大黃素調(diào)節(jié)細胞粘附與侵襲抑制鼠黑色素瘤轉(zhuǎn)移

何振輝，蔡坤泰，翁閃凡 *，林 鵬，魏 瓊

（1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗系，廣東 佛山528000；2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院佛山市口腔醫(yī)院，廣東佛山528000；3. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)系，廣東 佛山528000；4. 佛山市南海區(qū)第五人民醫(yī)院 檢驗科，廣東 佛山528231）

大黃素（1，3，8-三羥基-8-甲基蒽醌）是何首烏、大黃等中藥提取的蒽醌類單一有效成分，是蘆薈大黃素（Aloe Emodin，AE）的同分異構(gòu)體，Emo 結(jié)構(gòu)式見參考文獻［1］。Emo 具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括致瀉、抗菌、降血壓、抗腫瘤等。Emo 具有誘導(dǎo)和抑制腫瘤細胞凋亡的雙重作用［2］。但Emo 對鼠源性腫瘤細胞B16F10 轉(zhuǎn)移潛能的影響，未見文獻報道。本文以體內(nèi)和體外模型研究了Emo 對B16F10 細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

鼠源性黑色素瘤細胞B16F10 由嶺南轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心嚴愛芬副教授惠贈。細胞在RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（5%胎牛血清，100 mg/L 青霉素和鏈霉素）中于37 ℃、5%CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.1.2 實驗動物

C57BL/6 小鼠，雌雄并用，體質(zhì)量18～20 g，由廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-008）。動物飼養(yǎng)和實驗符合相關(guān)動物倫理規(guī)定。

1.1.3 主要試劑和藥品

主要試劑與藥品的來源如表1 所示。

表1 主要試劑與藥品來源

本實驗以DMSO 溶解Emo，作用細胞前以培養(yǎng)基稀釋，DMSO 終濃度≤0.1%（V/V）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞生長抑制實驗

細胞生長抑制實驗步驟為：于96 孔細胞培養(yǎng)板中接種對數(shù)生長期的B16F10 細胞，每孔為5×104，待細胞貼壁生長過夜。將Emo 以培養(yǎng)基稀釋加入各孔中，設(shè)立PBS 和0.1%DMSO 的對照組，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后每孔加入濃度為2.5 mg/mL 的MTT 20 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基后每孔加入200 μL 二甲基亞砜（DMSO），將96 孔細胞培養(yǎng)板在搖床上振搖30 min。在酶標(biāo)儀上檢測570 nm 的吸光度。每個藥物濃度設(shè)置8 個平行孔，實驗重復(fù)3 次。細胞生長抑制率的計算公式為

1.2.2 基質(zhì)粘附能力實驗

基質(zhì)粘附能力實驗步驟為［3-4］：以Emo 處理B16F10 細胞24 h，并以胰酶消化后加入到96 孔板中（1×105/孔，3 復(fù)孔）。孔中預(yù)先包被有FN/VN 10 μg，37 ℃溫育2 h，以PBS 沖洗3 遍去除未粘附細胞。以PBS、0.1%DMSO 處理的細胞作為對照組。粘附細胞的數(shù)量以MTT 法測出，結(jié)果以A570表示。其粘附抑制率的計算公式為

1.2.3 Matrigel 侵襲實驗

Matrigel 侵襲實驗步驟為：收集對數(shù)生長期的B16F10 細胞，重懸于含0.1%小牛血清（BSA）的1640培養(yǎng)基，加至Transwell 小室中（每室1×105細胞），同時加入PBS 和各濃度的藥物。Transwell 小室中的PVPF 膜（帶有小孔的濾膜，小孔內(nèi)徑為8 μm）上表面均勻涂抹Matrigel 50 μg，下表面均勻涂抹FN 10 μg。將Transwell 小室放入24 孔板中，在小孔中加入600 μL RPMI-1640 完全培養(yǎng)基。6 h 后將Transwell 小室取出，以蘇木素-伊紅染色后計數(shù)下表面的穿膜細胞，每個小室取5 個隨機視野計數(shù)，實驗重復(fù)3 次。其抑制率的計算公式為

