蛋白核小球藻對小鼠抗氧化及腸道細(xì)菌的影響

（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 泉州 362000）

【研究意義】小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是廣泛分布于淡水和海水環(huán)境中的單細(xì)胞微藻，生長快、易培養(yǎng)，富含多糖、蛋白質(zhì)、葉綠素、多不飽和脂肪酸和微量元素等,被國際糧農(nóng)組織列為理想的健康食品［1］。早在19 世紀(jì)70 年代，小球藻作為保健食品和治療某些疾病的輔助產(chǎn)品在日本得到廣泛應(yīng)用。但由于早期關(guān)于小球藻的保健和藥理機(jī)制不明確，以及小球藻養(yǎng)殖和加工技術(shù)不成熟，當(dāng)時并沒有形成產(chǎn)業(yè)化。小球藻培養(yǎng)、采收、加工處理等技術(shù)的發(fā)展以及保健作用機(jī)制研究的深入，為小球藻食品和保健產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，小球藻已成為最重要的商業(yè)微藻之一［2］。小球藻不僅具有抗氧化、降血糖、降血脂、排毒作用等保健功能，還具有獨(dú)特的海藻風(fēng)味，其作為一種新資源食品原料越來越受到青睞，在功能食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［3］。目前市面上可見以小球藻為原料的餅干、飲料、面條、糖果、冰淇淋等食品，包括全小球藻蛋白制劑、多糖制劑、膠囊、片劑等［4］。

【前人研究進(jìn)展】正常人體腸道內(nèi)有約1014個微生物，與人體形成共生的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。腸道菌群被稱為體外器官，不僅在食物消化吸收中發(fā)揮重要作用，同時參與機(jī)體健康的維系，腸道菌群失調(diào)與疾病的發(fā)生密切相關(guān)［5］。小球藻等微藻不僅具有極高營養(yǎng)價值，還能調(diào)節(jié)微生物增殖功能。研究表明，小球藻能體外抑制溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）、解藻朊酸弧菌（Vibrio alginolyiicus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等增殖［6］，具有體外促進(jìn)嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus）等益生菌增殖的功能［7］。小球藻富含大量膳食纖維，能加快腸道蠕動與新陳代謝，從小球藻中分離的小球藻活性生長因子（Chlorella Growth Factor，CGF）能促進(jìn)人體腸道中雙岐桿菌和乳酸菌等益生菌的繁殖，有望開發(fā)成益生元等功能食品和營養(yǎng)強(qiáng)化劑［8］。

【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于小球藻對腸道菌群的研究主要集中在小球藻在體外對腸道菌的抑制或促進(jìn)作用上，不能全面反映小球藻對體內(nèi)腸道菌群的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用高通量測序技術(shù)研究蛋白核小球藻對小鼠抗氧化和腸道細(xì)菌的影響，以期為基于改善腸道菌群研發(fā)新型小球藻功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SPF 級昆明小鼠購自北京華阜康生物公司。蛋白核小球藻粉由福建福清新大澤螺旋藻有限公司提供（每100 g 提供能量1532 kJ、蛋白質(zhì)56.4 g、脂肪0.9 g、碳水化合物19.2 g），總抗氧化（Total Antioxidant Activity，T-AOC）能力、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性和蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒購自南京建成生物生物工程研究所公司，小鼠糞便DNA 提取E.Z.N.A.? Stool DNA Kit 購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。

主要儀器設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；電泳儀，北京六一儀器廠；酶標(biāo)儀，賽默飛技術(shù)（北京）有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司；PCR 儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動物試驗(yàn) SPF級昆明小鼠于25（±1）℃下12 h晝夜交替適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。根據(jù)原衛(wèi)生部有關(guān)蛋白核小球藻作為新資源食品食用量≤20 g/d的規(guī)定，確定小鼠蛋白核小球藻灌胃劑量。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。正常對照（CK1）：灌胃等體積生理鹽水（N）；VE對照（CK2）：灌胃100 mg/kg VE；低劑量處理：灌胃100 mg/kg小球藻粉；中劑量處理：灌胃150 mg/kg小球藻粉；高劑量處理：灌胃200 mg/kg小球藻粉。每只小鼠每次灌胃0.2 mL，每天上午9：00給藥，連續(xù)3周。試驗(yàn)開始和結(jié)束時稱小鼠體重，試驗(yàn)于2019年10—12月在泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校SPF級動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.2 樣品采集 末次給藥24 h 后，分別收集單只小鼠糞便，提取DNA，進(jìn)行腸道菌群分析。麻醉后，心臟采血，取肝組織，測定血清和肝臟組織T-AOC、SOD 活性。

