廣東咖啡炭疽病病原菌初步鑒定及防治藥劑篩選

徐丹丹，石力允，張 羽，林澤勉，姜子德，喬 方

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院/深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士后創(chuàng)新實踐基地，廣東 深圳 518055；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642）

【研究意義】小粒咖啡（Coffea arabica）又稱阿拉比卡咖啡，占世界咖啡總產(chǎn)量的70%，廣泛分布于世界各大咖啡產(chǎn)區(qū)。作為世界三大飲料（咖啡、可可、茶）之首，咖啡在中國的引進試種已有100 多年的歷史，主要集中種植于我國的云南、海南、廣東和臺灣地區(qū)［1］。廣東省最早種植的是雷州半島，因咖啡經(jīng)濟效益顯著，種植面積逐年擴大，現(xiàn)在粵東和粵西均有種植；但是咖啡種植中病蟲害的侵襲已成為阻礙咖啡產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大瓶頸。

【前人研究進展】咖啡炭疽病是影響小粒咖啡質(zhì)量和產(chǎn)量的重要病害之一，主要為害咖啡葉片、枝條、果實。高溫條件下，葉片邊緣出現(xiàn)黑色圓形病斑，病斑中央呈灰白色，病斑外緣有黃色暈圈，葉背有同心輪紋，上有黑色小點；新鮮漿果感病時在果實向陽面出現(xiàn)深褐色灼傷凹陷斑，斑痕擴展形成不規(guī)則凹陷灼傷區(qū)，最后果皮干褐掛于枝上；旱季小樹和弱樹易感病，出現(xiàn)大量落葉，并伴隨有枯枝癥狀［2］。多種炭疽菌可以引起咖啡炭疽病，Cao等報道了海南地區(qū)咖啡炭疽病的8種炭疽菌，分別為膠孢炭疽菌復(fù)合種（Colletotrichum gloeosporioidescomplexes）中的C.endophytica、C.fructicola、C.ledongense、C.siamense和C.tropicale，博寧炭疽菌復(fù)合種（C.boninensecomplexes）中的C.karstii和長直孢炭疽菌復(fù)合種（C.gigasporumscomplexes）的C.gigasporum［3］；Cristóbal-Martínez等通過分離墨西哥咖啡發(fā)病的葉片、枝條和漿果上的病原菌，鑒定了5種炭疽菌：C.gigasporum、C.gloeosporioides、C.karstii、C.siamense和C.theobromicola［4］；C.boninense、C.coffeanu、C.gloeosporioides能引起巴西咖啡的葉片和果實炭疽?。?］。

【本研究切入點】長期以來，化學(xué)防治仍然是防治炭疽病的主要措施，而關(guān)于炭疽病菌對多種農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的報道屢見不鮮。鞏佳莉等［6］報道咖啡炭疽病菌對代森錳鋅和百菌清表現(xiàn)為高水平抗性；Chechi 等［7］報道引起蘋果炭疽病的暹羅炭疽菌C.siamense對嘧菌酯和甲基硫菌靈表現(xiàn)為抗性；Piccirillo 等［8］發(fā)現(xiàn)引起香橙炭疽病的C.gloeosporioides菌株對嘧菌酯存在不同程度的抗性。廣東地區(qū)的咖啡栽培種植處于增長階段，且尚未有該地區(qū)咖啡炭疽病的相關(guān)研究報道，因此，針對該地區(qū)炭疽病原的研究至關(guān)重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗對采自廣東汕尾咖啡基地的炭疽病樣本進行病原菌的分離鑒定及防治藥劑的室內(nèi)篩選測定，以期為當?shù)乜Х忍烤也〉挠行Х揽靥峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019 年10 月20 日從廣東海豐縣湖畔咖啡種植基地（23°3′29″N，115°26′22″E）采集發(fā)病的咖啡樣品。選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）用于咖啡炭疽病菌的分離、純化和培養(yǎng)。

