谷關(guān)假單胞菌脂肪酶基因PgLip1的克隆和表達(dá)

張冰玉, 蘇小運(yùn)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)是指催化三酯酰甘油水解的酶的總稱，是一類特殊的酯鍵水解酶[1]。其天然底物是長鏈脂肪酸酯，既可以在兩相系統(tǒng)(油、水界面)中起作用，也可以在水相中起作用。脂肪酶作為生物催化劑可催化由不同底物出發(fā)的水解和合成反應(yīng)，且反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少。因此，脂肪酶的應(yīng)用十分廣泛，如生物柴油[2-3]、食品行業(yè)[4-5]、醫(yī)藥衛(wèi)生[6-7]、飼料[8]、化學(xué)化工[9-11]、環(huán)境保護(hù)[12]等領(lǐng)域，已成為在生物技術(shù)和有機(jī)合成方面應(yīng)用最廣泛的一類酶。

脂肪酶來源十分廣泛，其中動(dòng)物、植物、微生物都能生產(chǎn)脂肪酶。微生物來源的脂肪酶種類多，與動(dòng)植物來源脂肪酶相比，有的微生物脂肪酶作用溫度范圍更廣、穩(wěn)定性更好、活性更高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此在工業(yè)領(lǐng)域更具有應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)作用溫度，脂肪酶可分為高溫、中溫和低溫脂肪酶[13]。與中高溫脂肪酶相比，低溫脂肪酶的作用溫度相對(duì)較低，具有低溫高催化活性和對(duì)熱敏感等特性，在食品、水產(chǎn)飼料、洗滌、脂類加工、有機(jī)合成以及低溫環(huán)境修復(fù)等方面有著廣泛的應(yīng)用前景[14]。

雖然已有一些低溫脂肪酶被發(fā)現(xiàn)、克隆和表達(dá)，但其數(shù)目仍然較少,且性質(zhì)較為單一。目前，假單胞菌是低溫脂肪酶最主要的來源[13]，假單胞菌來源的脂肪酶具有反應(yīng)活性高、穩(wěn)定性好、反應(yīng)類型多、有機(jī)溶劑耐受性好、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)，特別是在光學(xué)活性化合物的拆分與合成時(shí)具有較高的立體選擇性，因此具有巨大的挖掘潛力[15-17]。谷關(guān)假單胞菌(Pseudomonasguguanensis)是2013年新發(fā)現(xiàn)的一種假單胞菌。據(jù)報(bào)道，它可利用聚氧乙烯(20)山梨醇酐單月桂酸酯(吐溫-20)和聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫-80)作為單一的碳源生長，因此其基因組可編碼某種酯酶；該菌還能夠耐受高鹽離子濃度(7%)生長且具有豐富的酶系[18]，因此它所編碼的酶可能有一定的抗逆性。此外，Devi等[19]從關(guān)谷假單胞菌培養(yǎng)篩選出一種生物乳化劑，能乳化石油和柴油等，該菌在生物技術(shù)應(yīng)用上得到越來越多的關(guān)注。綜合以上信息，由于谷關(guān)假單胞菌也是假單胞菌屬的成員之一，也可能編碼脂肪酶?；诖?，本研究嘗試?yán)靡阎拈T多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)脂肪酶蛋白序列，本研究通過對(duì)谷關(guān)假單胞菌的基因組進(jìn)行同源基因搜索獲得了新的脂肪酶基因，豐富了低溫脂肪酶基因資源。進(jìn)而通過將該脂肪酶在大腸桿菌中重組表達(dá)并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的生化表征研究，發(fā)現(xiàn)獲得的脂肪酶在低溫下具有良好活性，表面活性劑對(duì)其活性有激活作用，且該酶在部分有機(jī)溶劑中高濃度處理時(shí)較低濃度下具有更高的酶活，本研究結(jié)果可為該脂肪酶在工業(yè)中的應(yīng)用提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1試驗(yàn)材料 大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans T1和Transetta(DE3)菌株均購于北京全式金生物科技有限公司，分別用于基因克隆、質(zhì)粒擴(kuò)增以及蛋白的重組表達(dá)。

