耐輻射異常球菌黃嘌呤脫氫酶在氧化脅迫反應中的作用

陳曉楠, 高麗華, 周正富, 張維, 陳明

(中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所, 北京 100081)

眾所周知，過渡元素鉬是植物、動物和微生物的必需營養(yǎng)素。海洋中大量的鉬以陰離子形式存在。土壤中，鉬酸鹽陰離子是植物和細菌唯一可利用的鉬形態(tài)。鉬酶在生物地球化學氧化還原循環(huán)以及有機體代謝中具有關(guān)鍵作用[1]，根據(jù)鉬中心剩余配體的不同，鉬酶可分為AOR/XDH家族、亞硫酸鹽氧化酶家族和二甲基亞砜還原酶家族。同一鉬酶家族成員間具有明顯的序列相似性，不同家族成員間沒有明顯的同源性[2]。此類酶可在各種生理條件下以不同氧化態(tài)存在，具有多種功能，但都涉及氧化或還原反應。

黃嘌呤脫氫酶(EC 1.17.1.4, xanthine dehydrogenase，XDH)是一種古老、典型、復雜的鉬酶，已有100多年的研究歷史，是迄今為止被研究得最深入的單核鉬酶，也是目前發(fā)現(xiàn)的四種鉬酶之一[3-4]。該酶催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，黃嘌呤經(jīng)氧化為尿酸。此外，XDH還能催化雜環(huán)化合物嘌呤、喋呤和醛sp2雜環(huán)上碳原子的羥基化反應[5]。XDH由3個氧化還原中心結(jié)構(gòu)域組成：鐵硫簇([2Fe-2S])、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)和硫化鉬輔因子(molybdenum cofactor，Moco)。XDH的三個氧化還原中心構(gòu)成一個內(nèi)電子轉(zhuǎn)移鏈(electron transport chain，ETC)，在硫化鉬輔因子中心發(fā)生催化作用時，從底物中提取電子，然后轉(zhuǎn)移到鐵硫團簇的FAD上，最后轉(zhuǎn)移到電子受體NAD+上形成NADH。在電子還原反應中，反應體系的完整性必不可少[6]。XDH廣泛分布在真核生物、細菌和古細菌中，并且在各種細胞過程中發(fā)揮重要作用，參與嘌呤代謝,催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成酰脲類物質(zhì),且與氮同化、激素代謝、衰老的調(diào)控及活性氧產(chǎn)生等過程相關(guān)。

1902年，Schardinger[3]首次證明新鮮牛奶XDH可氧化甲醛，開啟了XDH結(jié)構(gòu)和功能的研究。1960年，Bradshaw和Barker[7]首次從梭狀芽胞桿菌中純化出細菌中XDH，隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多XDH被發(fā)現(xiàn)[8-11]。但僅對少量的XDH進行了功能研究，如在固氮菌苜蓿中華根瘤菌中發(fā)現(xiàn)了與饑餓相關(guān)的XDH，在天藍色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了在應激反應過程中維持GTP穩(wěn)態(tài)的XDH等[12-13]。至今，仍有很多XDH尚未被鑒定，它們的生理功能不詳。

耐輻射異常球菌(D.radioduransR1)是目前已知物種中輻射、氧化抗性較強的生物[14-16]。D.radioduransR1基因組分析顯示，該菌含有完整的黃嘌呤脫氫酶基因簇，即鐵硫簇([2Fe-2S])編碼基因DR_A0233(xdhA)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)編碼基因DR_A0232(xdhB)和硫化鉬輔因子(Moco)編碼基因DR_A0231(xdhC)。已報道的黃嘌呤脫氫酶均涉及氧化或還原反應，因此，推測D.radioduransR1黃嘌呤脫氫酶在氧化脅迫抗性過程中發(fā)揮重要作用。本研究構(gòu)建了黃嘌呤脫氫酶鐵硫亞基編碼基因xdhA的缺失突變株(ΔxdhA)，分析其在氧化脅迫條件下的表達情況，以及菌株的生存率和總抗氧化能力，探索黃嘌呤脫氫酶在氧化脅迫反應中的功能，為充分了解耐輻射異常球菌氧化脅迫抗性及其機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1菌株及培養(yǎng)條件 耐輻射異常球菌R1野生型由本實驗室保存；高頻轉(zhuǎn)化受體菌株大腸桿菌E.coliTop10購自康為世紀公司；pRADZ3質(zhì)粒由本實驗室保存。

