小麥應(yīng)對Cu2+脅迫的生理響應(yīng)及ASA-GSH合成酶基因表達(dá)

鄭永興, 李鴿子, 康國章

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 國家小麥工程技術(shù)研究中心, 省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室, 鄭州 450046)

銅(Cu2+)是植物生長發(fā)育必需的微量元素之一，它參與植物的光合作用和一些必需的氧化還原反應(yīng),對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。然而過量的Cu2+損害植物細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)而導(dǎo)致膜脂過氧化，使其體內(nèi)的生理代謝紊亂，嚴(yán)重阻礙植物的生長發(fā)育[1-3]。近年來的研究表明，Cu2+作為重要的污染元素之一，影響農(nóng)作物的正常生長和代謝，已對人類健康造成了較為嚴(yán)重的危害[4-5]。薛盈文等[6]研究表明，低濃度Cu2+促進(jìn)小麥種子萌發(fā)，而高濃度Cu2+則抑制小麥種子發(fā)芽，且小麥生長發(fā)育隨著Cu2+濃度的增高而受阻，說明高濃度Cu2+嚴(yán)重影響了小麥種子萌發(fā)和生長發(fā)育。張剛等[7]對黑麥草進(jìn)行不同濃度Cu2+脅迫處理發(fā)現(xiàn)，高濃度和長時間Cu2+脅迫降低黑麥草的發(fā)芽率、抑制根系生長和葉片葉綠素含量的增加。植物在長期的自然進(jìn)化過程中已形成了一系列較為完善的自我防御機(jī)制，主要包括酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)[8]，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等參與酶促反應(yīng),抗壞血酸(ascorbate，ASA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)等參與非酶促反應(yīng)。其中，ASA-GSH循環(huán)是植物應(yīng)對脅迫反應(yīng)中不可或缺的非酶促反應(yīng)，主要通過還原型的抗氧化物ASA和GSH、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)、單脫水抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase, MDHAR)、抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)和谷胱甘肽合成酶(glutathione reductase, GR)等多個酶促反應(yīng)共同作用從而實(shí)現(xiàn)H2O2清除及ASA和GSH再生的過程，最終實(shí)現(xiàn)ASA-GSH循環(huán)反應(yīng)來維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而提高植物在逆境脅迫條件下的抗逆性[8-10]。Zeng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，水稻汞耐性相關(guān)突變體植株中ASA-GSH循環(huán)比野生型植株能更有效地清除脅迫條件下產(chǎn)生的活性氧，說明ASA-GSH循環(huán)在水稻應(yīng)對Hg2+脅迫過程中發(fā)揮了重要的作用，但具體的作用機(jī)制研究還未見報道。

目前，植物銅脅迫的研究多集中在其應(yīng)對脅迫耐性的酶促和非酶促反應(yīng)等生理作用機(jī)制方面，不能明確具體的相關(guān)作用機(jī)理[12-14]。因此，本研究利用不同濃度的Cu2+處理小麥幼苗，測定了脅迫條件下的生長參數(shù)、受傷害程度、及非酶促反應(yīng)相關(guān)參數(shù)ASA和GSH等生理指標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上，檢測了ASA-GSH循環(huán)中 4個關(guān)鍵酶基因APX、DHAR、GR和MDHAR在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異，同時在生理和轉(zhuǎn)錄水平上探究了銅脅迫對小麥的傷害機(jī)理，為后續(xù)小麥銅污染相關(guān)的防御治理和小麥等糧食作物的生態(tài)環(huán)境評價提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為現(xiàn)今在黃淮海麥區(qū)大面積種植的小麥品種‘百農(nóng)207’，種子由河南科技學(xué)院歐行奇教授和朱啟迪博士提供。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設(shè)計 種子經(jīng)0.01% HgCl2消毒處理后，用蒸餾水清洗3次。在培養(yǎng)皿中用清水浸泡種子，直至種子萌動，挑選大小一致的萌動種子約60顆分別放于直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，將其置于LED光照培養(yǎng)箱(寧波揚(yáng)輝儀器有限公司)進(jìn)行培養(yǎng)，晝/夜培養(yǎng)條件16/8 h、24/18 ℃,光照10 000 lx，參照Li等[15]和Kang等[16]的研究方法，每隔1 d換一次1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液。將小麥幼苗培養(yǎng)至三葉期，對小麥幼苗進(jìn)行不同濃度CuSO4·5H2O處理，共設(shè)置0、0.05、0.10、0.50、1.00 mmol·L-1Cu2+5個處理，處理液為不同濃度Cu2++ 1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液，處理10 d后，每個處理單獨(dú)采樣，測定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2.2生長參數(shù)及生理指標(biāo)測定 在脅迫處理的第10 d, 每個處理隨機(jī)挑選3～5棵小麥幼苗，測定其株高、根長、總鮮重、總干重等生長參數(shù)。分別取小麥幼苗的葉片及根各0.2 g，每個處理重復(fù)3次，利用組織研磨儀(SCIENTZ-48, 寧波新芝生物科技股份有限公司)研磨后分別加入2 mL 10% 三氯乙酸(TCA)，混勻后再分別加入4 mL 10% TCA, 4 ℃、4 537 r·min-1離心10 min, 轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中，用于丙二醛(malondialdehyde，MDA)、抗壞血酸(ascorbate, ASA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量的測定。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[15-16]；抗壞血酸含量的測定，參考Kampfenkel等[17]方法；谷胱甘肽含量的測定參考Simth[18]方法；H2O2含量的測定參考Shan等[19]方法。