1.1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；蛋白定量試劑盒購自北京全式金公司；蛋白Marker購于北京GeneStar生物公司；p-nitrophenyl acetate(pNPA)、p-nitrophenyl butyrate(pNPB)、p-nitrophenyl caprat(pNPC)、p-nitrophenyl laurate(pNPL)、p-nitrophenyl myristate(pNPM)、p-nitrophenyl palmitate(pNPP)和dimethyl sulfoxide(DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；其他未列出試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器 T100TM普通PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad公司；Synergy H1酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；himac CR-GII高速冷凍離心機(jī)購自日本HIMAC公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1脂肪酶PgLip1基因的篩選、克隆和載體構(gòu)建 使用RAST在線服務(wù)器(http://rast.nmpdr.org/)對(duì)谷關(guān)假單胞菌的基因組序列(NZ_FNJJ01000004.1)進(jìn)行自動(dòng)注釋。因來源于門多薩假單胞菌的脂肪酶性質(zhì)已經(jīng)得到較好的表征且已在生產(chǎn)中得到應(yīng)用[20]，將其氨基酸序列在RAST服務(wù)器中對(duì)谷關(guān)假單胞菌的基因組序列進(jìn)行BlastP分析，得到氨基酸序列一致性為92.6%，將該基因命名為Pseudomonasguguanensislipase1(PgLip1)。采用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)所編碼脂肪酶的信號(hào)肽。PgLip1的理論蛋白質(zhì)分子量以及等電點(diǎn)采用ExPASy-ProParam(https://web.expasy.org/protparam)來預(yù)測(cè)。

將PgLip1基因的密碼子根據(jù)大腸桿菌的偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化，送金斯瑞公司合成基因，使用NdeI和XbaI限制性內(nèi)切酶切割所獲得的基因，與pET-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有50 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取克隆后并進(jìn)行PCR鑒定。將所獲得的陽性克隆在含50 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并送測(cè)序，篩選陽性質(zhì)粒pET-PgLip1。

1.2.2PgLip1酶的表達(dá)和純化 將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-PgLip1轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞 Transetta(DE3)中，并將菌液涂布在同時(shí)含有50 μg·mL-1卡那霉素和25 μg·mL-1氯霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，待菌落長出后挑取單克隆接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。37 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，按2% 比例轉(zhuǎn)接于300 mL LB培養(yǎng)基以擴(kuò)大培養(yǎng)。37 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h至OD600為0.5時(shí)，加入300 μL濃度1 mol·L-1的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，將培養(yǎng)溫度降低至16 ℃，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 h。誘導(dǎo)后的菌液10 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀，將其重懸于pH 8.5的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中，使用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎。10 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。將上清液緩慢流加至預(yù)先平衡的鎳柱，用含20～400 mmol·L-1梯度咪唑的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液清洗非特異結(jié)合蛋白，最后用含500 mmol·L-1咪唑的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液洗脫目的蛋白。將洗脫蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳檢驗(yàn)，并對(duì)不含咪唑的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液進(jìn)行透析，獲得純化并脫鹽的重組脂肪酶。

1.2.3PgLip1的活性測(cè)定 使用牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bardford法[21]準(zhǔn)確定量PgLip1的蛋白濃度。脂肪酶的活性測(cè)定采用比色法，底物采用pNPM，脂肪酶水解pNPM釋放出pNP，通過測(cè)定410 nm的吸光度以判定pNP的釋放量。每組試驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)。在37 ℃ pH 8.0的條件下以每分鐘釋放出1 μmolpNP所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4PgLip1的酶學(xué)性質(zhì)研究 ①最適底物。將含有不同鏈長的對(duì)硝基苯酚酯類底物pNPA、pNPB、pNPC、pNPL、pNPM和pNPP(脂肪鏈分別含有2、4、8、12、14和16個(gè)碳原子)均配置成3 mg·mL-1的底物濃度，與PgLip1在37 ℃、pH 8.5的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中孵育15 min，以不加脂肪酶的反應(yīng)作為陰性對(duì)照，通過pNP的釋放，判定該酶的最適底物。