大腸桿菌用LB培養(yǎng)基(10 g·L-1胰蛋白胨、5 g·L-1酵母提取物、10 g·L-1氯化鈉，固體培養(yǎng)基含15 g·L-1瓊脂)在37 ℃下培養(yǎng)；耐輻射異常球菌用TGY培養(yǎng)基(10 g·L-1胰蛋白胨、5 g·L-1酵母提取物、1 g·L-1葡萄糖，固體培養(yǎng)基含15 g·L-1瓊脂)在30 ℃下培養(yǎng)。突變株在含有卡那霉素(Km)的TGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？股乜敲顾?Km)和氯霉素(Cm)終濃度分別為50 μg·mL-1和17 μg·mL-1。

1.1.2主要試劑 T4-DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，RNA消化反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Magen公司，Taq酶及SYBR Green Mix購自Vazyme公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Magen公司，RNA提取試劑盒購自Analytik Jena公司?？偪寡趸芰z測由碧云天公司完成。基因測序及引物(表1)合成均由華大基因完成。

表1 PCR擴增所用引物

1.2 試驗方法

1.2.1xdhA基因的生物信息學分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得D.radioduransR1的xdhA基因(NC_001264.1)及蛋白(Q9RYS5)序列信息；使用KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)查看并分析xdhA基因參與調(diào)控的代謝途徑及發(fā)揮功能的相關(guān)基因；利用Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)以及Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫在線比對與XdhA蛋白相似性較高且已確定功能的蛋白，初步判斷該蛋白所屬的家族及其生理功能。

1.2.2缺失突變株和回補株構(gòu)建 構(gòu)建各菌株所需引物如表1所示。根據(jù)xdhA及其上下游序列、pKatAPH3以及pRADZ3載體序列設(shè)計所用引物，同時利用DNAMAN軟件分析xdhA及pRADZ3內(nèi)存在的酶切位點。

采用融合PCR法構(gòu)建xdhA缺失突變株：以D.radioduransR1基因組DNA為模板，利用引物xdhA-U-F/R擴增xdhA上游序列xdhA-U(304 bp)；利用引物xdhA-D-F/R擴增xdhA下游序列xdhA-D(350 bp)。以pKatAPH3質(zhì)粒為模板，利用引物Km-F/R擴增抗性盒序列Km(920 bp)。將擴增產(chǎn)物分別回收純化后進行融合PCR，以等摩爾質(zhì)量的三個片段為模板，利用引物xdhA-U-F和xdhA-D-R進行擴增，得到融合片段UKD。融合PCR反應體系：2×Mix 25 μL，模板xdhA-U 2 μL，模板Km 2 μL，模板xdhA-D 2 μL，引物xdhA-U-F和xdhA-D-R各1 μL，ddH2O 17 μL。融合PCR反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，10個循環(huán)；暫停，冰上添加引物，反應繼續(xù)；96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃保溫。純化后的融合片段轉(zhuǎn)化野生型D.radioduransR1，用含Km的抗性培養(yǎng)基進行篩選，隨后進行PCR驗證。以突變株基因組為模板，利用引物YZ-F/R，Km-F/R分別擴增融合片段和Km抗性盒片段，同時設(shè)置野生型D.radioduransR1基因組為對照。