1.2.4 劃痕實驗

劃痕實驗［5］步驟為：5×105細胞接種于直徑為35 mm 塑料碟子中，待細胞在完全培養(yǎng)基中生長至80%融合度，以無菌的tip 頭造成平行的約400 nm 的傷口，用PBS 沖洗傷口后，在細胞碟中加入含藥的培養(yǎng)基，24 h 后觀察劃痕中細胞的覆蓋度，以劃痕中細胞數(shù)量相對于對照組的百分比表示。

1.2.5 測定腫瘤細胞粘附肺組織

調(diào)整對數(shù)生長的B16F10 細胞濃度為1×107/mL，以1 000∶1 的比例（體積比）加入5 mmol/L 的CFSE，37 ℃水浴10 min，在此期間搖動2～3 次，在1 mL 加有CFSE 的細胞懸液中加入2 mL 預(yù)冷的小牛血清，充分混勻，1 000 r/min 離心5 min，用PBS 洗滌細胞兩遍。以不同濃度Emo 處理CFSE 標(biāo)記的B16F10 細胞24 h，收集細胞，將5×105的B16F10 細胞于d0 通過尾靜脈接種于C57BL/6 小鼠（n=8）。然后在d15 處死小鼠，剝離小鼠肺，制作冰凍切片，并在熒光顯微鏡下計數(shù)隨機20 個視野的綠色熒光斑點數(shù)量。

1.2.6 Emo 對乳腺癌實驗性轉(zhuǎn)移的影響

5×105的B16F10 細胞（先以不同濃度的Emo 處理24 h）于d0 通過尾靜脈接種于C57BL/6 小鼠（n=8）。然后在d15 處死小鼠，剝離內(nèi)臟器官，計算其表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Emo 對B16F10 細胞存活的影響

根據(jù)MTT 實驗的結(jié)果，為了排除藥物對細胞殺傷作用的影響，選擇10、20、40 μmol/L 為體外侵襲重組基底膜實驗Emo 的作用濃度。40 μmol/L 及以下濃度的Emo 處理B16F10 細胞6 h，吸光度A570與空白對照組相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)藥物濃度達到80 μmol/L，6 h 處理后A570與空白對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果如表2 所示。

表2 Emo 對B16F10 細胞增殖的抑制作用（x±s，n=3）

2.2 Emo 對B16F10 細胞體外粘附能力的影響

與空白對照組相比，Emo 處理后粘附VN、FN 的B16F10 細胞數(shù)明顯降低，表現(xiàn)為MTT 法測出的A570明顯下降。40 μmol/L 的Emo 獲得最大的粘附抑制率，超過30%。結(jié)果如表3、4 所示。

表3 Emo 對B16F10 細胞粘附VN 能力的影響（x±s，n=3）

表4 Emo 對B16F10 細胞粘附FN 能力的影響（x±s，n=3）

2.3 Emo 對B16F10 細胞侵襲重組基底膜能力的影響

各濃度Emo（10、20、40 μmol/L）作用B16F10 細胞6 h 后，粘附在PVPF 膜下表面的細胞數(shù)明顯減少，40 μmol/L 處理時最大抑制率達到（41.65±6.37）%，如表5 及圖1a、1b 所示。

表5 Emo 對B16F10 細胞侵襲能力的影響（x±s，n=3）

圖1 粘附于PVPF 膜上的B16F10 細胞

2.4 Emo 對B16F10 細胞遷移能力的影響

與空白對照組相比，各濃度Emo（10、20、40 μmol/L）處理的B16F10 細胞在傷口內(nèi)數(shù)量明顯減少，因而占空白對照組的百分比明顯降低，表明細胞運動能力顯著下降，結(jié)果如圖2 所示。

2.5 Emo 對B16F10 細胞粘附肺組織的影響

采用CFSE 標(biāo)記技術(shù)可以檢測循環(huán)腫瘤細胞對體內(nèi)器官和組織的粘附。CFSE 標(biāo)記的B16F10 細胞接種C57BL/6 小鼠24 h 后，取肺組織制作冷凍切片。結(jié)果表明，Emo 處理的B16F10 細胞在肺組織切片中形成熒光斑點數(shù)明顯減少，如圖3 所示。