1.2 病原菌的分離與純化

挑選典型發(fā)病的病葉，在病健交界處切取5 mm×5 mm 的葉片組織塊，于75%乙醇（V/V）中浸潤10 s，隨后用2%的NaClO 表面消毒2～3 min，然后用無菌蒸餾水沖洗3 次，于無菌濾紙上晾干水分［9］。用無菌鑷子將組織塊轉(zhuǎn)移至PDA 平板上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。待菌落產(chǎn)生橘紅色粘孢團后，配制孢子懸浮液涂布于無菌的瓊脂培養(yǎng)基上，于顯微鏡下挑取含有單一分生孢子的瓊脂培養(yǎng)基于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得單孢菌株，然后將純化獲得的菌株移至PDA 斜面試管中保存。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將單孢純化后菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，觀察菌落性狀，并定期測量各菌株在25 ℃下不同時間段的菌落直徑，計算各菌株的生長速率；用Olympus BX41 顯微鏡觀察菌絲和分生孢子，隨機選取60 個分生孢子，測量分生孢子大小。

1.4 致病性測定

將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取各菌株的橘紅色粘孢團于無菌水中配制成濃度為105個/mL 的孢子懸浮液。選取幼嫩的咖啡葉片，用無菌接種針刺傷后接種10 μL 的孢子懸浮液，以接種無菌水作為對照，每個菌株接種15 片咖啡葉片，3 次重復(fù)。將所有處理的葉片置于保鮮盒中噴霧保濕，定期觀察統(tǒng)計葉片的發(fā)病情況，并從病組織中再次分離病原菌，與原接種菌株進行比較。

1.5 多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒（Omega生物工程有限公司）提取菌絲DNA，用真菌通用引物ITS1/ITS4、特異引物Bt2a/Bt2b、GDF/GDR、CHS-79F/CHS-345R、ACT-512F/ACT-783R和GSF1/GSR1共6對引物分別對菌株的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）［10］、β-微管蛋白基因（β-Tubulin，TUB2）［11］、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）［12］、幾丁質(zhì)合成酶基因（chitin synthase,CHS）［13］、肌動蛋白基因（Actin，ACT）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）［14］進行PCR擴增，各序列擴增引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），2×MasterMix 12.5 μL，以ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，（ITS和TUB2：55 ℃；GAPDH：56 ℃；CHS和ACT：58 ℃；GS：54℃）退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

取5 μL 上述PCR 擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后將PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司測序。將測得的基因序列與GenBank 中的序列進行比對，下載相似性高的序列及其對應(yīng)復(fù)合種的常見模式菌株序列，使用MEGA 軟件剪切后按照ITS-TUB2-GAPDH-CHS-ACT-GS 的順序首尾拼接，分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以自展法（Bootstrap）進行檢測，共循環(huán)1000 次。

表1 病原菌鑒定所用引物的具體信息Table 1 Detailed information of primers used for pathogen identification

1.6 殺菌劑抑菌活性測定

供試藥劑原藥苯醚甲環(huán)唑（96.3%）、咪鮮胺（97%）、吡唑醚菌酯（98%）和甲基硫菌靈（97%）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細菌和殺菌研究室提供。將4 種殺菌劑溶解于甲醇中配制得到原液，然后以倍比法加水稀釋得到工作液，將各藥劑工作液與PDA 混合制成含有殺菌劑的PDA 平板［15］。用孔徑為5 mm 的打孔器取菌絲塊接種至PDA 含藥平板上，以加入等體積的甲醇作為對照，每個藥劑濃度處理4次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，計算各殺菌劑菌絲生長抑制率和EC50值，繪制毒力回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

炭疽病在咖啡各生長期均可發(fā)生，本研究主要采集發(fā)病的咖啡葉片。葉片感病多在葉尖和葉緣產(chǎn)生褐色病斑，隨病斑的不斷擴大，后期病斑中心呈灰褐色且具同心輪紋排列的黑色小點，邊緣為暗褐色，其外緣有黃色暈圈；發(fā)病嚴重的則數(shù)個病斑交匯成大病斑，葉片干枯、脫落（圖1）。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

圖1 田間咖啡葉片發(fā)病癥狀Fig.1 Diseased symptoms of Coffea arabica leaves in field

圖2 代表菌株的菌落和分生孢子形態(tài)Fig.2 Colony and conidia morphology characteristics of representative strains