采用質(zhì)粒回補的方式構(gòu)建回補株cmxdhA：以D.radioduransR1基因組為模板，利用引物xdh-SpeI-F、xdh-BamHI-R擴增xdhABC基因簇Pcm(3 820 bp)，回收純化后進行酶切連接，構(gòu)建重組載體Pcm-Z3,轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行富集，隨后將從大腸桿菌中提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xdhA缺失突變株。用含Km、Cm的抗性平板進行篩選，并進行PCR驗證。以回補株基因組DNA為模板，利用引物Z3-F/R、xdhA-F/R以及Km-F/R(表1)擴增片段，同時設(shè)置野生型D.radioduransR1基因組和突變株ΔxdhA基因組作為對照。得到回補株，命名為cmxdh。

1.2.3熒光定量PCR 生長到穩(wěn)定期的野生型菌株D.radioduransR1轉(zhuǎn)接到新鮮的200 mL TGY液體培養(yǎng)基中，初始OD600為0.1，30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)初期(OD600=0.6～0.8)。菌液中加入相應體積的30% H2O2，使其終濃度為80 mmol·L-1，避光處理30 min。將菌液轉(zhuǎn)移到無菌的50 mL離心管中，4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，PBS(0.24 g·L-1KH2PO4，1.44 g·L-1Na2HPO4，8 g·L-1NaCl，0.2 g·L-1KCl，pH 7.4)洗滌菌體。隨后將菌體用等體積新鮮的TGY培養(yǎng)基重懸，30 ℃、220 r·min-1孵育，每隔1 h收集菌體。

為分析xdhA基因缺失對氧化脅迫抗性相關(guān)基因表達的影響，依照上述方法處理D.radioduransR1、ΔxdhA菌株，同時設(shè)置不添加H2O2的對照。4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，利用試劑盒提取總RNA，消化反轉(zhuǎn)為cDNA，利用實時熒光定量PCR，對氧化脅迫條件下基因表達情況進行分析。

1.2.4腺嘌呤及甲醛毒性檢測 將活化野生型D.radioduransR1及突變株ΔxdhA分別按照OD600為0.1轉(zhuǎn)接到加入相應抗性的20 mL新鮮TGY培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。將菌液轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中，4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min收集菌體；隨后用PBS洗滌菌體(兩次)。用基本培養(yǎng)基重懸菌體，按照OD600為0.1將菌懸液轉(zhuǎn)接到基本培養(yǎng)基或添加0.1%腺嘌呤的基本培養(yǎng)基中(每個樣品設(shè)置三個重復)，使得初始OD600為0.1。30 ℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定OD600值。

檢測甲醛毒性的過程與檢測腺嘌呤毒性的過程相似，用PBS洗滌菌體后，用20 mL 0.1×TGY重懸。按OD600為0.1將菌懸液轉(zhuǎn)接到0.1×TGY或添加甲醛(400 μmol·L-1)的0.1×TGY中，用芬蘭BioScreenC全自動生長曲線分析儀(Oy Growth Curves Ab Ltd)對其生長趨勢進行測定，每個樣品設(shè)置4個重復。

1.2.5菌株生存能力及總抗氧化能力測定 培養(yǎng)到穩(wěn)定期的野生型D.radioduransR1、突變株ΔxdhA、回補株cmxdh按OD600為0.1分別轉(zhuǎn)接到新鮮無抗生素的100 mL TGY液體培養(yǎng)基中，待其生長到對數(shù)初期(OD600=0.6～0.8)進行能力測定。①菌株生存能力：分別取1 mL菌液，4 000 r·min-1離心5 min收集菌體，隨后用1 mL PBS重懸。避光條件下，分別加入相應體積的30% H2O2，使其終濃度為60 mmol·L-1。30 ℃、220 r·min-1避光處理30 min。設(shè)置不添加H2O2溶液的CK組作為對照。處理后的菌液進行倍比稀釋(100 μL菌液+900 μL 1×PBS)，至10-5。充分混勻，每個梯度取菌液8 μL，按順序點在TGY固體培養(yǎng)基上，每個樣品平行三次，30 ℃、220 r·min-1倒置培養(yǎng)2～3 d后對比生長狀況，判斷菌株的生存能力。②總抗氧化能力測定：避光條件下，分別加入相應體積的30% H2O2使其終濃度分別為80 mmol·L-1。設(shè)置不添加H2O2溶液的CK組作為對照。30 ℃、220 r·min-1避光處理30 min后4 ℃離心收集菌體。收集的菌體用5 mL PBS重懸，隨后利用超聲細胞破碎儀進行細胞破碎，直至溶液澄清。離心除去殘渣，回收上清，考馬斯亮藍法[17]測定上清中總蛋白濃度。