2.6 Emo 對B16F10 實驗性轉(zhuǎn)移的影響

B16F10 細胞僅在C57BL/6 小鼠內(nèi)臟器官中的肺表面形成肉眼可見的黑色轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，與空白對照組相比，Emo 處理的B16F10 細胞形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯減少，如圖4 所示。

圖2 大黃素抑制B16F10 細胞運動能力(x±s，n=3)

圖3 大黃素對小鼠肺部組織切片熒光斑點數(shù)量的影響（x±s，n=8）

3 討論

近年來，黑色素瘤（melanoma）發(fā)病率快速增長，在所有腫瘤發(fā)病率增速中為最高［6］。黑色素瘤占皮膚腫瘤死亡病例的80%。肺部和腦轉(zhuǎn)移是黑色素瘤患者死亡的主要原因，至今仍無有效的治療藥物。本研究的體外細胞模型顯示Emo 對黑色素瘤B16F10細胞的侵襲重組基底膜、粘附細胞外基質(zhì)（ECM）的特定分子、在ECM 上的遷移均有抑制作用。小鼠模型顯示Emo 能抑制血循環(huán)中B16F10 細胞在肺部的錨定及形成轉(zhuǎn)移灶，提示了Emo 具有抗B16F10 黑色素瘤轉(zhuǎn)移的潛能。但對于人源性黑色素瘤細胞是否具有類似的作用，還需進一步研究。

粘附是惡性腫瘤形成克隆性轉(zhuǎn)移灶的關(guān)鍵步驟。腫瘤細胞通過其表面成分如粘附分子（adhesion molecules，AMs）與ECM 中特定的配體結(jié)合，引起相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，于是使某些基因的表達發(fā)生變化，腫瘤細胞的細胞骨架（微管、微絲等）發(fā)生組裝和去組裝，相應(yīng)地腫瘤細胞在ECM 成分中不斷地進行粘附和解粘附，從而形成了遷移（運動）。當(dāng)腫瘤細胞發(fā)生遷移時，還需要降解ECM 成分（侵襲）以開辟前進的道路。因此，腫瘤細胞與基質(zhì)的相互作用與腫瘤細胞的運動、侵襲相關(guān)［7］。在本實驗中，顯示Emo 對B16F10 細胞侵襲和遷移的抑制，可能與其抑制B16F10 細胞與特定ECM 成分FN、VN 的粘附有關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示Emo 在小鼠模型中抑制B16F10 細胞對肺組織的粘附，這表明Emo 能抑制B16F10 細胞實驗性肺轉(zhuǎn)移的起始階段。Emo 處理的B16F10 細胞形成肉眼可見的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量的減少，則說明Emo 能抑制B16F10 細胞實驗性轉(zhuǎn)移的較晚階段。在這一模型中，血循環(huán)的B16F10 細胞需要粘附血管內(nèi)皮細胞，侵襲內(nèi)皮下基底膜才能在形成肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)［8］。這一體內(nèi)試驗的結(jié)果與體外Emo對B16F10 細胞粘附、侵襲的抑制作用相一致。

本研究中使用體外細胞模型和動物模型證實了Emo 對B16F10 細胞粘附ECM 分子和肺組織的抑制作用。腫瘤細胞對ECM 成分粘附能力的改變，可能與其表面AMs 改變有關(guān)，后者如整合素（integrin）、鈣黏素（cadherin）等。AMs 與ECM 結(jié)合后，可以將胞外的信號傳導(dǎo)到胞內(nèi)，引起包括粘著斑激酶（FAK）在內(nèi)的一系列蛋白酪氨酸激酶激活。結(jié)合Emo 和AE 對其他細胞系作用的報道［9］，筆者擬將整合素αVβ3 與FAK 作為主要靶點，進一步分析Emo 抗B16F10 細胞轉(zhuǎn)移的分子機制。

圖4 大黃素對小鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量的影響（x±s，n=8）