1.2.3基因表達(dá)量的測定 利用Trizol法提取小麥葉片和根系RNA，用TAKARA熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成dsDNA，于-20 ℃保存；進(jìn)而采用熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)測定基因的表達(dá)量[20]。由于普通小麥為異源六倍體(AABBDD)，每個基因至少存在3個以上的拷貝，且3個拷貝之間cDNA序列的同源性在95%以上[21]?；诖耍狙芯扛鶕?jù)已知的基因序列，在小麥IWGSC數(shù)據(jù)庫同源搜索到相對應(yīng)的染色體信息，在Ohdan等[22]研究基礎(chǔ)上，利用Primer 5.0軟件設(shè)計ASA-GSH合成途徑的4個合成酶基因的引物(表1)。引物合成由河南尚亞生物技術(shù)有限公司完成。qPCR反應(yīng)程序參考Li等[23]和Livak等[24]方法進(jìn)行，以Actin為內(nèi)參基因，每個處理重復(fù)3次，以2-ΔΔCT方法檢測相關(guān)基因的表達(dá)量。

表1 qPCR引物Table 1 Primers for qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Statistics 19.0軟件(IBM)進(jìn)行方差分析，并利用Origin 9.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cu2+處理對小麥生長的影響

不同濃度Cu2+溶液處理三葉期的小麥幼苗10 d后，小麥植株的生長發(fā)育受到限制，葉片出現(xiàn)下垂、發(fā)黃、卷曲等癥狀(圖1)。生長參數(shù)測定結(jié)果(表2)表明，與對照相比，0.05、0.10、0.50、1.00 mmol·L-1Cu2+處理的小麥植株的株高分別下降13.90%、12.36%、27.32%、33.01%；根長分別下降21.20%、20.61%、32.60%、41.47%；植株總鮮重分別顯著降低了6.19%、21.41%、44.39%、59.53%；植株總干重與對照相比也顯著降低，分別降低了15.11%、15.11%、19.76%、40.31%, 其中，0.05、0.10、0.50 mmol·L-1Cu2+處理間總干重差異不顯著。同時，小麥長勢觀察顯示，小麥植株受傷害的程度隨著Cu2+濃度的增高而不斷增加，其中，0.50和1.00 mmol·L-1兩個濃度處理的小麥植株出現(xiàn)了葉片下垂、失綠甚至枯萎現(xiàn)象(圖1，表2)。說明小麥植株在防御逆境脅迫條件下其自身的抗氧化系統(tǒng)被激發(fā)，影響了植株體內(nèi)水分的分配和利用，進(jìn)而阻礙了其自身正常的生長發(fā)育。