②最適pH和pH穩(wěn)定性。配制具有不同pH的緩沖液(pH 2.0～3.0：甘氨酸-鹽酸；pH 3.0～8.0：檸檬酸-磷酸氫二鈉；pH 8.0～9.0：Tris-HCl；pH 9.0～12：甘氨酸-氫氧化鈉)，設(shè)置pH 2、3、4、5、6、7、8、8.5、9、10、11、12共12個(gè)處理，濃度均為50 mmol·L-1。將0.4 μmol·L-1的PgLip1和0.084 mmol·L-1的pNPM底物，在上述不同pH的緩沖液中于37 ℃孵育15 min，測(cè)定催化底物生成pNP的能力。以酶活最高的pH作為最適pH并將此時(shí)的酶活設(shè)為100%；將其他pH條件下的酶活除以此酶活作為相對(duì)酶活。將0.4 μmol·L-1的PgLip1酶液在不同pH下37 ℃處理1 h，在最適條件下以同樣底物測(cè)定剩余酶活。以未孵育處理的酶作為對(duì)照并將其酶活設(shè)為100%，測(cè)定并計(jì)算酶在不同pH下的殘余相對(duì)活力。

③最適溫度和熱穩(wěn)定性。設(shè)置10、20、30、40、50 ℃共5個(gè)溫度，將0.4 μmol·L-1的PgLip1在最適pH(pH 8.5)、不同溫度和0.084 mmol·L-1的pNPM底物孵育反應(yīng)15 min，測(cè)定pNP的釋放，從而判定最適溫度。將酶活最高的反應(yīng)溫度下的酶活力設(shè)定為100%，將其他溫度下酶活除以此酶活獲得相對(duì)酶活。

將0.4 μmol·L-1的酶液分別在不同溫度(40～60 ℃)下保溫，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，在最適溫度和最適pH條件下同樣以pNPM底物測(cè)定殘余酶活。以未進(jìn)行熱處理的脂肪酶活作為100%，將處理后的殘余酶活除以此酶活獲得不同溫度、不同時(shí)間的相對(duì)酶活，用以檢測(cè)酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.5金屬離子對(duì)PgLip1活性的影響 選擇Ca2+、Cu2+、Mg2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+、Pb2+、Ag+、Cr3+、K+、Ni+和Co2+12種金屬離子，將0.4 μmol·L-1的PgLip1分別與5 mmol·L-1的不同金屬離子在pH 8.5、37 ℃孵育30 min，在最適pH和最適溫度下將酶和0.084 mmol·L-1pNPM底物孵育測(cè)定酶的相對(duì)活力。以未加金屬離子的反應(yīng)作為對(duì)照，將該酶活設(shè)定為100%，計(jì)算不同金屬離子處理的的相對(duì)酶活。

1.2.6表面活性劑、變性劑以及EDTA對(duì)PgLip1活性影響 選擇1%的Triton X-100、吐溫-20和吐溫-80三種表面活性劑，1%β-巰基乙醇和0.1% SDS兩種變性劑以及5 mmol·L-1EDTA，將0.4 μmol·L-1的PgLip1分別加入到以上不同溶液中，37 ℃孵育1 h，在最適pH 和最適溫度條件下以0.084 mmol·L-1的pNPM作為底物測(cè)定酶活。以未用上述任何試劑處理的酶液作為對(duì)照，將該反應(yīng)的酶活力設(shè)定為100%，計(jì)算判定表面活性劑、變性劑和EDTA對(duì)脂肪酶的影響。

