角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)大鼠皮膚傷口局部血管化效果研究

張凱 曹聰 余孟流 光夢(mèng)凱 鐘波 徐寶華

[摘要]目的：探索角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte growth factor，KGF）對(duì)于大鼠皮膚傷口局部的促血管化作用。以探究其可能的促進(jìn)愈合的機(jī)理。方法：構(gòu)建大鼠背部皮膚全層缺損模型，隨機(jī)分為空白組（不作特殊處理），空白膜組（放置空白膠原膜），KGF膜組（放置加載KGF的膠原膜）。通過大體標(biāo)本觀察，組織學(xué)染色、免疫雙標(biāo)染色等技術(shù)對(duì)術(shù)后7d和14d時(shí)傷口的血管化程度進(jìn)行比較和分析。結(jié)果：術(shù)后通過大體標(biāo)本觀察，可看到空白組和空白膜組雖均有血管長(zhǎng)入傷口內(nèi)，但中心部位血管化程度低于KGF膜組。Masson染色和免疫熒光染色及局部血管計(jì)數(shù)也證實(shí)加載KGF的膠原膜可以促進(jìn)局部血管再生。結(jié)論：KGF可以促進(jìn)大鼠皮膚傷口愈合過程中的血管化作用。

[關(guān)鍵詞]角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子;皮膚傷口;傷口愈合;膠原膜;血管化

[中圖分類號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）01-0086-03

Keratinocyte Growth Factor Promotes Vascularization of Rat Skin Wounds

ZHANG Kai，CAO Cong，YU Meng-liu，GUANG Meng-kai，ZHONG Bo，XU Bao-hua

（Stomatology Center，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）

Abstract： Objective? This article aims to explore the pro-angiogenic effect of KGF on rat skin wounds. Methods? After successful modeling of full-thickness defect， 12 rats were randomly divided into three groups. The blank group was not treated. Blank collagen membrane was placed in the blank membrane group. Collagen membrane loaded with KGF was placed in the KGF membrane group. The degree of vascularization of the wounds at 7 and 14 days after surgery was compared and analyzed. Analysis was performed by gross specimen observation of wounds， histological staining， and immunolabeling. Results? Through the observation of gross specimens， it can be seen that although wounds in the blank group and the blank membrane group have blood vessels that grow into the wound， the degree of vascularization in the central part was lower than that in the KGF membrane group. Masson staining and immunofluorescence staining also confirmed that collagen membranes with sustained release of KGF promoted local angiogenesis. Conclusion? KGF can promote the vascularization of rat skin wound healing process.

Key words： keratinocyte growth factor（KGF）; skin wound; wound healing; collagen membrane; angiogenesis

發(fā)生在顏面部的皮膚損傷，如果發(fā)生延遲愈合或瘢痕愈合會(huì)很大程度影響患者的美觀及功能。研究證實(shí)，血管化在皮膚愈合中起到十分關(guān)鍵的作用。如果缺少血管的滋養(yǎng)，新生上皮容易產(chǎn)生瘢痕，可能導(dǎo)致上皮化不完全，機(jī)械性能差等，因此血管化不足是決定和制約皮膚修復(fù)效果的關(guān)鍵因素之一[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚受傷后，局部分泌多種細(xì)胞因子在真皮與表皮之間起重要的橋接作用，參與皮膚的愈合，改建及角化[3]。其中角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte growth factor，KGF）在正常皮膚中表達(dá)量較低，但皮膚受傷后KGF在短期內(nèi)上調(diào)，提示其在傷口愈合和皮膚再生中起到關(guān)鍵作用。特定作用于上皮細(xì)胞，是成纖維細(xì)胞-角質(zhì)形成細(xì)胞交互作用的關(guān)鍵分子[3]。已有研究證實(shí)外源性KGF可以促進(jìn)皮膚傷口的愈合[3-4]，因此本研究旨在探索KGF對(duì)于缺損局部血管化的促進(jìn)作用。