將分離得到的菌株單孢純化后共計得到37株菌株，根據(jù)形態(tài)特征的相似性初篩得到9株炭疽病菌株，分別為CA-1、CA-2、CA-3、CA-6、CA-11、CA-12、CA-13、CA-16和CA-22，其菌落性狀分為3種不同類型。一種菌落正面產(chǎn)生灰白色的氣生菌絲，菌絲平均生長速率為13.98 mm/d，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后可見橙色孢子堆產(chǎn)生（圖2A）；分生孢子無色透明，一端鈍圓，另一端鈍圓或略細，一般具1～2個油球（圖2B）；將CA-6選為代表菌株，其大小為14.46～17.88 μm×4.78～6.19 μm（av=16.2 μm×5.6 μm，n=60）。第二種菌落正面產(chǎn)生白色的氣生菌絲，菌絲平均生長速率為15.12 mm/d（圖2C）；分生孢子無色透明，一端鈍圓，另一端鈍圓或尖細，具2個油球（圖2D）；將CA-16選為代表菌株，其大小為14.06～17.33 μm×4.59～5.91 μm（av=15.9 μm×5.1 μm，n=60）。第三種菌落正面產(chǎn)生灰色的氣生菌絲，菌絲致密，菌絲平均生長速率為14.23 mm/d（圖2E）；分生孢子無色透明，兩端鈍圓，具2個油球（圖2F）；將CA-3選為代表菌株，其大小為12.46～15.35 μm×5.13～7.25 μm（av=13.8 μm×6.1 μm，n=60）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合Weir等［16］和Damm等［17］的描述，菌株CA-6和CA-16與膠孢炭疽菌復(fù)合種（C.gloeosporioidescomplexes）相似，菌株CA-3與盤長孢狀炭疽菌復(fù)合種（C.orchidearumcomplexes）相似。

2.3 致病性測定結(jié)果

將各菌株的分生孢子懸浮液回接至健康的咖啡葉片7 d 后，各葉片穿刺處理點均呈現(xiàn)病斑直徑不一的發(fā)病癥狀（圖3）。對照葉片不發(fā)病，僅在穿刺處理點有一褐色的氧化斑點，而9 株炭疽菌接種處理的咖啡葉片均呈現(xiàn)褐色壞死性病斑；其中5 株炭疽菌（CA-6、CA-12、CA-13、CA-16和CA-22）的致病力強，病斑直徑為19.2～25.5 mm；3株炭疽菌（CA-1、CA-2和CA-11）的致病力次之，病斑直徑為6.8～9.5 mm；炭疽菌CA-3的致病力較弱，病斑直徑為4.9～5.1 mm。

圖3 回接發(fā)病的咖啡葉片F(xiàn)ig.3 Diseased Coffea arabica leaves after inoculation

2.4 菌株多基因系統(tǒng)進化樹分析

從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可以看出：5株菌（CA-1、CA-6、CA-11、CA-12和CA-13）與果生炭疽菌C.fructicola聚在一起，形成一個明顯的分支；3株菌（CA-2、CA-16和CA-22）與暹羅炭疽菌C.siamense聚在一起，形成一個明顯的分支；CA-3單獨與芭蕉生炭疽菌C.musicola聚在一起；各分支間均有較高的支持率，因此確定測試的9株炭疽病菌分別為果生炭疽菌C.fructicola、暹羅炭疽菌C.siamense和芭蕉生炭疽菌C.musicola。

圖4 基于ITS、TUB2、GAPDH、CHS、ACT 和GS 基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS,TUB2,GAPDH,CHS,ACT and GS genes

2.5 不同殺菌劑對病原菌的毒力測定結(jié)果

2.5.1 不同殺菌劑對炭疽病菌菌絲生長的抑制效果 綜合病原菌鑒定結(jié)果和致病力測定結(jié)果，分別選取致病性強的2 株炭疽病菌C.fructicolaCA-13 和C.siamenseCA-16 進行殺菌劑毒力測定試驗。利用生產(chǎn)上常用的4 種殺菌劑進行菌絲生長的抑制試驗，結(jié)果（表2）表明：4 種殺菌劑對2株待測炭疽病菌的菌絲生長抑制效果差異顯著。咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈3 種殺菌劑抑菌效果顯著，當其濃度為0.125 mg/L 時對兩株炭疽病菌的菌絲生長抑制率超過50%，是防治咖啡炭疽病的理想藥劑。苯醚甲環(huán)唑?qū)芍晏烤也【囊种谱饔么沃?，當其濃度?.25 mg/L 時對菌株CA-13 和CA-16 的菌絲生長抑制率分別為58.6%和51.2%。

