微流控技術(shù)在解決豬體外受精中多精入卵問題中的應(yīng)用進展

劉芊萩, 陳強, 雷安民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

近年來，隨著豬在人類生物醫(yī)學(xué)研究及人類疾病模型中地位不斷上升，胚胎工程技術(shù)不但在豬遺傳育種領(lǐng)域的科研應(yīng)用需求不斷擴大，在生物醫(yī)學(xué)研究及人類疾病模型領(lǐng)域的需求也更加迫切。鑒于豬體內(nèi)胚胎研究的高成本，基于豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)(invitromaturation，IVM )、體外受精(invitrofertilization，IVF)、體外胚胎培養(yǎng)(invitroculture，IVC)獲得的低成本體外胚胎成為試驗研究的主要來源。與其他家畜如牛羊不同，豬體外胚胎多精受精率很高，這使得體外胚胎的發(fā)育能力大大降低，因此多精受精已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)利用豬胚胎的一個障礙。多精入卵是指2個或2個以上的精子進入同一卵母細胞的胞質(zhì)中,導(dǎo)致多倍體合子的形成、早期胚胎發(fā)育夭折或發(fā)育異常。如今尚不能完全解釋豬體外受精過程中出現(xiàn)的多精受精現(xiàn)象。為此探討豬體外胚胎多精受精的原因，克服豬體外受精中多精入卵的發(fā)生成為當(dāng)前的關(guān)鍵問題。

微流控芯片作為新興的生物技術(shù)工具，已廣泛應(yīng)用于小分子分析、核酸分析、蛋白質(zhì)分析等領(lǐng)域。Kricha等[1]首次采用微流控芯片實現(xiàn)了小鼠的體外受精，證明了微流控芯片在輔助生殖領(lǐng)域的可用性。近年來，微流控芯片在精子優(yōu)選、卵母細胞培養(yǎng)、體外受精及早期胚胎培養(yǎng)等方面應(yīng)用廣泛。Clark等[2]首次證明，仿生微通道體外受精系統(tǒng)可以減少豬多精受精，增加胚胎數(shù)量，而不降低整體體外生產(chǎn)效率微流控技術(shù)的引入，有助于解決豬體外受精過程中多精入卵率較高的問題。本文總結(jié)了微流控技術(shù)在哺乳動物胚胎學(xué)研究中的應(yīng)用，提出了將微流控技術(shù)應(yīng)用于豬體外受精技術(shù)，目的在于解決并克服豬體外受精中存在的多精入卵，旨在為完善豬體外受精技術(shù)提供可行的解決方案，同時為人類醫(yī)學(xué)輔助生殖技術(shù)的優(yōu)化完善提供新思路。

1 多精受精的原因

豬的多精受精現(xiàn)象主要存在于豬體外受精過程中。在實際養(yǎng)豬生產(chǎn)中，豬的窩產(chǎn)仔數(shù)可以達到10左右，略低于每個情期的平均排卵數(shù)，說明正常發(fā)情過程中所排出的卵子大部分都是正常授精的。比對體內(nèi)自然條件的受精過程與體外受精過程，導(dǎo)致豬體外受精過程中形成多精受精現(xiàn)象主要有3個原因：一是卵母細胞的成熟質(zhì)量不及體內(nèi)成熟卵；二是精子的體外獲能不充分；三是體外受精環(huán)境不同于體內(nèi)，導(dǎo)致受精過程出現(xiàn)異常。

1.1 卵母細胞成熟度影響受精過程

除了細胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)積累外，卵母細胞成熟過程中，影響多精子入卵發(fā)生的因素主要有透明帶反應(yīng)、卵黃膜反應(yīng)等，這些都與卵母細胞的細胞質(zhì)成熟度相關(guān)。