1.2.7有機(jī)試劑對(duì)PgLip1活性影響 選擇丙酮、甲醇、乙醇、異戊醇、乙腈、異丙醇和乙酸乙酯共7種有機(jī)溶劑，將0.4 μmol·L-1的PgLip1酶分別加入10%、30%、50%終濃度的上述有機(jī)溶劑，在30 ℃下孵育1 h，在最適pH和最佳溫度條件下以0.084 mmol·L-1的pNPM作為底物測(cè)定脂肪酶的酶活。以未加有機(jī)試劑的反應(yīng)作為對(duì)照，將該反應(yīng)的酶活力設(shè)定為100%，計(jì)算不同有機(jī)溶劑處理的相對(duì)酶活。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值，采用SPSS 19.0軟件中的One-way ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，LSD和Duncan氏法進(jìn)行各組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶PgLip1基因的克隆和表達(dá)純化

對(duì)PgLip1基因分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長840 bp，預(yù)測(cè)編碼一個(gè)脂肪酶PgLip1，長度為279個(gè)氨基酸，與來源于門多薩假單胞菌的脂肪酶有92.6% 的相似性。SignalP分析發(fā)現(xiàn)，其N端22 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。去除信號(hào)肽的成熟脂肪酶PgLip1由257個(gè)氨基酸殘基組成，理論蛋白質(zhì)分子質(zhì)量27.4 kDa，理論等電點(diǎn)pI為9.0。重組PgLip1脂肪酶的SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖1)顯示，其表觀分子量為27.4 kDa，與預(yù)期蛋白分子量大小基本一致。

注：M—DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—純化PgLip1蛋白。

2.2 PgLip1的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1PgLip1的底物特異性 由圖2可知，谷關(guān)假單胞菌來源的重組脂肪酶PgLip1對(duì)于具有不同長度脂肪鏈的pNP底物均具有一定活性，能催化本研究選擇的含2～16個(gè)不同長度脂肪鏈的對(duì)硝基苯酚酯降解。該酶對(duì)pNPB的活性最高，比活達(dá)到27.5 U·mg-1，而對(duì)pNPA、pNPC、pNPL、pNPM和pNPP的比活分別為25.3、13.5、4.4、3.1和1.6 U·mg-1。對(duì)pNPB底物的PgLip1脂肪酶相對(duì)活力設(shè)定為100%，對(duì)碳鏈長度為2(pNPA)和8(pNPC)的pNP底物的酶活依次緩慢下降，其相對(duì)酶活分別為91.8%和49.1%；對(duì)碳鏈長度分別為12(pNPL)、14(pNPM)和16(pNPP)的pNP底物酶活則快速下降，其相對(duì)酶活分別為15.8%、11.1%和5.8%。

圖2 PgLip1對(duì)pNP底物的相對(duì)酶活

2.2.2PgLip1的穩(wěn)定性 以pNPM為底物時(shí)，pH對(duì)PgLip1脂肪酶活性的影響結(jié)果見圖3，可見，在50 mmol·L-1pH為8.5的Tris-HCl緩沖液中，PgLip1的脂肪酶活性最高，其比活達(dá)到3.1 U·mg-1。當(dāng)pH為8.0時(shí)，該酶的酶活為71.6%，而在pH為7.0時(shí)則迅速下降為4.0%。當(dāng)pH為9.0時(shí)，該酶有84.4%的活性，而在pH為10.0僅剩余3.8%的活性。在pH穩(wěn)定性方面，當(dāng)pH為3.0～12時(shí)，PgLip1酶的相對(duì)活性至少保持在60%以上，說明該脂肪酶具有較寬的pH耐受性。但在pH 3.0以下，該酶的酶活幾乎完全喪失。