1.2.3 小鼠腸道菌分析 每組小鼠糞便隨機(jī)選擇4 個樣品提取DNA，以小鼠糞便DNA 為模板，采用文獻(xiàn)［9］中的引物特異性擴(kuò)增16S rDNA 的V3～V4 區(qū)，擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［10］。使用Invitrogen 核酸/蛋白質(zhì)定量熒光計(jì)Qubit〔賽默飛技術(shù)（北京）有限公司〕對擴(kuò)增文庫進(jìn)行定量。將擴(kuò)增DNA 濃度2 nmol/L 以上樣品置于Illumina NovaSeq 平臺上機(jī)測序（由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成）。對測序原始讀取數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，獲得高質(zhì)量的clean data。使用擴(kuò)增子序列變異體（Amplicon Sequence Variants，ASV）的概念構(gòu)建類可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）；基于OUTs 結(jié)果，用QIIME2 軟件（http://qiime.org/）計(jì)算α 多樣性指數(shù)，并進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）［11］。使 用SILVA（Release 132，https://www.arb-silva.de/documentation/release-132/）數(shù)據(jù)庫［12］開展物種分類及后續(xù)分析，使用R 包云工具繪制相關(guān)圖片。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻對小鼠體重及抗氧化酶活性的影響

試驗(yàn)過程中小球藻各劑量處理小鼠皮毛光滑、行動飲食和糞便均正常，無死亡。從表1 可知，各處理小鼠體重變化差異不顯著，表明小球藻對小鼠無不良影響。

細(xì)胞生命活動過程會不斷生成超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等自由基，一定濃度的自由基是機(jī)體正常生命活動所必需的，但過多自由基引起的損傷與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抗氧化酶系統(tǒng)能有效清除細(xì)胞中的自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷［13］。從表1 可知，小鼠T-AOC 和SOD 活性均隨小球藻濃度增加而增大，且均高于正常對照。除肝臟T-AOC 外，各處理小鼠抗氧化指標(biāo)均顯著高于正常對照，其中小球藻中劑量、高劑量處理小鼠T-AOC 和SOD 活性均比正常對照極顯著提高，表明小球藻能提高小鼠抗氧化活性。

表1 小球藻對小鼠體重及抗T-AOC、SOD 的影響Table 1 Effect of Chlorella pyrenoidosa on body weights and T-AOC,SOD of mice

2.2 小球藻對小鼠腸道菌的影響

2.2.1 小球藻對小鼠腸道菌多樣性影響 稀釋曲線能說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否足以反映環(huán)境中的物種多樣性。從各處理樣品的稀釋曲線（圖1）可以看出，隨序列數(shù)量增加曲線趨于平緩，表明測序量趨于飽和,繼續(xù)增加測序量對物種多樣性無影響，可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性信息。

Alpha 多樣性可通過群落豐富度指數(shù)和群落多樣性指數(shù)反映物種的豐富度和均勻度。從表2 可知，各處理Alpha 多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Chao1 和Coverage）與正常對照之間沒有顯著差異，表明小球藻對小鼠細(xì)菌的豐富度和均勻度無顯著影響。

圖1 不同處理小鼠糞便菌群稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of mice faecal microflora under different treatments

Beta多樣性是指不同環(huán)境群落之間的物種差異性，可通過PCA等方法計(jì)算環(huán)境樣品間的距離矩陣，樣品在PCA圖中的距離越接近表明物種組成越相似。本研究PCA分析結(jié)果（圖2）顯示，5個處理小鼠腸道細(xì)菌相似性差異顯著（P為0.01）。小球藻低劑量、中劑量、高劑量處理小鼠腸道細(xì)菌群落與正常對照相比差異顯著（P分別為0.032、0.032、0.031），表明灌胃小球藻能影響小鼠腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

表2 不同處理小鼠糞便菌群Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of mice faecal microflora under different treatments