在體外受精過程中，卵母細胞未成熟或過度成熟都會引起多精受精率的升高。皮質(zhì)顆粒是卵母細胞特有的，用于阻止多精受精的細胞器，哺乳動物的皮質(zhì)顆粒在未成熟卵母細胞和體外培養(yǎng)卵母細胞中的分布不同于在體內(nèi)成熟的卵母細胞中的分布[3]，表明皮質(zhì)顆粒的變化與卵母細胞的質(zhì)成熟和核成熟有關(guān)。未成熟卵母細胞不能產(chǎn)生完整的皮質(zhì)反應(yīng)，主要是由于未成熟卵母細胞對精子進入產(chǎn)生的刺激不敏感，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)目過少，皮質(zhì)顆粒分布不均勻，精子進入卵母細胞時，不能引起皮質(zhì)顆粒的釋放。而過度成熟的卵母細胞容易發(fā)生老化，會使皮質(zhì)反應(yīng)不能發(fā)生或反應(yīng)不徹底，進而引起多精入卵[4]。

透明帶反應(yīng)是阻止多精入卵的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)精子進入透明帶后，會引起皮質(zhì)顆粒的釋放，顆粒內(nèi)容的釋放引起透明帶結(jié)構(gòu)的改變，進而阻止后續(xù)精子的進入。因而，透明帶結(jié)構(gòu)的完整性與透明帶的厚度將直接影響受精過程是否正常。在輔助生殖過程中，過多的人工操作常引起透明帶的機械損傷，會導(dǎo)致多精受精的發(fā)生。精卵比例的增大會使受精過程中卵母細胞的皮質(zhì)顆粒釋放延遲，引起多精受精的產(chǎn)生。研究表明，多精受精率會隨著精卵比的升高而升高[5]，因而篩選出具有優(yōu)良品質(zhì)的精子、降低精卵比有助于解決多精入卵的問題。

此外，卵母細胞的成熟質(zhì)量較差時會使卵母細胞受精過程中發(fā)生第二極體滯留，實質(zhì)是卵母細胞第二極體不能正常排出，從而導(dǎo)致受精卵中2個雌原核和1個雄原核的形成，最終能夠形成多倍體。

1.2 精子原因?qū)е麦w外受精胚胎的發(fā)育不良

由于體外受精不同于體內(nèi)受精過程中精子在生殖道中的自然選擇，所以相關(guān)研究或者臨床應(yīng)用中，常常采用人工方法對精子進行分選。目前常用的辦法主要有：①常規(guī)精子分選技術(shù)，主要是指上游法結(jié)合離心清洗；②利用不同質(zhì)量精子表面ζ電位的差異分選精子；③基于細胞流式分選系統(tǒng)的磁激活細胞分選系統(tǒng)；④基于透明質(zhì)酸結(jié)合的精子分選；⑤基于電泳的精子分選；⑥依托運動精子細胞器形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果的精子分選；⑦基于微流體的精子分選[6]。

2015年，日本學(xué)者采用簡單實用的搖擺受精系統(tǒng)，大大減少了豬體外授精的多精受精現(xiàn)象[7]。這些手段都是基于優(yōu)良的高活性精子的特性將其從精子群體中分離出來，盡管能夠提高體外受精的效率，但是否能夠減少豬的多精受精現(xiàn)象，仍需進一步研究。

1.3 授精環(huán)境導(dǎo)致的多精受精

受精環(huán)境中的激素成分、物理條件等也會影響多精受精的產(chǎn)生。受精環(huán)境中孕酮水平與卵母細胞成熟狀態(tài)密切相關(guān)，尤其是雌激素與孕酮的比值直接影響卵母細胞的發(fā)育。而黃體酮水平升高會減弱透明帶的硬化程度，影響豬胚胎的形成[8-9]。培養(yǎng)基pH的改變會影響精子獲能和頂體反應(yīng)的結(jié)果，pH升高能夠提高受精率，但會降低皮質(zhì)顆粒的活力。一些培養(yǎng)基的添加劑如碳酸氫鹽、肝素和咖啡因等，也在不同程度上影響多精受精的發(fā)生[10-12]。