2.5.2 不同殺菌劑對病原菌的毒力 由表3 可知，4 種殺菌劑均對兩株強致病性咖啡炭疽病菌具有顯著的抑制活性，從藥劑的EC50值分析可知，咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈的抑制作用極強，其對兩株炭疽病菌菌株的EC50均小于0.1 mg/L，以咪鮮胺的毒力最強，對CA-13 和CA-16 的EC50分別為0.067、0.039 mg/L；苯醚甲環(huán)唑效果次之，其對CA-13 和CA-16 的EC50均大于0.1 mg/L。

3 討論

本研究采用組織分離法得到病原菌株，單孢純化后根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合ITS、TUB2、GAPDH、CHS、ACT 和GS 進行多基因系統(tǒng)學(xué)分析，證明分離得到的菌株分別為果生炭疽菌C.fructicola、暹羅炭疽菌C.siamense和芭蕉生炭疽菌C.musicola。通過柯赫氏法則驗證所有分離得到的菌株均可侵染葉片，引發(fā)葉片炭疽癥狀，故本研究結(jié)果應(yīng)是準確可靠的，這是關(guān)于果生炭疽菌C.fructicola、暹羅炭疽菌C.siamense和芭蕉生炭疽菌C.musicola3 種炭疽病菌復(fù)合侵染引起廣東地區(qū)引起咖啡葉片炭疽病的首次報道，該病原的確定為廣東咖啡葉片炭疽病的診斷和防治提供了理論依據(jù)。該研究對炭疽病原菌的鑒定與Cao 等對海南地區(qū)咖啡炭疽病病原菌研究結(jié)果基本一致［3］。另外，本研究亦首次從咖啡葉片中分離到芭蕉生炭疽菌C.musicola，但是該菌株致病力較弱，故不作為病原菌進行藥效試驗測定。但是，芭蕉生炭疽菌C.musicola能引起芋頭小果野蕉Musa acuminata［17］、Colocasia esculenta［18］和棉豆Phaseolus lunatus［19］的炭疽病，亦應(yīng)引起重視。

果生炭疽菌C.fructicola和暹羅炭疽菌C.siamense同屬于膠孢炭疽菌復(fù)合種C.gloeosporioidescomplex，是重要的炭疽病菌種群［16］。關(guān)于炭疽病的化學(xué)防治，苯丙咪唑類殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈通過抑制病原菌細胞β-微管蛋白合成而阻礙正常的有絲分裂達到抑菌的效果［20］，腈菌唑和三唑酮為真菌甾醇生物合成抑制劑，導(dǎo)致真菌細胞裂解死亡［21］，上述4 種殺菌劑為常用的廣譜型藥劑。本研究結(jié)果證明咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈對兩種炭疽病菌的抑菌效果最佳，其EC50均小于0.1 mg/L，

該結(jié)果與鞏佳莉的研究結(jié)果基本一致［6］。苯醚甲環(huán)唑?qū)μ烤也【鶦A-13 和CA-16 的EC50均大于0.1 mg/L，表明炭疽病菌對苯醚甲環(huán)唑有一定的抗性，該結(jié)果與宋丹丹等用三唑酮處理楊樹炭疽病菌得出的結(jié)論一致［22］。由于試驗所選4 種殺菌劑均為炭疽病防治的常規(guī)殺菌劑，長期使用導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生，且試驗多選咖啡基地旁有大量的荔枝園，本研究鑒定得到的暹羅炭疽菌C.siamense亦是荔枝炭疽病的重要病原菌［23］，所以在防治咖啡炭疽病的同時亦應(yīng)對荔枝炭疽病進行預(yù)防，降低病原菌的侵染源。

表2 殺菌劑對咖啡炭疽病菌菌絲生長的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of fungicides on mycelial growth of Colletotrichum isolated from Coffea arabica

表3 殺菌劑對咖啡炭疽病菌的室內(nèi)毒力分析Table 3 In vitro toxicity analysis of fungicides to Colletotrichum isolated from Coffea arabica

4 結(jié)論

結(jié)合致病性接種、形態(tài)特征觀察和多基因（ITS、TUB2、GAPDH、CHS、ACT 和GS）系統(tǒng)學(xué)分析，鑒定廣東咖啡葉片炭疽病的優(yōu)勢病原菌為果生炭疽菌C.fructicola和暹羅炭疽菌C.siamense；咪鮮胺、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈對果生炭疽菌C.fructicola和暹羅炭疽菌C.siamense的抑制作用極強，對兩株炭疽病菌菌株的EC50均小于0.1 mg/L，為田間防治咖啡炭疽病時選擇更多輪換藥劑提供了參考。