圖2 不同處理的小鼠糞便菌群主成分分析Fig.2 Principal component analysis of mice faecal microflora under different treatments

2.2.2 小球藻對小鼠腸道細(xì)菌門水平影響 微藻中的蛋白質(zhì)、糖類、維生素和不飽和脂肪酸等是細(xì)菌生長的理想營養(yǎng)源，具有促進(jìn)有益菌增殖的功能。擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）是小鼠腸道菌群的兩大主導(dǎo)菌群，與未消化食物代謝有關(guān)［14］。從各處理小鼠腸道菌在門水平的分布（圖3）可知，腸道優(yōu)勢菌為擬桿菌門和厚壁菌門，兩個門細(xì)菌數(shù)量均占各樣品細(xì)菌總量的80%以上。與正常對照比較，小球藻各劑量處理小鼠腸道菌的擬桿菌門和厚壁菌門占比均有所下降，而疣微菌門比例顯著增加，其結(jié)果與服用螺旋藻對小鼠腸道菌群影響相似［15］。

圖3 不同處理的小鼠糞便菌群門水平微生物種類分布Fig.3 Distribution of microbial species of mice faecal microflora at phylum level under different treatments

2.2.3 小球藻對小鼠腸道細(xì)菌科水平影響 本研究中小鼠腸道細(xì)菌在科水平上豐度占優(yōu)勢的細(xì)菌為鼠桿菌科（Muribaculaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）（圖4），占總細(xì)菌豐度的70%以上。與正常對照比較，小球藻各劑量處理小鼠腸道細(xì)菌Muribaculaceae 的相對豐度顯著減少，而Lachnospiraceae 和Ruminococcaceae相對豐度顯著增加，表明服用小球藻后小鼠的腸道菌在科水平上發(fā)生顯著改變。

2.2.4 差異菌分析 為分析小球藻對腸道菌的影響，對各劑量處理與正常對照之間小鼠腸道細(xì)菌進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果（圖5）顯示，服用小球藻對小鼠腸道細(xì)菌影響較大的細(xì)菌包括艾克曼菌屬（Akkermansia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和Muribaculum等。與正常對照比較，小球藻各劑量處理擬桿菌和乳酸桿菌屬相對豐度均比正常對照顯著增加，而Akkermansia和Muribaculum相對豐度顯著減少，表明服用小球藻對小鼠腸道細(xì)菌產(chǎn)生顯著影響。VE 是一種常見抗氧化劑，不僅能提高機(jī)體抗氧化活性，還能影響小鼠腸道乳酸菌屬、梭菌屬等細(xì)菌豐度，具有改善腸道菌群功能［16］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照比較，服用VE 的小鼠腸道Akkermansia、Bacteroides等相對豐度顯著增加，而另枝菌屬（Alistipes）、Muribaculum等相對豐度顯著減少，關(guān)于VE 功能與腸道菌的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

圖4 不同處理的小鼠糞便菌群科水平微生物種類分布Fig.4 Distribution of microbial species of mice faecal microflora at family level under different treatments

3 討論

腸道菌群是維持機(jī)體健康不可或缺的重要因素，對宿主營養(yǎng)消化、能量轉(zhuǎn)換、免疫調(diào)節(jié)等生理過程發(fā)揮重要作用。正常腸道菌群主要包括雙歧桿菌、擬桿菌、乳酸菌、梭菌、腸桿菌、腸桿菌等［17-18］。研究顯示，腸道菌群與肥胖癥、糖尿病、心血管疾病等密切相關(guān)，而且腸道菌群能通過母體垂直傳播遺傳給下一代，維持腸道菌群平衡對保持人體的正常生理功能極其重要［19］。腸道菌群受到宿主基因、年齡、藥物使用、環(huán)境、生活方式、飲食習(xí)慣等多重因素影響，其中通過合理膳食可促進(jìn)腸道微生物定殖。調(diào)節(jié)腸道菌群促進(jìn)宿主健康具有易于控制、操作性強(qiáng)等優(yōu)勢［20］。因此，研究不同食物對腸道菌群的影響，能為通過飲食改善腸道菌群、促進(jìn)人體健康奠定理論基礎(chǔ)。

圖5 正常對照與各處理菌群差異分析Fig.5 Analysis of the microflora difference between normal group and experimental groups