2 微流控在胚胎工程中的應(yīng)用

應(yīng)用傳統(tǒng)的輔助生殖技術(shù)效率低，且體外受精的臨床環(huán)節(jié)會對母體造成身體傷害、情緒壓力。因此，如何優(yōu)化、改進卵母細胞和精子以及胚胎的質(zhì)量評估技術(shù)，進而提高體外生殖成功率是推動輔助生殖技術(shù)發(fā)展的必要條件。

微流體芯片作為新興的生物技術(shù)工具，可以對卵母細胞和胚胎等珍貴的細胞樣本進行非侵入性的細胞質(zhì)量評估，對輔助生殖中的精子樣品進行高通量篩選。與使用培養(yǎng)皿、試管或培養(yǎng)基滴等經(jīng)典體外方法相比，這些小體積和低雷諾數(shù)的芯片更接近授精和胚胎培養(yǎng)的體內(nèi)環(huán)境，這一平臺可以為改善體外受精和胚胎培養(yǎng)提供一種潛在手段。

2.1 微流控芯片在精子質(zhì)量評估中的應(yīng)用

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)利用精子分選的方法從精液樣本中篩選優(yōu)質(zhì)精子。目前使用的常規(guī)精子分選技術(shù)有密度梯度離心法、直接上游法和常規(guī)上游法。但這些方法離心步驟復(fù)雜，易產(chǎn)生活性氧，降低DNA完整性并損害精子。新型生物技術(shù)，如微流體、電泳、運動精子細胞器形態(tài)學(xué)檢查和雙折射減少了離心步驟，可以改善精子的篩選過程，獲得完整性更高的DNA、正常形態(tài)和運動性的精子，從而改進人工授精結(jié)果。

微流控平臺最早被用于改進輔助生殖技術(shù)中精子的質(zhì)量評估環(huán)節(jié)，微流控平臺特有的收縮性質(zhì)以及可以創(chuàng)建復(fù)雜通道和儲庫網(wǎng)絡(luò)的能力是評估運動精子活力的有用組合。早期裝置沒有整合活性流體流動，也沒能在流經(jīng)微流體通道期間利用流體的獨特物理特性，但它們確實為精子質(zhì)量評估提供了有潛力、可嘗試的平臺。近些年，隨著設(shè)計和制造工藝的進步，微流體在精子優(yōu)選中的應(yīng)用也在增加。

微流控裝置通?；谶\動能力和形態(tài)對精子進行分選，集成減少了傳統(tǒng)精子篩選步驟。微流體裝置研究表明，回收的精子樣本運動性幾乎達到了100%，同時精子的形態(tài)也得到了改善[7]。另一項研究所設(shè)計的層流篩選裝置基于精子活力進行篩選，出口處的精子活力從原始樣本的76.21%增加到95.24%[13]。有研究分析了流速和培養(yǎng)基表面形態(tài)對精子速度和功能的影響。女性生殖道包含天然微槽和向外流動的液體，有助于將精子引導(dǎo)至卵子[14]，這些微槽和流動的液體有助于篩選出活力良好的精子。有研究模擬女性生殖道的結(jié)構(gòu)設(shè)計了一種微流體裝置，該裝置將精子置于一端開口處，通過控制精子向另一端出口的流動，模擬精子在子宮微槽內(nèi)的運動。結(jié)果顯示，80%的精子以3 μL·min-1的流速對抗流動；此外，一旦精子進入微槽，就會被留在凹槽中并直線前進，沒有凹槽的通道中精子傾向于在沒有方向的情況下以曲線游泳，這一信息在將來可用于選擇直線游動的精子[15]。