由圖3可以看出，以pNPM為底物時(shí)脂肪酶PgLip1在10 ℃時(shí)的活性最高，因此其催化水解的最適溫度為10 ℃，此時(shí)酶活為4.2 U·mg-1，相對(duì)酶活為100%；但酶在0 ℃仍然具有60.5%的酶活，說明該酶是一個(gè)低溫脂肪酶，能在低溫下較好地降解底物。當(dāng)孵育溫度高于10 ℃時(shí)，該脂肪酶的酶活性開始逐漸下降。在20、30和40 ℃，其相對(duì)酶活分別為55.2%、42.1%和3.4%。將PgLip1脂肪酶在不同溫度分別孵育處理，發(fā)現(xiàn)該酶在40 ℃處理30 min仍然能保持93.0%相對(duì)酶活，繼續(xù)孵育至45 min其殘余酶活為72.1%。在50 ℃處理5 min后，殘余酶活為61.1%，繼續(xù)延長時(shí)間殘余酶活基本不變。60 ℃處理，酶活則迅速下降，30 min后酶活已基本完全喪失(7.1%)。

圖3 PgLip1的生化性質(zhì)分析

2.2.3金屬離子對(duì)PgLip1活性的影響 以pNPM為底物時(shí)金屬離子對(duì)PgLip1的影響結(jié)果見表1，可見，在含Pb2+、Co2+、Ca2+、Cu2+和Na+的溶液中，PgLip1相對(duì)比較穩(wěn)定，其活性分別為對(duì)照處理(酶活為2.9 U·mg-1，相對(duì)酶活100%)的102.8%、91.4%、97.5%、81.5%和78.7%。相反，Mg2+、Fe3+、K+、Cr3+、Zn2+、Ni+和Mn2+對(duì)脂肪酶PgLip1有抑制作用，在這些離子溶液中該酶的相對(duì)酶活分別為20.0%、48.7%、28.8%、37.5%、8.3%、10.9%和20.6%。

表1 金屬離子對(duì)PgLip1活性的影響

2.2.4表面活性劑及EDTA等變性劑對(duì)PgLip1活性的影響 以pNPM為底物時(shí)表面活性劑及EDTA等變性劑對(duì)PgLip1的影響結(jié)果見表2，可知，表面活性劑吐溫-20、吐溫-80和Triton X-100對(duì)PgLip1都有一定的促進(jìn)作用。在終濃度1%的表面活性劑吐溫-20、吐溫-80和Triton X-100的溶液中，PgLip1的酶活分別為對(duì)照處理(酶活為3.3 U·mg-1，相對(duì)酶活為100%)的316.7%、339.7%和589.0%。而當(dāng)溶液中含有5 mmol·L-1的金屬離子螯合劑EDTA、變性劑SDS和β-巰基乙醇時(shí)，PgLip1的相對(duì)酶活分別為184.6%、20.2%和102.4%。

表2 表面活性劑、EDTA等變性劑對(duì)PgLip1活性的影響

2.2.5有機(jī)試劑對(duì)Pglip1活性的影響PgLip1在不同濃度不同有機(jī)試劑中的酶活結(jié)果見表3。未加有機(jī)溶劑的對(duì)照酶活為4.7 U·mg-1，相對(duì)酶活為100%。可以看出，PgLip1對(duì)50%的異丙醇和異戊醇有良好的穩(wěn)定性。值得注意的是，在這兩種有機(jī)試劑中，其剩余酶活分別隨著有機(jī)試劑濃度的上升而增加，如在10%的異丙醇中酶活只有7.6%，但在30%的異丙醇中則為175.3%，而當(dāng)異丙醇的濃度為50%時(shí)，酶活增加至240.3%。同樣，在甲醇和乙醇中，雖然PgLip1的酶活均小于對(duì)照處理，但該酶的酶活也隨著兩種醇濃度的增加而上升。在丙酮、乙腈和乙酸乙酯中，PgLip1的酶活均有下降，且酶活并沒有隨著有機(jī)溶劑濃度的增加而上升。