表2 不同濃度Cu2+處理的小麥幼苗生物量Table 2 Biomass of wheat seedlings treated with different Cu2+concentrations

2.2 不同濃度Cu2+處理對MDA和H2O2含量的影響

植物在應(yīng)對脅迫反應(yīng)過程中，其體內(nèi)的膜脂過氧化物MDA和活性氧(如H2O2)不斷增加。小麥葉片和根系的MDA和H2O2含量結(jié)果(圖2)顯示，隨著Cu2+濃度的升高，葉片和根系的MDA和H2O2含量均呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。不同處理間的葉片和根系的MDA含量均存在顯著性差異，且高濃度(1.00 mmol·L-1)Cu2+處理的小麥植株的葉片和根系中MDA含量達(dá)到最大值，其含量分別是對照植株的7.56和19.15倍；0.10、0.50和1.00 mmol·L-1Cu2+處理的小麥植株葉片和根系的H2O2含量與對照也均存在顯著差異，其在葉片中的含量分別是對照處理的1.31、1.50和1.80倍，在根系中的含量分別是對照的1.17、1.36和1.72倍。3個處理間葉片和根系的H2O2含量也均存在顯著差異。由此說明,Cu2+脅迫誘導(dǎo)小麥植株體內(nèi)H2O2含量增加，從而引起其細(xì)胞膜的膜脂過氧化，破壞植株的正常生長發(fā)育。

2.3 不同濃度Cu2+處理對ASA和GSH含量的影響

脅迫條件下，植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要成員ASA和GSH增加，能有效清除其體內(nèi)活性氧的積累，來維護(hù)植物細(xì)胞免受脅迫所引發(fā)的氧化損傷。由表3可知，葉片中ASA含量在0.05 mmol·L-1處理條件下達(dá)到最高值，其含量比對照處理提高13.11%；0.10和1.00 mmol·L-1處理分別比對照顯著增加5.54%和6.70%，而0.50 mmol·L-1處理則顯著減少22.59%；在根系中，0.50 mmol·L-1Cu2+處理的ASA含量最高，是對照處理的10.33倍，0.05和1.00 mmol·L-1處理分別比對照顯著增加25.19%和286.63%，0.10 mmol·L-1處理比對照顯著降低69.77%。在0.05 mmol·L-1Cu2+處理條件下葉片中GSH 含量比對照顯著降低32.28%，而根系中GSH 含量則與對照處理無顯著差異；0.10、0.50和1.00 mmol·L-1Cu2+處理的葉片GSH含量顯著高于對照處理32.54%、40.06% 和129.11%，0.50和1.00 mmol·L-1Cu2+處理的根系GSH含量顯著高于對照201.86%和368.18%。表明不同濃度 Cu2+處理條件下，小麥植株可通過體內(nèi)ASA和GSH含量的差異變化來維持和適應(yīng)逆境脅迫所引發(fā)的體內(nèi)抗氧化平衡系統(tǒng)，進(jìn)而參與小麥應(yīng)對Cu2+脅迫的響應(yīng)。

表3 不同濃度Cu2+處理小麥幼苗的ASA和GSH含量Table 3 Contents of ASA and GSH of wheat seedling in different Cu2+ concentrations