1.2.6數(shù)據(jù)分析 相關(guān)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)分析；用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 xdhABC基因簇組成分析和鑒定

KEGG結(jié)果顯示，xdhABC基因簇(DR_A0233、DR_A0232、DR_A0231)編碼功能性XDH。Blast與Uniprot在線預測結(jié)果顯示，XdhC蛋白與天藍色鏈霉菌XDH蛋白鉬結(jié)合亞基具有53%的相似性(41%)，XdhB蛋白與黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合亞基具有60%的相似性(51%)，XdhA蛋白與[2Fe-2S]結(jié)合亞基具有71%的相似性(58%)。預測結(jié)果顯示，xdhABC基因簇編碼功能性黃嘌呤脫氫酶。

利用在線工具Biocy對三個基因間關(guān)系進行分析，預測xdhABC三個基因位于同一操縱子，為確認三者間存在共轉(zhuǎn)錄關(guān)系，以野生型D.radioduransR1基因組及cDNA為模板，設(shè)計跨基因引物對xdhA、xdhB和xdhB、xdhC間序列進行擴增，結(jié)果(圖1B)顯示，在不同模板中兩段序列都能擴增出來，表明xdhA與xdhB、xdhC三個基因間存在共轉(zhuǎn)錄關(guān)系。

注：黑色方框表明與參考基因的相似性在70%以上，灰色的方框表示與參考基因的相似性為50%～60%。M為Trans2K Plus Ⅱ marker；甬道1、4、7: D.radiodurans R1基因組為模板；甬道2、5、8: D.radiodurans R1 cDNA為模板；甬道1、2: 驗證xdhB、xdhC間是否共轉(zhuǎn)錄；甬道3、6：陰性對照，以H2O為模板；甬道4、5：陰性對照；甬道7、8：驗證xdhB、xdhA間是否共轉(zhuǎn)錄。

2.2 xdhA基因的生物信息學分析

進一步對同一操縱子xdhABC的三個基因的轉(zhuǎn)錄表達進行分析，結(jié)果表明，野生型菌株D.radioduransR1中xdhABC相對表達量無明顯差異，ΔxdhA菌株中，xdhBC幾乎不表達(圖 2)，由于xdhA片段被Km抗性盒替換，而Km抗性盒上游啟動子的轉(zhuǎn)錄方向與xdhABC的轉(zhuǎn)錄方向相反，從而造成xdhBC基因簇均無表達。因此，敲除xdhA基因，導致xdhABC基因簇不能表達，即ΔxdhA菌株不能形成XdhABC蛋白。

圖2 xdhABC基因簇相對表達量

采用質(zhì)粒回補的方法構(gòu)建xdhA的回補株cmxdh，利用酶切連接的方法構(gòu)建重組載體Pcm-Z3，該載體包含完整的xdhABC基因序列。Km抗性盒鑒定結(jié)果表明，在cmxdh基因組中存在Km抗性盒基因；載體上引物Z3-F/R擴增結(jié)果顯示回補株cmxdh基因組中重組載體的存在。以上結(jié)果表明,帶有目的片段的質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入ΔxdhA中，獲得回補株cmxdh。