小球藻有良好的微生態(tài)學(xué)效應(yīng)，且細(xì)胞壁不含有纖維素而易于消化，是理想的益生元［1］，但從腸道微生態(tài)的角度來研發(fā)小球藻類功能食品研究較少。本試驗(yàn)分析蛋白核小球藻對小鼠腸道細(xì)菌多樣性及結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示，小鼠灌胃小球藻后腸道乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）相對豐度比正常對照顯著增加。乳酸桿菌和擬桿菌是常見益生菌，其中乳酸菌能發(fā)酵產(chǎn)酸降低腸道pH 值而防止有害菌定殖、改變腸道中短鏈脂肪酸的組成及數(shù)量和調(diào)節(jié)免疫功能等，對維護(hù)機(jī)體健康具有重要作用［21］；擬桿菌屬細(xì)菌能抑制一些有害菌群的黏附與侵襲，能迅速恢復(fù)宿主失衡的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，維持腸道平衡以及改善宿主免疫力［22］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小球藻能提高小鼠腸道細(xì)菌有益菌的相對豐度，促進(jìn)機(jī)體健康，這與程宇嬌等［15］關(guān)于螺旋藻對腹瀉模型小鼠腸道菌群的影響結(jié)果類似。Muribaculum與冠心病、糖尿病和應(yīng)急焦慮等疾病相關(guān)。劉程鵬等［23］研究表明，糖尿病小鼠Muribaculum豐度增大，給小鼠灌胃功能食品后Muribaculum豐度減少。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠服用小球藻后Muribaculum豐度顯著減少，表明服用小球藻除能增加腸道有益菌豐度外，還能減少M(fèi)uribaculum等有害菌豐度。

生物細(xì)胞不斷地產(chǎn)生自由基，過多自由基未能及時清除將對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生，及時清除過量自由基對維持個體健康至關(guān)重要［24］?？寡趸瘎┠芮宄杂苫Ｗo(hù)細(xì)胞免受自由基損傷。由于合成抗氧化劑存在毒性甚至致癌風(fēng)險(xiǎn)等，目的，尋找天然、高效、低毒的天然抗氧化劑逐步取代合成抗氧化劑是必然趨勢［25］。小球藻含有豐富的葉綠素、VC、VE、β-胡蘿卜素等抗氧化活性成分，是開發(fā)天然抗氧化劑的理想原料［26］。魏文志等［27］研究表明，從小球藻中提取的糖蛋白具有較強(qiáng)的體外清除羥自由基和超氧陰離子能力，且清除率隨糖蛋白濃度增加而增大。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，小球藻能提高小鼠血液和肝臟總抗氧化和SOD 活性，這與史瑞琴等［28］研究小球藻多糖口服液抗氧化活性結(jié)果相似，表明小球藻可顯著提高小鼠的抗氧化能力。生物體的抗氧化能力受腸道菌群影響，腸道菌群中的兼性厭氧菌體內(nèi)含有抗氧化酶類，如腸道乳酸桿菌分泌的胞外多糖能提高小鼠抗氧化酶活性，緩解衰老小鼠氧化應(yīng)激，改善健康狀況［29］。小球藻的抗氧化活性可能與改善腸道菌有關(guān)。

4 結(jié)論

蛋白核小球藻能顯著提高小鼠總抗氧化（T-AOC）能力和超氧化物歧化酶（SOD）活性，增強(qiáng)抗氧化能力?？诜∏蛟逍∈竽c道細(xì)菌Alpha 多樣性指數(shù)與正常對照之間無顯著差異，而Beta 多樣性與正常對照之間差異顯著。通過菌群差異分析，在眾多差異菌中發(fā)現(xiàn)口服小球藻小鼠乳酸桿菌、擬桿菌等有益菌豐度增加，而Muribaculum等有害菌豐度減少。小球藻能影響小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、改善腸道環(huán)境、促進(jìn)機(jī)體健康，為基于改善腸道菌群研發(fā)新型小球藻功能性食品提供依據(jù)?？梢?，小球藻具有抗氧化活性，同時也能影響腸道細(xì)菌的構(gòu)成，關(guān)于小球藻抗氧化活性與腸道菌群關(guān)系以及相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。