NaCl 脅迫西藏青稞芽期幼苗根系生長特性及其耐鹽性分析

（省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，拉薩 西藏 850032）

【研究意義】鹽堿土在陸地生態(tài)系統(tǒng)上分布廣泛，全世界鹽漬土面積約l0億hm2［1］。土壤中鹽分過多，會對植物造成鹽害［2］。因此，土壤鹽堿化已經(jīng)成為影響農(nóng)作物生長及產(chǎn)量的重要因子之一，關(guān)于植物對鹽逆境適應(yīng)能力的研究已成為全球關(guān)注熱點［3］，如何提高植物耐鹽性已成為植物抗逆性研究的重點［4］。高等植物對鹽逆境的響應(yīng)是一復(fù)雜綜合的生物調(diào)節(jié)過程，需要植物體內(nèi)多種生理生化過程共同作用，而非單一生物調(diào)節(jié)過程就能夠抵御鹽逆境響應(yīng)［5］。青稞（裸大麥）是青藏高原農(nóng)牧民主要的糧食作物，在西藏青稞種植面積占總耕地面積50%以上，同時也是牧區(qū)飼草的主要來源［6］。青稞具有較好的適應(yīng)性和抗逆性，西藏邊境農(nóng)區(qū)及海拔4700 m以上的高寒農(nóng)區(qū)，這些地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平低下，生態(tài)環(huán)境惡劣（氣候嚴(yán)寒、多為鹽堿土），青稞是唯一能正常收獲的糧食作物［7］。青藏高原青稞系我國獨有的植物種質(zhì)資源，具有豐富的遺傳變異和抗逆基因資源，發(fā)掘其耐鹽資源可為大麥及作物耐鹽改良提供優(yōu)異種質(zhì)［8］?！厩叭搜芯窟M展】鹽逆境的直接危害表現(xiàn)為植物滲透脅迫、離子失調(diào)引起的毒害、營養(yǎng)元素的虧缺、氧化脅迫、生理生化代謝的紊亂、有毒物質(zhì)的積累，進而引起植物生長發(fā)育和形態(tài)建成的改變［9］。大麥響應(yīng)鹽脅迫，根系Na含量呈先升高后降低趨勢，P、S、Mg、K、Mn、Zn和B含量因鹽處理而降低；葉片中，隨鹽脅迫程度的增加，Na含量上升，P、S、Mg、K、Mn、Zn和B含量降低［10］。大麥根系響應(yīng)鹽脅迫膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，差異蛋白質(zhì)響應(yīng)機制主要涉及細(xì)胞膜穩(wěn)定性、清除活性氧自由基和參與離子平衡的重建；葉片膜蛋白的主要響應(yīng)機制是保護光合反應(yīng)過程。大麥中脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（DREB）、體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體樣激酶（SERKs）和水通道蛋白基因（AQP）已被驗證功能［11］。鹽脅迫野大麥，差異表達途徑涉及蔗糖合成、脯氨酸合成、過氧化物酶體等，蔗糖合成酶（SuS）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT）、谷氨酸激酶（ProB）、谷氨酸-5-半醛脫氫酶（ProA）、超氧化物歧化酶（SOD）等編碼基因差異上調(diào)表達［12］。12-氧-植物二烯酸還原酶基因（OPR）、脂肪氧化酶基因（LOX）、L-半胱氨酸脫巰基酶基因（LCD）、PIN-formed蛋白基因（PIN）均參與植物非生物脅迫過程中，調(diào)控植物根系生長發(fā)育，促進植物適應(yīng)非生物逆境響應(yīng)?！颈狙芯壳腥朦c】西藏耕地區(qū)多為高寒和干旱鹽漬區(qū)，青稞是藏區(qū)主要的糧食作物，是具有適應(yīng)性和抗逆性遺傳種質(zhì)資源。因此，篩選具有耐鹽堿性青稞品種（系），不僅能提高糧食產(chǎn)量，更能改善土壤狀況，促進土壤結(jié)構(gòu)改良?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗采用不同濃度NaCl溶液脅迫青稞種子，篩選出半致死濃度（LC50），并研究青稞根系對NaCl的響應(yīng)，以期了解鹽脅迫對青稞根系形態(tài)的影響以及與耐鹽性的關(guān)系，篩選出耐鹽性青稞品種（系）。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