2.3 xdhA基因缺失菌株對腺嘌呤及甲醛敏感性分析

為研究xdhABC編碼蛋白的功能，本研究嘗試在大腸桿菌中表達該蛋白，并獲得三條大小相符的蛋白帶，但未能測定到相應酶活。由于黃嘌呤脫氫酶可催化嘌呤及簡單醛類的降解，對醛類物質(zhì)具有一定的解毒作用。因此，本研究通過體內(nèi)實驗來探究xdhABC編碼蛋白的功能。結(jié)果(圖3)表明，基本培養(yǎng)基中添加0.1%腺嘌呤時，菌株的生長明顯受到抑制，野生型與突變株間具有差異；添加甲醛后ΔxdhA生存能力下降，16 h時到達穩(wěn)定期，隨后細胞逐漸死亡；而野生型D.radioduransR1生存能力較突變株強，32 h時到達穩(wěn)定期。以上結(jié)果說明，xdhA缺失導致細菌對外源性腺嘌呤及甲醛的敏感性，該操縱子xdhABC編碼蛋白參與嘌呤代謝及甲醛解毒過程，符合前面預測的結(jié)果，即xdhABC基因簇編碼功能性黃嘌呤脫氫酶。

A：基本培養(yǎng)基中生長曲線；B：基本培養(yǎng)基添加腺嘌呤后生長曲線；C：0.1×TGY培養(yǎng)基中生長曲線；D：0.1×TGY培養(yǎng)基中添加400 μmol·L-1甲醛后生長曲線。

2.4 氧化脅迫條件下基因表達水平分析

非生物脅迫條件下目的基因的相對表達水平如圖4所示，氧化處理孵育兩小時xdhA的表達量達到最大，較未孵育前上調(diào)約7倍，隨后降低至未孵育前的水平。表明xdhA基因的表達受到氧化脅迫條件的誘導。

過氧化氫酶、超氧化物歧化酶以及過氧化物酶等均在D.radioduransR1發(fā)揮氧化脅迫抗性中具有重要作用。上述結(jié)果表明，xdhA基因在D.radioduransR1的抗氧化機制中具有功能，參與氧化脅迫抗性相關(guān)基因表達情況(圖4)表明，xdhA基因的缺失使得氧化脅迫相關(guān)基因的表達量發(fā)生不同程度的下調(diào)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DrRRA下調(diào)幅度較小。

圖4 H2O2處理30 min后不同孵育時間xdhA基因及氧化脅迫相關(guān)基因的表達情況

2.5 xdhA基因缺失菌株對氧化脅迫抗性分析

為研究氧化脅迫條件下XDH的功能，對野生型D.radioduransR1、突變株ΔxdhA、回補株cmxdh進行了H2O2沖擊試驗及總抗氧化能力測定實驗。從圖5可以看出，在正常培養(yǎng)條件下(不添加H2O2)，D.radioduransR1、ΔxdhA、cmxdh生長保持一致；60 mmol·L-1H2O2處理30 min后，突變株ΔxdhA的氧化耐受能力較野生型D.radioduransR1減弱2個數(shù)量級，回補株cmxdh可以完全恢復突變株的氧化抗性。在未處理條件下，各菌株細胞內(nèi)總抗氧化能力沒有明顯的差別；而經(jīng)氧化處理后，野生型D.radioduransR1、突變株ΔxdhA以及回補株cmxdh菌體的總抗氧化能力均有所下降，其中突變株ΔxdhA總抗氧化能力明顯減弱。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

由此可見，xdhA基因缺失使得菌株對氧化脅迫更加敏感。表明xdhA基因的缺失使得細菌的氧化脅迫抗性減弱，推測黃嘌呤脫氫酶在D.radioduransR1超強氧化脅迫抗性機制中發(fā)揮重要作用。