1? 材料及方法

1.1 主要試劑及儀器：膠原膜（登騰，韓國），角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte growth factors，KGF，Genoss，韓國），2-嗎啉乙磺酸[2-（N-Morpholino） ethanesulfonic acid，MES，西格瑪，美國]，N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS，西格瑪，美國），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC，西格瑪，美國]，抗CD31單克隆抗體（ab64543，Abcam，美國），抗α-SMA單克隆抗體（ab18147， Abcam，美國）。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)因子加載：將直徑1cm的膠原膜材料經(jīng)過EDC/NHS（含0.5M EDC和0.5M NHS的MES溶液）溶液浸泡16h，再轉(zhuǎn)移至1ml相應(yīng)的KGF溶液中在4℃環(huán)境下浸泡16h。KGF溶液濃度為10ng/ml。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及模型：本文采用8周SD大鼠背部皮膚模型進(jìn)行軟組織愈合評(píng)價(jià)。12只大鼠隨機(jī)分3組，背部備皮，消毒，制作4個(gè)圓形（直徑8mm）全層皮膚傷口，潛行剝離后放置不同處理的膠原膜（直徑1cm），表面被覆Tegederm（3M，美國）及硅膠圈，縫合固定。空白組不作處理;空白膜組放置空白膠原膜;KGF膜組放置加載KGF的膠原膜。

1.2.3 大體解剖觀察：7d及14d分別處死，將傷口區(qū)域皮膚標(biāo)本沿硅膠圈外沿5mm左右剪下。將新鮮標(biāo)本被覆在強(qiáng)光源表面，因皮膚有一定透光度，可以直接對(duì)血管形成情況進(jìn)行觀察。

1.2.4 組織學(xué)染色：將標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色，Masson三色染色及CD31和α-SMA免疫雙標(biāo)染色。在顯微鏡下觀察軟組織愈合情況及血管化程度。

2? 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本血管化觀察：如圖1，14d傷口區(qū)域肉眼觀可見幾組均有血管從周圍向傷口中心匯聚性長(zhǎng)入。空白組雖有周圍大血管長(zhǎng)入硅膠圈內(nèi)，但傷口中心區(qū)皮膚發(fā)白，中間形成明顯的乏血管區(qū)，類似瘢痕組織形成;空白膜組血管形成較A組稍均勻，呈紅色云霧狀，但中心區(qū)仍有小部分泛白的區(qū)域。相較而言KGF膜組不僅周圍有大血管延伸至標(biāo)本中心，且傷口中心形成了較均勻的紅色小血管網(wǎng)，偶有較粗的大血管貫穿。提示KGF膜組血管化程度高于空白組和空白膜組。

2.2 血管免疫雙標(biāo)染色：術(shù)后7d時(shí)CD31（綠色）及α-SMA（紅色）免疫雙標(biāo)染色如圖2所示。在空白組和膠原膜組中可見散在的α-SMA陽性細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)，但CD31陽性細(xì)胞散在在視野中，并未形成管腔樣結(jié)構(gòu)。KGF組可見內(nèi)層綠色，外層紅色的雙染管腔樣結(jié)構(gòu)，提示KGF組有成熟的血管組織形成。14d時(shí)，三組均可觀察到明顯的管腔樣血管結(jié)構(gòu)，但空白組仍只能觀察到紅色管壁，未見明確綠色內(nèi)襯結(jié)構(gòu)?？瞻啄そM部分血管可見雙層共染色。但與前兩組相比較，KGF膜組明顯可以觀察到高密度成熟血管結(jié)構(gòu)，幾乎所有血管均可見雙層紅綠共染色的管腔結(jié)構(gòu)。

2.3 組織學(xué)染色觀察：術(shù)后14d大鼠傷口新生皮膚組織Masson染色結(jié)果顯示：空白組（見圖3A）上皮層完全未形成，視野中僅有藍(lán)色結(jié)締組織，且?guī)缀醪豢梢娂t染的新生血管?？瞻啄そM（見圖3B）中可以看到紅藍(lán)相間的膠原膜仍被覆在傷口表面，膠原膜降解尚未完成。膠原膜下可見一層暗紅色血痂，血痂下的結(jié)締組織中可見少量紅色小血管散在分布。KGF膜組（見圖3C）已可觀察表面形成一層致密深染纖維，提示上皮層逐漸形成中。在下層的結(jié)締組織中明顯觀察到高密度新生血管，其中可見紅細(xì)胞充盈，說明形成了成熟的功能血管。進(jìn)一步對(duì)各組高倍鏡下毛細(xì)血管密度進(jìn)行了計(jì)數(shù)分析，可以得出KGF膜組的鏡下血管密度顯著高于空白組和空白膜組。

3? 討論

由創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、糖尿病潰瘍等引起的急慢性皮膚缺損是一類常見病癥[5-6]。組織工程的發(fā)展，為解決大面積皮膚缺損時(shí)自體皮源不足提供了新的思路和方法[7]。本文通過制備加載KGF的膠原膜，為皮膚再生提供了新的思路。