28份參試材料見表1，均為西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所新育成品種（系）。

1.2 試驗方法

1.2.1 NaCl脅迫青稞半致死濃度（LC50）測定半致死濃度測定以ZDM09826、WDM00123、ZDM08086、WDM04526、ZDM04080、ZDM07747共6個品種（系）青稞材料為試材。選取大小均勻、飽滿、無病蟲害的青稞種子進行發(fā)芽試驗，方法參考GB/T3543.4-1995，略有改進，以三層濾紙為芽床，置于25℃自然光下萌發(fā)，用蒸餾水保濕。待青稞種子胚根長至2 mm時，選取正常發(fā)芽、胚根長度基本一致的種子50粒分別轉(zhuǎn)至50、100、150、200、250 mmol/L NaCl溶液為培養(yǎng)液的五層吸水紙一層濾紙的芽床繼續(xù)培養(yǎng)，進行脅迫。對照除培養(yǎng)液為蒸餾水外，其他條件與處理一致。待青稞種子破殼胚根長約1～2 mm時，選取正常發(fā)芽、胚根長度基本一致的種子50粒轉(zhuǎn)移至長30 cm、寬15 cm、高5 cm的發(fā)芽盒中繼續(xù)培養(yǎng)（培養(yǎng)盒中含300 g石英砂，加入不同濃度NaCl溶液，對照加入等量蒸餾水，其他與處理一致，3次重復(fù)，置于智能人工氣候箱中繼續(xù)發(fā)芽，晝/夜溫度為25 ℃/20 ℃（14 h/10 h），光照為6000 lx，濕度65%，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，處理結(jié)束后測定存活幼苗數(shù)，計算成苗率，隨機選取10株青稞幼苗測定苗高。

相對活力指數(shù)=（處理成苗率×處理苗高）/（對照成苗率×對照苗高）［13］；

以NaCl溶液濃度與相對活力指數(shù)進行回歸分析，得到回歸方程，并計算半致死濃度LC50。

1.2.2 青稞芽期幼苗生長特性測定 以回歸分析所得半致死濃度為處理濃度，采用1.2.1方法處理28份參試青稞種子，3次重復(fù)，處理結(jié)束后，隨機選取10株青稞幼苗分別測定芽長、最長根長、單株鮮重、單株干重，計算各品種（系）青稞材料相對活力指數(shù)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用Excel 2016處理作圖，采用軟件SPSS 19.0進行相關(guān)性及聚類分析。

2 結(jié)果分析

2.1 NaCl 脅迫青稞萌發(fā)半致死濃度

從圖1可以看出，不同濃度NaCl溶液處理6個青稞品種（系），幼苗相對活力指數(shù)隨NaCl溶液濃度增加呈下降趨勢。ZDM09826、WDM04526兩個品種（系）青稞在不同NaCl溶液處理下相對活力指數(shù)在0.40～0.88、0.41～0.88，均高于其他4個品種（系）青稞，說明耐鹽性強于其他4個品種（系），ZDM08086、ZDM07747兩個品種（系）在各濃度處理上均小于其他4個品種（系），ZDM04080、WDM00123兩個品種（系）處于中間水平。6個品種（系）青稞耐鹽性順序為ZDM09826≥WDM04526>ZDM04080>WDM00123>ZDM07747≥ZDM08086。NaCl溶液濃度在150～200 mmol/L時，6個品種（系）青稞相對活力指數(shù)在0.50左右，可將該濃度作為青稞耐鹽研究的最適濃度。將NaCl脅迫濃度與相對活力指數(shù)回歸分析，可得回歸方程為：y=-0.0022x+0.9107，R2=0.788**，即NaCl脅迫青稞耐鹽性研究臨界值為186.68 mmol/L。