2.2 微流控芯片在體外胚胎生產(chǎn)中的應(yīng)用

將微流體技術(shù)用于卵母細胞的體外成熟以及早期胚胎的培養(yǎng)時，需要設(shè)計可用于培養(yǎng)細胞的微流體裝置。卵母細胞的體外成熟和胚胎培養(yǎng)要考慮的主要問題是如何提高實驗最終的胚胎回收率，雖然在處理數(shù)十萬或數(shù)百萬個細胞時可以僅回收初始細胞群的一部分，但對于涉及卵母細胞和胚胎的研究，必然要求回收率達到100%。因此，微流控平臺必須使回收過程可控和準(zhǔn)確，同時不能改變微流體，有利于細胞培養(yǎng)的特性。此外，應(yīng)用微流體的額外精力和成本投入必須通過配子或胚胎的顯著收益來抵消，以證明該技術(shù)是可行的。目前，微流控平臺已經(jīng)開始接受胚胎學(xué)各個方面的初步測試，包括卵母細胞體外成熟(IVM)，體外受精(IVF)和胚胎培養(yǎng)(IVC)。

2.2.1微流控芯片在卵母細胞成熟中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的體外卵母細胞成熟培養(yǎng)低效且昂貴，而使用微流控芯片進行體外卵母細胞成熟，可以降低成本和降低對卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)等疾病的健康風(fēng)險。應(yīng)用于卵母細胞體外培養(yǎng)的第一個微流控裝置，微流體通道兩側(cè)是兩個固定的培養(yǎng)基儲庫，結(jié)果顯示，裝置中的豬卵母細胞并未達到有效成熟(2% metaphase II， MII)。然而，當(dāng)這些卵母細胞在PDMS(聚二甲基硅氧烷)裝置中成熟時，與對照微滴相比，它們以明顯更高的速率成熟(分別為2%和相對于MII的71%)[16]。這些研究在不同材料制造的類似設(shè)計裝置中進行，最終所得結(jié)果差異顯著，表明材料的選擇對敏感的卵母細胞至關(guān)重要。

利用微流控通道中液體的可流動性，改進了傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)裝置。一種利用磁力驅(qū)動的操縱器結(jié)合超聲振動進行單細胞操作的微流體裝置[17]，可以定向移動豬卵母細胞，并且在應(yīng)用于不同實驗?zāi)康臅r，可以進行程序修改。在此前，振動培養(yǎng)平臺已被證明可以提高豬卵母細胞的發(fā)育能力，但這僅適用于體積較大的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿。因此，如何利用微流體的特性、設(shè)計出更接近于體內(nèi)生殖道環(huán)境的培養(yǎng)平臺，模擬體內(nèi)的機械刺激和液體環(huán)境，是優(yōu)化體外卵母細胞成熟體系的關(guān)鍵。

2.2.2微流控芯片在體外受精中的應(yīng)用 因為精子的獨立運動距離存在闕值，精子運動路徑還可能受到裝置輪廓的影響，而精子的活動特征和精子在裝置中與卵母細胞的相互作用高度依賴于受精環(huán)境，體外受精成為了輔助生殖技術(shù)中相對困難的步驟。使用微流控芯片固定精子運動路線，限制精子數(shù)量，模擬體內(nèi)受精環(huán)境，從而提高受精效率是胚胎仿生學(xué)研究的重要目的。