表3 不同濃度不同有機(jī)試劑對(duì)PgLip1活性的影響

3 討論

本研究從谷關(guān)假單胞菌中克隆和重組表達(dá)了脂肪酶PgLip1，其最適培養(yǎng)溫度為10 ℃。在0 ℃ 時(shí)，相對(duì)酶活為60%，當(dāng)溫度大于10 ℃ 時(shí)酶活性急劇下降。劉滔滔等[22]報(bào)道的堿性脂肪酶的酶活在35 ℃急劇下降，45 ℃基本喪失；孫苗苗等[23]報(bào)道的假單胞菌脂肪酶也具有熱不穩(wěn)定的性質(zhì)，40 ℃酶活力快速失活，60 ℃酶活力基本喪失。Zhang等[24]篩選到一株P(guān)seudomonassp.7323低溫脂肪酶，其最適作用溫度為30 ℃，在25 ℃以上顯示出熱不穩(wěn)定性。PgLip1脂肪酶在40 ℃處理45 min能保持80%～100% 酶活力，50 ℃處理酶活力逐漸下降，60 ℃處理30 min酶活力喪失。可見，PgLip1脂肪酶具有熱敏感特性。當(dāng)溫度較高時(shí)酶活性急劇下降，是低溫酶的一個(gè)重要特征；而與中高溫脂肪酶相比，低溫脂肪酶有較低的活化能，在低溫條件下具有高酶活[25]，能維持低溫條件下的高催化效率。PgLip脂肪酶具有更低的最適溫度，同時(shí)在40、50 ℃仍具有相對(duì)較為耐熱的特點(diǎn)。這一特點(diǎn)可能與P.guguanensis是從溫泉中分離得到的有關(guān)[18]，所以具有一定的耐熱性。

據(jù)報(bào)道芽孢桿菌來源的脂肪酶在pH 6.0條件下處理60 min剩余50%酶活力[26]。曲威等[27]報(bào)道銅綠假單胞菌S8脂肪酶的最適pH為7.0，在pH 6.0～8.0時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，pH 4.0時(shí)剩余酶活力為50%。余瓊[28]報(bào)道假單胞菌(Pseudomonassp.)YT34-8脂肪酶在pH 5.0～10.0穩(wěn)定，但在pH 4.0和11.0條件下，剩余酶活力不足60%。本研究報(bào)道的PgLip1的最適pH為8.5，當(dāng)pH低于8.0或高于9.0時(shí)，酶活性明顯降低。在pH 3.0～12.0時(shí)，酶相對(duì)活性仍然保持在60%以上；在pH 9.0～10.0 時(shí)，酶活力較為穩(wěn)定；而當(dāng)pH低于3.0的極酸性環(huán)境下酶活才出現(xiàn)穩(wěn)定性的明顯下降。因此，穩(wěn)定的pH耐受性使PgLip1脂肪酶具有更好的應(yīng)用價(jià)值、更廣的應(yīng)用范圍。

PgLip1脂肪酶對(duì)含2、4和8個(gè)碳原子脂肪鏈的對(duì)硝基苯酚酯底物具有較高的催化活性，催化短鏈酯的活性高于含12、14和16個(gè)碳原子長鏈脂肪酯的活性。雖然部分脂肪酶優(yōu)先水解14碳以上的長鏈脂肪酸，但是低溫脂肪酶對(duì)含有3～10碳鏈甘油脂的催化效率更高，這可能與低溫脂肪酶的催化特性有關(guān)[29-31]。有文獻(xiàn)報(bào)道圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)脂肪酶、PseudomonasfluorescensPf0-1來源脂肪酶對(duì)短鏈(8碳以下)對(duì)硝基苯酚脂具有較高的特異性[32]，而也有報(bào)道[22]一株產(chǎn)堿假單胞菌堿性脂肪酶對(duì)8碳pNP底物具有較高活性，脂肪酶對(duì)短鏈酯的催化能力反映了脂肪酶豐富的生物多樣性。

金屬是影響酶活性的重要因素，對(duì)不同的酶，金屬和重金屬離子可能分別具有促進(jìn)或抑制脂肪酶活力的效果[33]。本研究中，Cu2+、Co2+、Na+、Ca2+和Pb2+金屬離子處理后，PgLip1保持相對(duì)穩(wěn)定性，酶活達(dá)到79%以上。在金屬離子中的穩(wěn)定性，使PgLip1在工業(yè)領(lǐng)域可以具有良好的應(yīng)用前景[34]。