圖1 NaCl 脅迫對青稞相對活力指數(shù)影響Fig.1 Effect of NaCl stress on relative vigor index of highland barley

2.2 NaCl 脅迫對青稞芽期幼苗生長特性的影響

以190 mmol/L NaCl 溶液脅迫28 份青稞芽期幼苗，結(jié)果顯示青稞根系生長受到不同程度的抑制（表1），與CK 相比各品種（系）青稞根系指標(biāo)均受到影響，不同品種（系）間受到抑制程度差異較大。其中，芽長變化最大（1.10～8.86 cm），平均值為3.27 cm，變異系數(shù)（CV）為62.83%；單株干重變化次之（0.35～0.65 g），平均值為0.35 g，CV為42.57%；根長CV（41.59%）與單株干重相當(dāng)，變化幅度為1.18～5.55 cm。單株鮮重變化最小（3.43～5.21 g），CV為23.81%。說明芽長對NaCl 脅迫最敏感，單株干重及最長根長次之，單株鮮重最遲鈍。NaCl 脅迫后，4 份（ZDM09826、WDM03018、WDM03722、WDM04526）青稞芽長均大于5.00 cm，同時單株干重均大于0.50 g，最長根長均大于4.00 cm，相對活力指數(shù)均大于0.50，表明這4 份材料耐鹽性最強。這可能是因為根系的伸長使得青稞更容易從土壤或基質(zhì)中吸收水分及營養(yǎng)物質(zhì)，促進了芽長及單株干重的增加。

綜上所述，對于NaCl脅迫，青稞芽期幼苗根系特征差異較大，其中芽長、單株干重、最長根長可作為青稞耐鹽性篩選指標(biāo)。

2.3 青稞耐鹽性聚類分析

圖2 28 份青稞在NaCl 脅迫下根系特征的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of root characteristics of 28 highland barley under NaCl stress

以發(fā)芽率、芽長、單株干重、最長根長及單株鮮重為指標(biāo)對28份青稞做層次聚類分析，在歐幾里得距離3處可以將青稞分為4個大類（圖2）。其中，A類共有3份材料（WDM03018、WDM03722、WDM04526），平均發(fā)芽率為66.87%，平均芽長為8.00 cm，平均單株干重為0.59 g，平均最長根長為4.14 cm，平均單株鮮重為4.37 g；B類共有10份（ZDM09826、WDM00123、ZDM08086、ZDM08141、ZDM08177、ZDM08193、ZDM4803、ZDM4308、ZDM09824、ZDM5691），平均發(fā)芽率為40.57%，平均芽長為2.90cm，平均單株干重為0.38g，平均最長根長為3.07cm，平均單株鮮重為3.38g；C類共有7份（WDM01155、ZDM4648、ZDM4716、ZDM4784、ZDM4808、ZDM5449、ZDM5617），平均發(fā)芽率為24.60%，平均芽長為2.70cm，平均單株干重為0.27g，平均最長根長為2.73cm，平均單株鮮重為3.05g；D類共有8份（ZDM5573、ZDM08819、ZDM08951、ZDM04080、ZDM07747、WDM05249、ZDM4785、ZDM5700），平均發(fā)芽率為24.54%，平均芽長為2.19 cm，平均單株干重為0.25 g，平均最長根長為2.51 cm，平均單株鮮重為2.86 g；28材料抗旱性聚類分析結(jié)果與相對活力指數(shù)變化趨勢相對吻合，即耐鹽性相對較高材料的相對活力指數(shù)較高，反之，則相對活力指數(shù)較低。

綜合聚類分析及相對活力指數(shù)比較可知，3份材料（WDM03018、WDM03722、WDM04526）平均相對活力指數(shù)為0.71，是耐鹽性較強的青稞品種（系）。