使用置于PDMS(聚二甲基硅氧烷)/硼硅酸鹽微通道中的豬卵母細胞進行人工授精程序步驟，所得結(jié)果與對照微滴中的受精結(jié)果相比，該裝置顯著降低了多精入卵率，這得益于微流體裝置的物理特性，可以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境[2]。同時，該微流體裝置可用于限制卵母細胞暴露于精子的時間，因為精子不再局限于卵母細胞的附近，而是不斷游過卵子。有研究在微流體微孔陣列裝置上進行了受精實驗，與先前的裝置類似，平臺由PDMS制成并且構(gòu)造有入口和出口儲蓄池，其使用重力產(chǎn)生動力。從每個儲庫引出的微通道連接到更大的微室，其中設(shè)有用于捕獲單個卵母細胞的方形微孔，微孔深度可以在保留卵母細胞的同時去除細胞碎片及雜質(zhì)。培養(yǎng)液和精子可以流過容納卵母細胞的微孔，隨后在其中與卵母細胞發(fā)生受精。這種裝置與單孔微流控芯片相比，得到了相似的小鼠卵母細胞受精率(69.0%對71.4%)[18]。來自同一研究組的另一種設(shè)備，其設(shè)計不同，結(jié)合了多個程序步驟，也產(chǎn)生了有利的受精結(jié)果[19]。隨著技術(shù)的發(fā)展，其他微流體裝置還開發(fā)了將授精與其他程序步驟相結(jié)合的方法。

2.2.3胚胎體外培養(yǎng) 在已經(jīng)進行的用于優(yōu)化輔助生殖技術(shù)的研究中，微流控芯片在胚胎培養(yǎng)上的應(yīng)用被證明是有益的。Raty等[20]使用微流體進行胚胎培養(yǎng)的初步報告表明，2細胞小鼠胚胎可以在靜態(tài)微量培養(yǎng)基中培養(yǎng)至囊胚階段。與30 μL對照微滴相比，在含有約500 μL培養(yǎng)基的微通道內(nèi)培養(yǎng)，小鼠胚胎能夠在24 h發(fā)育成更大的桑椹胚，在48～72 h形成更大的胚泡，以及在72～96 h產(chǎn)生更多的胚泡。然而，該研究沒有評估對植入的影響。另有學(xué)者利用類似裝置進行了后續(xù)實驗，結(jié)果表明，體內(nèi)衍生的4細胞豬胚胎可以培養(yǎng)成囊胚，之后進行胚胎移植并成功產(chǎn)出胎兒[21]。

近年來，學(xué)者們?yōu)榱四M體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)胚胎，還開發(fā)了一種采用電介質(zhì)(electrowetting on dielectric，EWOD)電潤濕技術(shù)的新型數(shù)字化微流體裝置。結(jié)果表明，用EWOD驅(qū)動的動態(tài)培養(yǎng)可以操作含有一個小鼠胚胎的單個液滴并培養(yǎng)至胚泡期，胚胎孵化胚泡的速率顯著高于傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)物(P<0.05)。從EWOD芯片收集胚胎并轉(zhuǎn)移到假孕雌性小鼠體內(nèi)，得到了健康胎兒，證明EWOD芯片提高了小鼠胚胎的發(fā)育能力[4,22]。

3 利用微流控技術(shù)解決多精入卵問題

針對前文所述的豬多精受精原因以及微流控芯片在胚胎體外生產(chǎn)中的應(yīng)用優(yōu)勢，微流控技術(shù)能夠很好地解決多精受精，原因有三，分別是控制卵母細胞的成熟度、精子的有效分選以及改善體外受精的環(huán)境。

3.1 微流控體系提高了卵母細胞的體外成熟質(zhì)量

應(yīng)用微流控體系進行卵母細胞的體外成熟，與對照組傳統(tǒng)微滴培養(yǎng)法相比，應(yīng)用微流控體系以明顯更高的速率成熟(分別為2%和相對于MII的71%)[16]。其次利用微流控通道中液體的可流動性，改進了傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)裝置。牛體外受精的研究顯示，與靜態(tài)成熟的卵母細胞相比，在微流控體系成熟的牛卵母細胞受到層流影響，大大改善了IVM后的胚泡發(fā)育[17]，卵母細胞成熟質(zhì)量的提升無疑會大大減少多精入卵的機會。