脂肪酶PgLip1在濃度高達(dá)50% 的異丙醇和異戊醇有機(jī)溶劑中具有良好的穩(wěn)定性，其剩余酶活分別為240.3%和108.4%。據(jù)報(bào)道JXJ-54脂肪酶在三氯甲烷和乙醇中，酶活力隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增強(qiáng)，而在甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇四種有機(jī)試劑中，酶的活性隨著有機(jī)試劑濃度的增加而減小，在50%的乙醇和丙酮中，剩余酶活僅有5.3%和15.3%[35]。從有機(jī)試劑對(duì)脂肪酶PgLip1活性的影響結(jié)果來看，不同濃度的有機(jī)試劑對(duì)PgLip1脂肪酶活性的影響不同，其原因可能與有機(jī)溶劑的lgP值有關(guān)[35]。脂肪酶的結(jié)構(gòu)通常是整體親水，但其具有疏水的核心和親水的表面，其活性必須由具有一定極性的溶劑來維持，而有機(jī)溶劑則可能參與維持了脂肪酶核心的穩(wěn)定性。當(dāng)溶劑極性過低時(shí)，酶的結(jié)構(gòu)最終會(huì)被破壞，導(dǎo)致活性降低甚至失活[36]。脂肪酶PgLip1在有機(jī)溶劑中呈現(xiàn)的穩(wěn)定性，使其在基于非水相的催化反應(yīng)領(lǐng)域中具有較大的應(yīng)用潛力，比如食品、油脂、新型材料、精細(xì)化工、醫(yī)藥、化妝品和生物能源等[37]。

此外，PgLip1在吐溫-20、吐溫-80和Triton X-100等表面活性劑中都被激活，在Triton X-100中激活幅度甚至達(dá)到5.9倍。但相同濃度的表面活性劑，Triton X-100激活效果顯著優(yōu)于吐溫-80和吐溫-20。劉滔滔等[22]報(bào)道的假單胞菌脂肪酶受到吐溫-20、吐溫-80和TritionX-100強(qiáng)烈的抑制，而Liu等[32]報(bào)道PseudomonasfluorescensPf0-1來源的脂肪酶在TritonX-100、吐溫-20、吐溫-40和吐溫-80中的相對(duì)酶活達(dá)到110%、170%、160%、150%。因此，PgLip1受表面活性劑的激活程度優(yōu)于這些報(bào)道的脂肪酶。PgLip1受表面活性劑激活的原理在于表面活性劑具有雙親性，一端為親水基團(tuán)，另一端則為疏水基團(tuán)，它可以幫助維持酶的穩(wěn)定性。Carrasco-López等[38]指出，非離子型表面活性劑在低濃度時(shí)可以與脂肪酶的疏水活性中心產(chǎn)生相互作用，幫助脂肪酶穩(wěn)定在開放的構(gòu)象，有利于底物進(jìn)入活性中心以及產(chǎn)物的釋放，因此脂肪酶的活力得到提高。但對(duì)于陰離子表面活性劑SDS，其為常見的蛋白質(zhì)變性劑，其分子上的硫酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)表面的帶正電氨基酸可以緊密結(jié)合，而分子上的烷基則可以與蛋白質(zhì)的疏水部分緊密結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性[39]。

綜上所述，本研究從谷關(guān)假單胞菌中克隆得到一個(gè)新的低溫脂肪酶基因PgLip1，該酶具有嗜低溫特性、較好的耐溫性、寬泛的pH耐受性、對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性以及受表面活性劑激活的特殊性質(zhì)，這豐富了人們對(duì)脂肪酶生物多樣性的認(rèn)識(shí)；同時(shí)，PgLip1還可能在飼料行業(yè)如水產(chǎn)飼料以及工業(yè)應(yīng)用如洗滌劑、有機(jī)合成等領(lǐng)域存在著潛在的應(yīng)用價(jià)值。