2.4 不同濃度Cu2+處理條件下4個ASA-GSH關(guān)鍵酶基因的變化

由圖3可知，APX基因在葉片和根系中的表達(dá)譜基本一致，在低濃度(0.05和0.10 mmol·L-1)Cu2+處理下表達(dá)顯著低于對照處理，其表達(dá)量在葉片中分別比對照顯著降低11.05%、31.74%，根系中較對照顯著降低19.79%、68.13%；高濃度(0.50和1.0 mmol·L-1)Cu2+處理下其表達(dá)量在葉片中分別比對照處理顯著增加2.19、2.67倍，根系中顯著增加1.18、3.25倍。DHAR和GR基因在葉片和根系中表達(dá)譜基本相似，其在葉片中均表現(xiàn)出低濃度(0.05和0.10 mmol·L-1)Cu2+處理表達(dá)量升高，而高濃度(0.50和1.0 mmol·L-1)Cu2+處理降低的趨勢。DHAR在0.05和0.10 mmol·L-1濃度分別增加到對照的2.05、2.00倍，GR增加到對照的2.10、2.56倍；在0.50和1.00 mmol·L-1濃度處理下DHAR的表達(dá)量分別比對照處理降低96.34%和69.42%，而GR的表達(dá)量在0.50 mmol·L-1Cu2+處理條件下為對照的1.42倍，但1.00 mmol·L-1Cu2+處理與對照無顯著差異。在根系中，DHAR和GR的表達(dá)量均隨著Cu2+處理濃度增加呈現(xiàn)遞增趨勢，0.05、0.10、0.50和1.00 mmol·L-1Cu2+處理的DHAR表達(dá)量分別增加到對照的1.42、3.06、5.33和3.56倍，4個處理的GR表達(dá)量分別增加到對照的1.63、2.09、3.61和3.77倍。在小麥葉片中，基因MDHAR在0.05和0.1 mmol·L-1Cu2+的表達(dá)譜與DHAR和GR基因相似，表達(dá)量均顯著高于對照植株，為對照的2.82倍和2.23倍；在1.0 mmol·L-1Cu2+處理的表達(dá)量顯著提高，為對照的2.61倍；但0.50 mmol·L-1Cu2+的表達(dá)量顯著低于對照處理。在小麥根系中，MDHAR基因的表達(dá)譜與基因APX相似，在0.10、0.50和1.00 mmol·L-1Cu2+處理下表達(dá)量分別顯著提高為對照的1.45、2.71和8.13倍。推測這些基因在不同組織間的差異表達(dá)可能與物種響應(yīng)Cu2+脅迫的機(jī)制及處理濃度有關(guān)。

3 討論

重金屬脅迫影響作物的生長發(fā)育、使其產(chǎn)量下降，嚴(yán)重情況下可使其死亡甚至物種消失[5]。小麥作為世界上最重要的糧食作物之一，在其生長發(fā)育過程中經(jīng)受著不同的脅迫傷害。有研究指出，過量Cu2+激活植物的POD、CAT、SOD酶促相關(guān)的保護(hù)酶系統(tǒng)，進(jìn)而通過其在體內(nèi)活性的增加來參與細(xì)胞活性氧的清除，引起膜質(zhì)過氧化，進(jìn)而影響小麥正常的生長發(fā)育[6]。MDA和H2O2是植物脅迫過程中評價其自身氧化脅迫程度和耐受性的關(guān)鍵指標(biāo)[25-26]。本研究中，小麥MDA和H2O2含量隨著Cu2+濃度的升高呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，并且小麥長勢受阻的表型相對于對照也逐漸明顯，說明小麥幼苗對Cu2+非常敏感，銅刺激可使幼苗細(xì)胞活性氧增加，引起膜質(zhì)過氧化，進(jìn)而阻止小麥幼苗的生長發(fā)育。Singh等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+毒害通過膜脂損傷影響了小麥根系的生長和生物量的積累，進(jìn)而影響小麥的正常生長發(fā)育；Janas等[28]對Cu2+脅迫下黃瓜幼苗研究也發(fā)現(xiàn)，高濃度Cu2+脅迫減緩黃瓜根系生長，使其葉片變黃枯萎，且葉片數(shù)量減少。本研究中高濃度的Cu2+積累引起小麥根系細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)而形成膜脂損傷，阻止植物對其他礦質(zhì)元素的吸收利用，使小麥體內(nèi)營養(yǎng)元素失調(diào)，影響其自身的代謝，從而抑制了小麥植株的正常生長發(fā)育。

