高通量測序鑒定中間錦雞兒干旱條件下的microRNA

蘇雨萌, 張旭婷, 特日格樂, 田敏, 尚曉蕊, 李國婧, 王瑞剛

(內蒙古農業(yè)大學生命科學學院, 植物逆境生理與分子生物學自治區(qū)重點實驗室, 呼和浩特 010018)

中間錦雞兒(CaraganaintermediaKuang)是豆科錦雞兒屬荒漠多年生灌木，分布于中國西部、西北和內蒙古的沙質草原和荒漠地區(qū)，在固沙、保土、保水等方面發(fā)揮著重要作用，具有很高的飼用和生態(tài)價值[1]。因其具有較強的抗旱抗鹽能力，中間錦雞兒被認為是闡明對非生物脅迫耐受機制的理想植物。近年來對其分子響應機制的研究日益增多，一些轉錄因子如NAC[2]、MYB、WRKY[3]和bHLH[4]被鑒定。microRNA(miRNA)是植物體內普遍存在的一類內源性單鏈20～24 nt非編碼RNA，作為mRNA表達的關鍵調控因子之一，在植物的基因調控、發(fā)育過程和應激反應中起著重要作用[5]。干旱作為重要的非生物脅迫之一，目前，針對miRNA響應干旱脅迫研究已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycinemax)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、煙草(Nicotianatabacum)等植物中有相關報道[6-7]。miRNAs在植物適應干旱脅迫中起著重要的作用，一些miRNA通過調節(jié)酶的代謝和與轉錄因子相互作用來適應干旱環(huán)境[8-10]。因此，對中間錦雞兒抗旱相關miRNA的鑒定可為進一步闡明抗旱分子機制和錦雞兒屬及豆科植物遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和干旱處理

選取同一株植物的中間錦雞兒種子，播種于營養(yǎng)土與蛭石(1:3)中，在光照16 h/黑暗8 h，晝夜溫度22～25 ℃的生長室中培養(yǎng)30 d，選取生長狀態(tài)一致的中間錦雞兒小苗，從培養(yǎng)缽中取出，盡量避免損傷和刺激，置于原培養(yǎng)環(huán)境中進行干燥脫水處理，處理0(對照Drought_0h)、1(Drought_1h)、3(Drought_3h)、12 h(Drought_12h)，每個時間點取6株植物，收集對照及脫水處理樣品地上部分(莖和葉)于液氮速凍后存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 small RNA文庫構建和測序

用單步酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法[11]提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性，并用超微量核酸蛋白分析儀定量檢測RNA的濃度。對照和干旱脅迫處理1、3、12 h后，從莖葉中得到4份sRNA樣品，取3 μg總RNA用 Balancer NGS Library Preparation Kit試劑盒(GnomeGen)構建small RNA cDNA文庫，并送武漢ABLife科技有限公司使用Illumina GAIIx進行測序。

1.3 miRNA分類鑒定

首先，剔除低質量測序片段、接頭序列以及原始數(shù)據(jù)中低于16 nt的片段，獲得clean reads。然后，利用Rfam數(shù)據(jù)庫通過BLASTn搜索，獲得四份樣本的長度分布以及共有和特有的序列信息，得到rRNA、tRNA、sRNA、snRNA、lncRNA和miRNA。

讀取滿足miRNA預測原則的有效長度，然后利用BLASTn與miRBase數(shù)據(jù)庫中已知植物的miRNA進行比對；用miRDeep2軟件預測新的miRNA前體能否形成莖環(huán)結構，是否具有較低的自由能MFE(minimal free energy)和較高的自由能指數(shù)MFEI(minimal free energies index)，篩選新miRNA[16]。通過比較對照和每個干旱處理中miRNA的reads讀數(shù)進行差異分析，以P值≤0.05，差異倍數(shù)(fold change)≥1.5 或≤0.67為標準，篩選差異表達的miRNA。

1.4 miRNA靶基因預測

新預測到的miRNA與中間錦雞兒干旱脅迫轉錄組數(shù)據(jù)通過psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis?function=3.)進行靶基因預測，并通過ATIR(ArabidopsisthalianaL, transcript, removed miRNA gene, ATIR)預測新miRNA在擬南芥中的靶基因，預測規(guī)則如下：不允許超過3堿基的錯配，互補長度為20 bp以上，中心錯配范圍在9～11 nt。

2 結果與分析

2.1 中間錦雞兒miRNA的深度測序與鑒定

為了鑒定干旱脅迫下中間錦雞兒抗旱相關的miRNA，構建了對照和三種干旱處理的small RNA文庫，測序后從4個文庫中共獲得5.51、7.60、7.91和6.19 M的原始數(shù)據(jù)，去除低質量測序片段，接頭序列和小于16 nt的序列，共有4.95、7.09、7.28 和5.97 M clean data(表1)，比例均在89%～96%之間。利用BLASTn將small RNA序列與Rfam數(shù)據(jù)庫比對，比對到的序列比例占14%～22%，miRNA在四個small RNA文庫含量在0.62～0.93 M，大部分有效長度為24 nt，符合miRNA的特點。

表1 中間錦雞兒small RNA測序及clean reads分類注釋結果

2.2 中間錦雞兒中保守的miRNA

通過比較，共鑒定到88個保守的miRNA，來源于33個miRNA家族(圖1)，MIR156家族最大，有12個成員，MIR166、MIR159 和MIR172分別有9、6和5個成員。然而，在MIR158、MIR404、MIR408、MIR832和MIR846家族只有很少的成員，不同的miRNA家族表達差異很大，MIR159 和 MIR396家族有一個非常高的表達，其中cin-miR396a 的表達量在對照組高達535 725 reads。