3.2 微流控體系優(yōu)化精子的篩選過程

與正常的體內(nèi)受精相比較，體外受精中精子密度可能是影響多精受精的關(guān)鍵。而微流控體系能夠改變受精過程中的精卵比例；維持相對穩(wěn)定適宜的受精溫度和pH，這些措施可以在一定程度上降低多精入卵率。隨著對豬植入前胚胎發(fā)育調(diào)控的了解，以及新的分析方法和技術(shù)的出現(xiàn)，借助各種新型培養(yǎng)平臺探索外界環(huán)境條件改變對胚胎的影響，有助于進一步改善體外受精系統(tǒng)。

在微流控芯片的開發(fā)研究過程中發(fā)現(xiàn)，微流控裝置設(shè)計的通道結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生動態(tài)流體的機械刺激，同時模擬體內(nèi)微環(huán)境自分泌因子的分布，在微環(huán)境中的培養(yǎng)過程更類似于體內(nèi)環(huán)境，因此能夠更好地模擬精子與卵母細胞所在的生殖腔環(huán)境。通過設(shè)計與改造，有望消除引起豬體外生殖過程中多精受精產(chǎn)生的因素。同時，利用微流控芯片高通量進行精子篩選，并控制受精環(huán)境的精卵比，有助于降低多精入卵率。

利用微流控體系形成的層流效應(yīng)篩選精子的微流體精子分選儀(microfluidic spermsorter，MFSS)已經(jīng)被開發(fā)出來，可用于豬的IVF。在MFSS-IVF系統(tǒng)中使用公豬稀釋精液進行受精后，正常受精指數(shù)(單精受精與初始卵母細胞數(shù)量比)比傳統(tǒng)IVF更高，同時裝置中受精卵母細胞的發(fā)育能力(胚泡形成能力)高于傳統(tǒng)IVF?？傊贛FSS裝置中的豬卵母細胞與精子的簡短共培養(yǎng)提高了單精子受精的概率和胚胎的發(fā)育能力[23]。

4 微流控體系優(yōu)化體外胚胎的培養(yǎng)

在過去的20年里，改善體外胚胎發(fā)育的研究中涉及最多的變量是培養(yǎng)基的化學(xué)組成，這一條件的改變有助于減少多精受精，提高輔助生殖的成功率。然而，在解決多精入卵問題的研究中，不僅需要考慮發(fā)育中胚胎的化學(xué)需求，其潛在的生理需求也是所要考慮的重要因素。卵母細胞和胚胎通過雌性生殖道的過程不僅使其浸泡于化學(xué)成分變化的液體，而且還為其提供了溫和的機械刺激，這可能會影響卵母細胞和胚胎的發(fā)育。隨著對植入前胚胎的理解得到改進，新的分析方法和技術(shù)相繼出現(xiàn)，對于各種新型微流控培養(yǎng)平臺的研究，顯示出物理和機械環(huán)境改變可能進一步改善胚胎的體外發(fā)育。

4.1 基于靜態(tài)培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)體系

在過去哺乳動物和非哺乳動物體細胞系、轉(zhuǎn)化細胞系，配子和胚胎都是被培養(yǎng)在惰性材料中如玻璃或塑料聚合物。在這些細胞培養(yǎng)方法中，除了使用振動平臺或軌道攪拌器的外力振動方式外，所有的培養(yǎng)環(huán)境均被認為是靜態(tài)的?，F(xiàn)階段，靜態(tài)的微流控芯片已經(jīng)被開發(fā)用于胚胎培養(yǎng)，這些靜態(tài)培養(yǎng)平臺可以通過簡單地改變培養(yǎng)基的體積和成分，或改變每個培養(yǎng)基的胚胎數(shù)量來產(chǎn)生不同的培養(yǎng)環(huán)境。