3 討論

Xi等[18]對大腸桿菌黃嘌呤脫氫酶功能研究表明，xdhA對于XDH產(chǎn)生活性是必要的。Moco中心產(chǎn)生的底物羥基化后產(chǎn)生的電子通過2Fe-2S到達FAD，隨后在FAD位點將電子轉(zhuǎn)移到NAD+形成NADH[19]，電子傳遞過程需要整個電子傳遞鏈的完整性。本研究在進行回補株構(gòu)建時發(fā)現(xiàn)，僅用xdhA基因進行回補時，不能恢復ΔxdhA氧化脅迫抗性，其細胞總抗氧化能力與ΔxdhA相當；而用含有完整的xdhABC基因進行回補ΔxdhA，能完全恢復突變株氧化脅迫抗性的表型，其細胞的總抗氧化能力與野生型菌株無差異。表明在耐輻射異常球菌中，xdhA是黃嘌呤脫氫酶活性所必需的，完整的xdhABC基因簇的產(chǎn)物共同構(gòu)成一個完整的黃嘌呤脫氫酶，發(fā)揮其功能。

細菌黃嘌呤脫氫酶具有廣泛的底物特異性，能夠氧化各種嘌呤和醛類化合物。黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的反應是嘌呤分解代謝的第一步[18,20]。黃嘌呤脫氫酶缺失突變的菌株不能正常代謝嘌呤，使腺嘌呤合成鳥嘌呤核苷酸途徑受阻，導致細胞對腺嘌呤產(chǎn)生敏感性[21]。醛類化合物對細胞具有毒害作用，包括化學損傷、對細胞糖酵解和發(fā)酵過程的直接抑制以及質(zhì)膜損傷[20]。黃嘌呤脫氫酶能氧化醛類化合物，有效降低醛類化合物對細胞的毒害作用。本研究結(jié)果顯示，xdhA基因缺失導致細菌對外源性腺嘌呤及甲醛的敏感性，表明基因xdhA編碼的蛋白參與嘌呤代謝及甲醛解毒過程，其與xdhBC編碼的蛋白組成的酶具有黃嘌呤脫氫酶的特性。

黃嘌呤脫氫酶是一種高度保守的管家酶，嘌呤類底物氧化產(chǎn)生的尿酸可作為ROS清除劑來維持氧化還原的穩(wěn)態(tài)[22]。尿酸是一種高效的活性氧清除劑，可清除細胞內(nèi)羥基自由基、超氧陰離子和單態(tài)氧，被認為是生物重要的抗氧化劑[23-24]。尿酸也可能有助于D.radioduransR1抵抗高水平氧化應激[25-26]。SOD暴露于H2O2時由于產(chǎn)生SOD-Cu-·OH而被滅活，生理水平的尿酸可以保持SOD酶的活性，阻止氧自由基的產(chǎn)生[24]。本研究結(jié)果顯示，編碼黃嘌呤脫氫酶鐵硫亞基的xdhA基因的缺失導致菌株對腺嘌呤、甲醛及H2O2脅迫敏感，同時導致菌株細胞內(nèi)總抗氧化能力下降。推測D.radioduransR1黃嘌呤脫氫酶通過嘌呤代謝途徑產(chǎn)生尿酸抑制氧自由基形成，并維持SOD酶的活性，提高細胞氧化脅迫抗性。此外，轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果顯示，在氧化脅迫條件下，xdhA基因的缺失導致參與氧化脅迫反應重要的酶和轉(zhuǎn)錄因子，如過氧化氫酶基因(katE)、過氧化物酶基因(pod)及超氧化物歧化酶(sod)表達發(fā)生明顯的下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子DrRRA表達量也有較小幅度的下調(diào)。xdhA基因產(chǎn)物是黃嘌呤脫氫酶氧化還原中心重要的組成部分，其缺失直接影響嘌呤代謝途徑。同時xdhA基因缺失可能通過未知的途徑間接地影響到氧化脅迫反應相關(guān)基因的表達，其作用機制尚需進一步研究。