圖1 保守miRNA家族成員數(shù)量

2.3 中間錦雞兒中新的miRNA

除了鑒定中間錦雞兒中保守的miRNA，遵循植物miRNA的注釋標準，鑒定出28個新的miRNA(表2)，他們的前體序列能形成二級發(fā)夾結構，MFE值在-58.40～-19.88 kcal·mol-1之間，MFEI值0.68～1.79，新miRNA的表達量較保守miRNA低(圖2)，cin-novel-25的表達量最高，在對照組中也僅有1 952 reads。表明中間錦雞兒中的miRNA大多是保守的，且家族成員分布與其他報道物種一致，保守的較新的miRNA表達量高。

圖2 中間錦雞兒中新miRNA表達量

表2 中間錦雞中的新miRNA

28個新miRNA的聚類表達譜如圖3所示，結果表明，每個miRNA在生物學特性之間具有相似性，干旱處理12 h在一個分支上，與對照相比，1和3 h干旱脅迫處理具有更多的差異表達miRNA，推測干旱處理12 h是中間錦雞兒干旱響應的極值。干旱處理1和3 h在同一分支上，這兩個實驗組有較多的相同表達的miRNA。28個新miRNA被分為3組，其中cin-novel-25、cin-novel-3、cin-novel-2和cin-novel-5在前兩組，這4個miRNA在對照組和3個干旱處理組中的表達最高，在第三組是表達量相對較低的一些miRNA，cin-novel-26在干旱脅迫處理3 h時表達水平顯著高于其他處理，而在對照、干旱脅迫處理1和12 h的表達水平極低。

圖3 28個新miRNA在對照和干旱處理中的表達量

2.4 中間錦雞兒干旱條件下差異表達的miRNA

為了鑒別差異表達的miRNA，以P≤0.05和fold change≥1.5或≤0.67為標準，比較三種干旱處理與對照組miRNA表達水平的差異(表3)。與對照相比，干旱處理3 h差異表達的miRNA最多，包括7個下調表達和10個上調表達的，共17個miRNA；cin-miR164a、cin-miR164b、cin-miR168a、cin-miR168b在干旱脅迫處理中與對照相比下調表達；cin-novel-3、cin-novel-11、cin-novel-21在干旱脅迫處理1和3 h中均上調表達。表明脫水干旱處理3 h差異表達的miRNA較多，cin-novel-26表達量在脫水干旱處理3 h達到極值，推測參與調控較多，可以作為下一步研究的重點。

表3 差異表達的miRNA

2.5 中間錦雞兒中miRNA靶基因的預測

用psRNATarget預測中間錦雞兒miRNA的靶基因，28個新miRNA在中間錦雞兒中共預測到582個靶基因。miRNA與靶基因的作用方式都是一對多的，其中cin-novel-28預測到的靶基因最少，僅有三個；而cin-novel-2預測到了68個靶基因。miRNA與靶基因的作用方式大多數(shù)是直接介導靶基因的降解，只有少數(shù)是抑制靶基因的翻譯，其中cin-novel-27，cin-novel-10和cin-novel-2與靶基因堿基完全互補。28個新miRNA在擬南芥中共預測到212個靶基因，這些靶基因包括SPL蛋白、轉錄因子、泛素、PPR家族蛋白、生長素應答因子等，且大多數(shù)參與干旱脅迫應答；但cin-novel-11、cin-novel-18和 cin-novel-20 在擬南芥中沒有預測到靶基因，推測這與miRNA的物種特異性和非保守性有關。

3 討論

miRNAs在植物對干旱脅迫的適應中起著重要作用。近年來，高通量測序技術被廣泛應用于植物miRNAs的鑒定。中間錦雞兒是一種多年生荒漠灌木，對非生物脅迫有著較為復雜的調控機制。很少有對中間錦雞兒抗旱相關 miRNAs的調查報道。2017年，Ning等[12]采用高通量測序技術，在干旱脅迫下對檸條中490個保守miRNAs和96個新miRNAs進行了鑒定，在鹽脅迫下通過高通量測序在中間錦雞兒中鑒定出132個保守的miRNAs和10個新的miRNAs。本研究通過solexa高通量測序和生物信息學分析，在中間錦雞兒中預測了88個保守miRNA和26個新miRNA，其中cin-miR164a、cin-miR164b、cin-miR168a、cin-miR168b在干旱脅迫下表達下調。cin-novel-3、cin-novel-11、cin-novel-21在干旱脅迫處理1和3 h后均較對照組上調，cin-novel-26在3 h干旱脅迫處理中有特異性表達。這些結果表明，脫水干旱處理3 h是有效的干旱處理，為以后的中間錦雞兒的干旱處理提供了依據(jù)。

miRNA的重要研究價值體現(xiàn)在對靶基因表達的調控。在植物中，大多數(shù)miRNA和靶基因的作用方式是完全堿基配對的，miRNA參與調控靶基因介導的分裂[13]。由于miRNA靶基因的數(shù)量龐大，在線軟件被廣泛應用于植物miRNA靶基因的預測，psRNATarget是應用最廣泛的軟件。以鷹嘴豆為例，共鑒定出122個保守的miRNAs和59個新的miRNAs，用psRNATarget預測了358個靶基因[14]。本研究利用psRNATarget數(shù)據(jù)庫預測了28個新的中間錦雞兒的miRNA，其中中間錦雞兒靶基因582個，擬南芥靶基因212個。其中cin-miR164a和cin-miR164b是ABA依賴的干旱脅迫NAC轉錄因子上調的靶基因，與擬南芥和水稻[15]中的相同。但由于物種的特異性，一些miRNA并沒有預測到靶基因，這需要深入研究驗證。