已經(jīng)在實驗室中使用的商業(yè)化產(chǎn)品是一種微孔芯片，這種裝置可以對小鼠、豬和牛等動物的胚胎進行單獨培養(yǎng)。這些隔離的孔相互之間可以產(chǎn)生微流體通道，以達到介質(zhì)交換，這種連接的插入物可用于研究自分泌和旁分泌化合物對胚胎間的影響。這些微孔可以用PDMS精細地構(gòu)建，這一結(jié)構(gòu)能夠形成有益胚胎發(fā)育的微環(huán)境。另外，這些微孔可以使用生物分子材料，例如透明質(zhì)酸或氫氧化銨涂覆以形成水凝膠表面，這樣更加接近發(fā)育中的胚胎在體內(nèi)的環(huán)境[24]。

在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，微通道也可作為胚胎的培養(yǎng)裝置，在微通道中胚胎可以發(fā)育至囊胚階段。研究發(fā)現(xiàn)，在微通道培養(yǎng)72和96 h的胚胎分別觀察到囊胚形成和孵化胚泡的發(fā)育。使用填充有培養(yǎng)基的玻璃毛細管是進行胚胎的微通道培養(yǎng)研究的另一種方法，這個系統(tǒng)還支持從合子到囊胚階段的小鼠胚胎發(fā)育[25-26]。

雖然靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于卵母細胞的體外培養(yǎng)，但與體內(nèi)環(huán)境相比，靜態(tài)環(huán)境無法提供卵母細胞在子宮頸中所受到的擠壓力及變化的液體環(huán)境，卵母細胞的成熟狀態(tài)還不能得到完全控制。

4.2 基于動態(tài)培養(yǎng)的微流控體系

因為植入前胚胎在輸卵管和子宮中的生長階段是進行發(fā)育的最終環(huán)節(jié)，肌肉收縮和上皮細胞纖毛的運動使植入前體內(nèi)胚胎不斷移動，這會對發(fā)育中的胚胎產(chǎn)生機械性影響，這種運動也會改變細胞表面的化學(xué)物質(zhì)梯度，可以形成胚胎周圍環(huán)境的動態(tài)變化，這證明了動態(tài)培養(yǎng)體系的重要性。在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，由于胚胎分泌物或培養(yǎng)基成分耗竭，培養(yǎng)基中存在著化學(xué)濃度的變化，而動態(tài)培養(yǎng)平臺可以破壞這些梯度，提供更接近體內(nèi)生長環(huán)境的更均勻的環(huán)境。另外，動態(tài)的培養(yǎng)系統(tǒng)也為胚胎提供了一個流動的環(huán)境，不斷更新培養(yǎng)基質(zhì)和去除其代謝廢物。通過現(xiàn)代微流控技術(shù)可以解決這一問題，該技術(shù)可以為細胞創(chuàng)建一個動態(tài)的培養(yǎng)環(huán)境。

有研究首次描述了使用基于注射器的泵來產(chǎn)生流動培養(yǎng)基的動態(tài)胚胎培養(yǎng)方案[27]。微通道位于儲存池的底部，胚胎干細胞可以在微通道中靜止培養(yǎng)以促進它們在注射器泵活化之前的貼壁[28]。通常將諸如胚胎的非粘附細胞移入緊鄰微通道開口的儲庫底部，然后胚胎被動地進入微通道，并沿微通道向下滾動到微通道被半封閉的區(qū)域，此處形成屏障并且充當(dāng)微通道中胚胎的停止點，然后可以使用注射器泵在微通道中固定的胚胎上產(chǎn)生受控流體，Hickman等[29]應(yīng)用微流控體系使用這種系統(tǒng)來研究小鼠胚胎發(fā)育過程中微通道中流體流動的變化，研究開始強調(diào)流速、流動方式和胚胎周圍流體動力的交互作用。