在非生物脅迫條件下，植物抗氧化系統(tǒng)的重要成員ASA和GSH能阻止葉綠體中的ROS 積累，而高濃度ASA和GSH能保護(hù)植物細(xì)胞免受非生物脅迫引起的氧化損傷[29-30]。本研究結(jié)果顯示，Cu2+脅迫條件下，除0.10 mmol·L-1處理外，小麥根系A(chǔ)SA和GSH含量顯著高于對照處理，尤其在0.50 和1.00 mmol·L-1的高濃度處理下。這與Li等[15]和Kang等[16]的研究結(jié)果一致。但在0.50 mmol·L-1Cu2+條件下，小麥幼苗葉片中ASA含量顯著低于對照處理，而同處理的根系A(chǔ)SA含量是對照處理的10.33倍，可能是因為在此濃度條件下根系吸收Cu2+水平達(dá)到極限水平進(jìn)而促使該器官中ASA的大量積累，同時植物為維持自身的體內(nèi)平衡，阻止其向葉片轉(zhuǎn)移，顯著降低葉片ASA含量。這些結(jié)果表明，植物在不同濃度Cu2+脅迫條件下通過調(diào)控其體內(nèi)不同器官的含量變化來應(yīng)對逆境脅迫的傷害，進(jìn)而維持其自身的生命活動。

對Cu2+脅迫的研究多集中在生理水平上，但轉(zhuǎn)錄水平通常比酶活性能更準(zhǔn)確地反映某一或多種酶在脅迫下的變化，這是因為植物細(xì)胞內(nèi)的酶大多數(shù)是由許多不同的同工酶組成，轉(zhuǎn)錄水平能夠定量測定單一同工酶在植物細(xì)胞內(nèi)不同時空的變化。已有研究表明，不同物種在響應(yīng)鹽、干旱、冷害等的非生物脅迫條件下，ASA-GSH合成相關(guān)酶在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)存在差異[15-16,31]。如Li等[15]對小麥幼苗鹽脅迫耐性研究發(fā)現(xiàn)，其通過影響APX，DHAR,MDHAR等8個ASA-GSH循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而參與其對逆境脅迫的傷害。因為，植物應(yīng)對脅迫耐性中，ASA-GSH循環(huán)通過APX酶將脅迫產(chǎn)生H2O2還原為H2O，并生成不穩(wěn)定的單脫氫抗壞血酸鹽(monodehydroascorbate, MDHA)或者發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生脫氫抗壞血酸鹽(dehydroascorbate, DHA)；進(jìn)而，MDHA通過MDHAR將其還原為ASA，而DHA則通過DHAR形成氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)，在GR的催化下重新生成GSH，達(dá)到活性氧清除的目的[32]。因此,本研究利用qPCR的方法辨析了ASA-GSH合成相關(guān)4個酶基因APX、DHAR、MDHAR、GR在Cu2+脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化，結(jié)果與之前研究[15-16,31]相似，銅脅迫對APX、DHAR、MDHAR、GR基因均有不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，且在根系中，參與ASA合成相關(guān)酶基因APX和MDHAR的表達(dá)趨勢一致(圖3)，而參與GSH合成相關(guān)酶基因DHAR和GR的表達(dá)趨勢相同(圖3)，說明這些基因在根系受銅脅迫條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，與ASA和GSH含量的結(jié)果一致(表1)。在小麥葉片中，僅參與GSH合成相關(guān)酶基因DHAR和GR表達(dá)趨勢相同(圖3)，而ASA合成相關(guān)酶基因APX僅受高濃度銅脅迫誘導(dǎo)，而MDAHR的表達(dá)與銅脅迫濃度相關(guān)性不大，是因為APX作為響應(yīng)脅迫的受體，在低濃度范圍內(nèi)，可維持其正常生長發(fā)育，而高濃度則受脅迫誘導(dǎo)而大量表達(dá)[32]。而MDAHR則是ASA生產(chǎn)的一個關(guān)鍵酶，因此，該基因在逆境脅迫中均能表達(dá)，因此對脅迫濃度不敏感。上述結(jié)果說明，小麥在應(yīng)對銅脅迫耐性過程中，葉片和根系器官ASA-GSH循環(huán)存在一定的差異，進(jìn)而導(dǎo)致了其合成相關(guān)基因的差異表達(dá)。因此，在銅脅迫條件下，小麥植株通過誘導(dǎo)ASA和GSH合成相關(guān)酶基因在根系和葉片器官中的差異表達(dá)來協(xié)調(diào)其植株體內(nèi)脅迫耐性相關(guān)氧化平衡系統(tǒng)，進(jìn)而提高ASA和GSH的含量來應(yīng)對Cu2+脅迫。