2.4 青稞幼苗根系形態(tài)與耐鹽性的相關(guān)性分析

以相對活力指數(shù)作為青稞幼苗耐鹽性的重要指標(biāo)已應(yīng)用于耐鹽性材料的篩選工作，對青稞NaCl脅迫下根系形態(tài)與相對活力指數(shù)做相關(guān)性分析顯示，青稞相對活力指數(shù)與相對發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)，與最長根長極顯著正相關(guān)，與單株干重極顯著正相關(guān)（表2）。NaCl脅迫下，青稞發(fā)芽率高、根長較長、單株干重較大的材料其耐鹽性相對較強，因此，可作為青稞耐鹽性材料篩選的輔助指標(biāo)。

3 討論

植物種子萌發(fā)期是對外界脅迫最為敏感的階段，因此，研究植物對逆境響應(yīng)多選擇種子萌發(fā)期［14］。植物根系是第一個感知逆境（干旱、鹽等）的器官，根系生長狀況發(fā)生變化可在較大程度上反映植物應(yīng)對逆境的表現(xiàn)。植物根系越發(fā)達、扎根越深根系可吸收深層土壤水分，植物遭受逆境脅迫時供給地上部正常生理生化代謝所需水分［15］。同時，根系組織代謝低、吸水性好的優(yōu)異基因型植物，具有更高的生產(chǎn)潛力［16］。根系是吸收水分、營養(yǎng)元素的主要器官，葉是進行光合作用的主要部位，鹽脅迫對根和葉的影響直接反映植物在鹽脅迫條件下的生長狀況［17］。小麥遭受NaCl脅迫，隨脅迫程度的增加，最大根長、根體積和根干重均降低，耐鹽性強品種（系）下降程度較?。?8］。研究顯示，本試驗結(jié)果顯示，耐鹽性越強的青稞品種（系）發(fā)芽率越高，根系發(fā)達程度越高。本研究結(jié)果顯示，青稞根系生長受到不同程度的抑制，不同品種（系）材料之間受到抑制程度差異較大。芽長對NaCl脅迫最敏感，單株干重及最長根長次之，單株鮮重最遲鈍，與陳浩等［19］、李有芳等［20］研究結(jié)果類似。研究顯示，青稞根系滲透調(diào)節(jié)是其耐鹽的基本機制，多元醇在根系中起重要作用，根系中高水平的糖（蔗糖、海藻糖、棉子糖等）和能量以及葉片中活躍的光合作用對大麥耐鹽起重要作用［21］。根和葉之間與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的相容溶質(zhì)的種類存在差異，根中糖、脯氨酸和有機酸的合成顯著增強，有利于提高活性氧解毒能力和耐鹽性［22-23］。

表2 青稞根系特征與相對活力指數(shù)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of highland barley root characteristics and relative vigor index

植物耐鹽性受基因型、生理生化等控制［24-25］，采用任何一種單一的評價方法衡量作物耐鹽性都是不全面的，采用綜合指標(biāo)評價耐鹽性較準(zhǔn)確［26］。本試驗結(jié)果顯示，發(fā)芽率、根長、單株干重與青稞相對活力指數(shù)呈極顯著/顯著正相關(guān)，可作為青稞耐鹽性材料篩選的輔助指標(biāo)。聚類分析方法常用來篩選抗逆性材料，本試驗采用聚類分析方法篩選得到3份耐鹽性青稞材料，為青稞育種工作奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究對28份青稞根系5個形態(tài)特征指標(biāo)進行了分析，結(jié)果顯示，NaCl脅迫對青稞幼苗根系形態(tài)指標(biāo)影響較大，不同青稞對NaCl脅迫的敏感程度不同。采用聚類分析可以分為4類，耐鹽性的聚類結(jié)果與青稞種子的相對活力指數(shù)的變化趨勢基本一致，呈正相關(guān)關(guān)系，即耐鹽性強的材料的相對活力指數(shù)越高，弱耐鹽材料的相對活力指數(shù)相對較低。相關(guān)性分析顯示，相對活力指數(shù)與相對發(fā)芽率、最長根長、單株干重呈顯著/極顯著正相關(guān)，可作為青稞耐鹽性篩選的輔助指標(biāo)。通過聚類分析獲得了3份青稞（WDM03018、WDM03722、WDM04526）耐鹽材料，為青稞耐鹽遺傳育種提供了材料。