2007年，名為“子宮芯片”的微流控裝置被開發(fā)制作，該裝置將子宮內(nèi)膜細胞與胚胎共培養(yǎng)在一個聯(lián)通裝置中。這種先進的系統(tǒng)已經(jīng)被用來改善小鼠胚胎發(fā)育[30-31]。之后一種新的微流控裝置被開發(fā)，用于對小鼠卵母細胞進行體外培養(yǎng)，并對成熟情況進行評價，該裝置主要評估卵母細胞受精至囊胚期的發(fā)育情況及其谷胱甘肽含量。結(jié)果顯示，被動和主動動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，成熟中期Ⅱ期卵母細胞(MII)的百分率明顯高于靜態(tài)組，被動組和主動動態(tài)組的生發(fā)泡(GV)和退化卵母細胞的平均數(shù)目明顯少于靜態(tài)組，同時動態(tài)成熟卵母細胞中谷胱甘肽含量顯著高于靜態(tài)成熟卵母細胞[32]。研究顯示，體外卵母細胞成熟的動態(tài)培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)條件相比，提高了卵母細胞的發(fā)育能力。

使用微流控裝置也可以實現(xiàn)在大型微孔陣列中高效捕獲單細胞的目的，當(dāng)前生物測定大多數(shù)是基于大細胞群體，其在多細胞反應(yīng)的過程中會失去重要的時間數(shù)據(jù)。這種捕獲裝置不依賴于細胞粘附，并且不需要龐大或昂貴的器具來將細胞保持在微孔中[33]。這一裝置為之后的單個卵母細胞處理提供了操作基礎(chǔ)，也可以進一步降低精卵比例，控制接觸卵母細胞的精子數(shù)量。

動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)的研究為解決多精入卵問題提供了新的方向，卵母細胞成熟過程中不同階段所需的不同化學(xué)因子可以通過動態(tài)系統(tǒng)精確控制，注射泵及層流效應(yīng)使卵母細胞所受外力更接近于體內(nèi)。而光學(xué)儀器與芯片的結(jié)合實現(xiàn)了卵母細胞的成熟過程及發(fā)育情況的全程監(jiān)控，從而可以選擇最優(yōu)成熟時期進行受精操作，有助于解決由于卵母細胞不完全成熟導(dǎo)致的多精入卵情況。

5 展望

微流控所具有的明顯優(yōu)勢使其成為改良輔助生殖技術(shù)的潛在手段，其操作規(guī)模小，只需要少量的精子樣本用于受精，而不會造成大量精子的浪費。同時該技術(shù)與生物光學(xué)的結(jié)合可以做到非侵入性的精子質(zhì)量檢測，減少篩選過程中的損失。微流控芯片采用的計算自動控制機程序可以實現(xiàn)不同時段胚胎發(fā)育情況的監(jiān)測和顯示，通過連續(xù)成像有助于進一步確認胚胎發(fā)育潛能。通過實現(xiàn)動態(tài)培養(yǎng)、胚胎單個捕獲等操作，微流控芯片還為可能進行的卵母細胞后續(xù)處理提供了操作基礎(chǔ)。該平臺接近于體內(nèi)受精與胚胎培養(yǎng)環(huán)境，并能方便地控制微觀條件下的培養(yǎng)，為研究人員解決豬體外受精中出現(xiàn)的多精入卵現(xiàn)象提供了更多研究可能。

豬體外受精中的多精受精一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究難點，借助微流控技術(shù)提供的實時精準(zhǔn)監(jiān)控評測技術(shù)，可能幫助解開豬多精受精的原因所在，為將來利用豬進行相關(guān)研究提供便利。但基于微流控技術(shù)的精子篩選及胚胎培養(yǎng)無法對大量樣本進行操作，對于需要大量材料的實驗，仍只能使用傳統(tǒng)方法。同時微流控平臺的復(fù)雜操作需要高度專業(yè)化的人員，在臨床環(huán)境中對于設(shè)備操作和結(jié)果分析仍有許多限制因素，因而大多數(shù)微流體裝置仍停留在臨床試驗階段，在獲得對ART影響結(jié)果前需要更多的信息，尚有許多困難等待解決，廣泛應(yīng)用仍需時日。