KGF又被稱為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7（Fibroblast growth factor-7，F(xiàn)GF-7）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員。最早由Rubin等（1980）從人類胎肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中分離提純獲得的。由間充質(zhì)細(xì)胞特別是成纖維細(xì)胞分泌，特定地作用于上皮細(xì)胞，包括皮膚，肺及消化道黏膜等[8]。

血管化過程是傷口愈合程度的關(guān)鍵指標(biāo)之一，本研究側(cè)重于討論KGF在傷口血管化方面作用。大體標(biāo)本和組織學(xué)切片均驗(yàn)證了KGF對(duì)于局部新生血管的促進(jìn)作用，這種促進(jìn)不僅體現(xiàn)在血管的數(shù)量，而且體現(xiàn)在KGF組的血管成熟程度較高，說明行使功能的血管比例較高。筆者認(rèn)為，KGF促進(jìn)血管化的可能機(jī)制有以下幾方面：①作為促有絲分裂因子，既往的研究表明KGF可以直接作用于微小血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，且其作用基本與同計(jì)量bFGF相當(dāng);②KGF通過調(diào)節(jié)與成血管相關(guān)因子的釋放而間接影響血管化。研究表明，KGF可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF，既協(xié)同VEGF的促血管新生作用，又抑制VEGF介導(dǎo)的紅細(xì)胞滲溢[10]。從而形成更完整更成熟的血管;③成熟的血管除了內(nèi)襯的內(nèi)皮細(xì)胞之外，還需要包裹的血管肌細(xì)胞協(xié)同，才能行使功能。Peng等[11]還發(fā)現(xiàn)KGF在傷口愈合中可以促進(jìn)α-SMA蛋白分泌，進(jìn)而促進(jìn)傷口收縮，以加快創(chuàng)面關(guān)閉。同時(shí)α-SMA也是血管平滑肌的重要標(biāo)志物，因此推測(cè)，KGF也可以通過血管平滑肌途徑來促進(jìn)傷口的血管化。本研究中也通過免疫熒光染色證實(shí)，KGF組確實(shí)有更多成熟的α-SMA蛋白的表達(dá)。綜上，這些結(jié)果均提示KGF在血管再生的各個(gè)不同時(shí)期都起到了調(diào)節(jié)作用。為本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)構(gòu)提供了理論依據(jù)。但本研究具有一定的局限性，目前的分析僅停留在現(xiàn)象的觀察，后續(xù)研究可以深入探討KGF通過激活哪些通路帶來相應(yīng)的效果。

同時(shí)，KGF對(duì)于傷口愈合的促進(jìn)作用可能不僅在于其對(duì)血管化的促進(jìn)。在傷口修復(fù)過程中有許多細(xì)胞因子參與，但只有KGF是僅由間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生[12]。提示KGF作為一種旁分泌介質(zhì)主要調(diào)節(jié)間充質(zhì)-上皮交通（epithelial–mesenchymal interactions），對(duì)于上皮屏障的功能維持以及傷口愈合起關(guān)鍵作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)還通過組織學(xué)染色還發(fā)現(xiàn)，KGF組膠原膜降解速度快于空白膜組。原始的膠原膜結(jié)構(gòu)消失，較早地演變?yōu)樵缙谛律掀そY(jié)構(gòu)。材料在體內(nèi)的降解過程與免疫細(xì)胞募集相關(guān)，特別是巨噬細(xì)胞在其中扮演重要角色，Gardner等發(fā)現(xiàn)KGF在肺組織中可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能，加速對(duì)肺組織中細(xì)菌的清除[13]。據(jù)此，筆者推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)中KGF也通過上調(diào)局部免疫功能，加速膠原膜吸收，從而加速了正常皮膚組織對(duì)于材料的替代。

總之，KGF可以在創(chuàng)面愈合的多個(gè)階段發(fā)揮作用，且膠原膜可以作為其載體釋放KGF。但其作用機(jī)制需要更加深入地研究進(jìn)行探索。作為已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)使用的藥物，如果KGF對(duì)于皮膚創(chuàng)面愈合的積極作用及安全性得到充分驗(yàn)證，相信KGF很快可以用于臨床中面積較大的傷口或遷延不愈傷口的治療。

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[收稿日期]2019-12-02

本文引用格式：張凱，曹聰，余孟流，等.角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)大鼠皮膚傷口局部血管化效果研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（1）：86-88.