個處理都是在干旱脅迫4 d 時達到最高，到6 d時又開始回落。

圖2 噴施H2O2對干旱脅迫下桑樹葉片POD活性的影響

2.4 噴施H2O2 對干旱脅迫下桑樹葉片可溶性糖和MDA含量的影響

由圖3 可見，干旱脅迫促進了桑樹葉片可溶性糖的積累，在干旱4 d 時，三個處理葉片的可溶性糖含量達到最高，在干旱6 d 時又緩慢回落。H2O2的噴施顯著提高了干旱脅迫下桑樹葉片可溶性糖的累積，其中以2 mmol·L-1H2O2處理效果最佳，干旱2、4、6 d 時都是2 mmol·L-1H2O2處理下的桑樹葉片的可溶性糖含量最高，且顯著高于噴施1 mmol·L-1H2O2的處理。

圖3 噴施H2O2對干旱脅迫下桑樹葉片可溶性糖含量的影響

干旱脅迫會擾亂植物體內自由基產生與消除之間的相對平衡，且傾向于自由基的累積，從而引起細胞膜過氧化，脂質過氧化物進一步被分解為MDA[14]。由圖4 可見，干旱脅迫下，桑樹葉片大量積累MDA，顯著高于CK（正常澆水植株），三個處理葉片的MDA含量都隨著干旱時間的延長而升高，在干旱6 d 時達到最高，其中以處理1（清水對照）累積量最大，H2O2的噴施顯著減少了干旱脅迫下桑樹葉片MDA 的累積，且兩個噴施H2O2的處理效果均比較明顯，其中以1 mmol·L-1H2O2處理效果最佳。

圖4 噴施H2O2對干旱脅迫下桑樹葉片MDA含量的影響

3 討論

干旱脅迫下，植物的生長會受到不同程度的影響。干旱脅迫可造成桑樹植株供水不足，會嚴重影響到葉片和植株的生長。本試驗中，三個處理的桑樹在經歷了6 d 的干旱脅迫后，盡管恢復了正常供水，但是干旱脅迫造成的損傷依舊存在，其生長在短期內仍然受到較大影響，因此，復水后干旱處理的株高增長率顯著低于正常澆水的對照。但H2O2的施用可減少干旱造成的這種傷害，有利于維持干旱脅迫下桑樹植株的正常生長。從結果上來看，葉面噴施1 mmol·L-1和2 mmol·L-1H2O2的應用效果相當。

桑樹葉片較大，屬于喜光植物，葉片作為其光合作用的最主要器官，葉片內的葉綠素對增加光合反應能力起著重要作用。葉綠素是植物基本的色素之一，干旱脅迫會促使植物葉片的葉綠素濃度降低，導致葉片枯萎發(fā)黃，降低植物的生長速度并影響產量[15]。干旱脅迫下，植物葉片中的葉綠素含量高低可以反映出其光合作用能力的強弱，較高的葉綠素含量可以防止葉肉細胞過度脫水，保護細胞膜系統(tǒng)，以維持細胞內膜結構的穩(wěn)定性[16-17]。從本研究的結果可以看出，噴灑H2O2兩個處理葉片的葉綠素含量均顯著高于噴灑清水，其中較低濃度的H2O2（1 mmol·L-1）處理效果最佳，能調節(jié)干旱脅迫下其葉片細胞的滲透壓，有效緩解干旱對桑樹葉片葉綠素的破壞作用，對于提高桑樹的抗旱性，保持桑樹葉片的正常光合作用有較大的促進作用。

POD 是植物細胞防御系統(tǒng)的關鍵酶，在本研究中，桑樹葉片在干旱脅迫下POD 酶活性顯著升高，噴灑H2O2高于噴灑清水，其中以較低濃度的H2O2（1 mmol·L-1）處理下桑樹葉片的POD 活性最高。作為滲透調節(jié)物質，植物體內的可溶性糖含量會隨著滲透脅迫的加劇而不斷積累，以緩解滲透脅迫對植株的傷害。本研究中，在干旱4 d 時，三個處理葉片的可溶性糖含量達到最高，在干旱6 d 時又緩慢回落，但是H2O2的噴施顯著提高了干旱脅迫下桑樹葉片可溶性糖的累積，其中較高濃度的H2O2（2 mmol·L-1）處理效果最為顯著。MDA在植物組織中的積累也是ROS毒性作用影響的表現(xiàn)，并且可用于評估ROS 介導的植物損傷[18]。干旱脅迫下，三個處理葉片的MDA含量都隨著干旱時間的延長而逐漸升高，表明桑樹葉片的細胞膜受到了較大的損害，但是H2O2的噴施顯著減少了干旱脅迫下桑樹葉片MDA的累積，且兩個噴施H2O2的處理效果均比較明顯，但是更低濃度的H2O2（1 mmol·L-1）處理效果最佳。

4 小結

本試驗以H2O2作為外源物質，研究其對干旱脅迫下桑樹生長及生理生化的影響。試驗結果表明，干旱脅迫對桑苗的正常生長和生理生化代謝都造成了不利影響，外源H2O2的施用使桑樹葉片的葉綠素含量、可溶性糖及POD 酶活性都顯著高于噴灑清水的對照，并積累了更少的MDA，表明外源H2O2能有效地啟動桑樹的防御系統(tǒng)，從而減小干旱對其造成的傷害程度。綜合分析表明，1 mmol·L-1的H2O2是能在一定程度上增強桑樹的抗旱生理，緩解干旱脅迫對桑樹造成傷害的葉面噴施較適濃度。