乳鐵蛋白對(duì)大鼠上頜擴(kuò)弓及復(fù)發(fā)過程中腭中縫骨吸收的影響及機(jī)制探究

程 燁 李天成 陳建偉 鄒淑娟 李 煌 李貴鳳

上頜擴(kuò)弓是正畸治療中用來改善生長(zhǎng)發(fā)育期兒童上頜骨橫向發(fā)育不足的常用手段[1]，因其治療效果的顯著性和治療結(jié)束后較高的復(fù)發(fā)率，一直以來是被學(xué)者們廣泛研究的臨床問題。人們?cè)噲D尋找一種可靠的方法來增加上頜擴(kuò)弓治療后結(jié)果的穩(wěn)定性、減少擴(kuò)弓量的復(fù)發(fā)。

在上頜擴(kuò)弓過程中，腭中縫的骨改建是維持?jǐn)U弓效果穩(wěn)定性的關(guān)鍵，腭中縫成骨量不足或破骨量過多被認(rèn)為是導(dǎo)致上頜擴(kuò)弓后復(fù)發(fā)的主要原因[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）灌胃干預(yù)可以在大鼠上頜擴(kuò)弓過程以及去除擴(kuò)弓裝置的復(fù)發(fā)階段中促進(jìn)腭中縫的新骨形成、增強(qiáng)腭中縫的骨質(zhì)，從而減低上頜擴(kuò)弓治療后的復(fù)發(fā)率、維持其穩(wěn)定性[3]。然而，LF 灌胃的作用機(jī)制尚不甚清楚。

OPG/RANKL/RANK 作用軸是細(xì)胞間調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞破骨活性的重要通路[4]。核因子KB 受體活化因子（receptor or activator of nuclear factor-KB，RANK）分布在破骨前體細(xì)胞膜上，通過與成骨細(xì)胞表達(dá)的核因子KB 受體活化因子配體（receptor or activator of nuclear factor-KB ligand，RANKL）結(jié)合活化破骨前體細(xì)胞。RANKL 與RANK 的作用受到骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）的調(diào)節(jié)。OPG 也由成骨細(xì)胞表達(dá)，競(jìng)爭(zhēng)性與RANK 結(jié)合，阻礙破骨細(xì)胞破骨分化[5]。去勢(shì)大鼠LF 干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示LF 是通過上調(diào)OPG/RANKL 表達(dá)比例來抑制破骨細(xì)胞活性的[6]。故LF 可能通過OPG/RANKL/RANK 作用軸，在上頜擴(kuò)弓過程中抑制腭中縫的破骨活動(dòng)。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究LF 在上頜擴(kuò)弓及復(fù)發(fā)過程中對(duì)腭中縫骨吸收的影響和作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)仍然采用LF 灌胃的方式對(duì)大鼠上頜擴(kuò)弓及復(fù)發(fā)過程進(jìn)行干預(yù)，觀察在此過程中LF 對(duì)OPG/RANKL/RANK 作用軸關(guān)鍵因子OPG、RANKL表達(dá)的影響，初步探究LF 影響破骨活動(dòng)的作用機(jī)制。

資料和方法

1.動(dòng)物處理及分組

16 只5 周齡雄性Wistar 大鼠（成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，中國），體重100±10g，SPF 級(jí)，用相同的基礎(chǔ)飲食、飲水飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 天后（D0），隨機(jī)分為2 組:單純擴(kuò)弓組（EO），安裝擴(kuò)弓裝置；擴(kuò)弓+LF 組（E+LF），擴(kuò)弓同時(shí)給予1g/kg/d LF溶液灌胃；每組8 只大鼠。7 天的上頜擴(kuò)弓后（D7），每組隨機(jī)挑選4 只大鼠處死并獲取腭部標(biāo)本，其余大鼠去除口內(nèi)裝置即進(jìn)入復(fù)發(fā)階段。復(fù)發(fā)7 天后（D14），處死剩余的每組4 只大鼠并獲取腭部標(biāo)本。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

大鼠擴(kuò)弓裝置的安裝、LF 灌胃干預(yù)、腭部標(biāo)本的獲取和處理等實(shí)驗(yàn)步驟已在本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)表的文章中有詳盡闡述。

2.免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后浸泡于抗原修復(fù)液（檸檬酸鹽修復(fù)液或EDTA 修復(fù)液） 中，水浴升溫至75℃后恒溫加熱50 分鐘。切片自然冷卻、浸洗，之后置于3%過氧化氫溶液中避光浸泡30 分鐘。浸洗、擦干切片，滴加抗原封閉劑（1%牛血清）將標(biāo)本完全覆蓋，37℃孵育1 小時(shí)。吸干抗原封閉劑，滴加1%牛血清稀釋的一抗:組織蛋白酶k（cathepsin k，CTSK）抗體、RANKL 抗體、OPG 抗體（Abcam 公司，美國），37℃孵育1 小時(shí)，4℃冰箱中過夜。陰性對(duì)照標(biāo)本不滴加一抗。浸洗、擦干切片，按照二抗ABC 試劑盒（Vector Laboratories 公司，美國）說明書，分別滴加二抗和顯色劑，分別37℃孵育1 小時(shí)后洗凈。擦干切片，滴加新鮮配置的DAB 顯色液，鏡下控制顯色時(shí)間，自來水終止顯色并清洗，部分染色蘇木素復(fù)染。

切片在普通光學(xué)顯微鏡（Nikon 公司，日本）下觀察并采圖。在相同大小的視野中（2048×2048 像素）對(duì)CTSK 陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)破骨細(xì)胞的數(shù)量。利用Image J 軟件（National Institutes of Health，美國）分別提取固定大小視野中（2048×2048 像素）的RANKL、OPG 的陽性表達(dá)區(qū)域，并且分別計(jì)算陽性表達(dá)區(qū)域面積占視野總面積的百分比。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有量化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用SPSS 軟件（SPSS 公司，美國）對(duì)兩組或兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（D7、D14）之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)比較。P＜0.05 則被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1.CTSK 免疫組織化學(xué)染色

在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的大鼠標(biāo)本中，胞質(zhì)陽性染色的多核細(xì)胞即破骨細(xì)胞在腭中縫的分布情況相似:在D7 時(shí)多位于中縫兩側(cè)骨端的骨髓腔邊緣，少數(shù)分布在腭部骨板鼻腔側(cè)的骨膜下；而在D14 時(shí)則在中縫兩側(cè)的骨髓腔邊緣分布減少，而多位于鼻腔側(cè)的骨膜下（圖1）。破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:在D7、D14 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，E+LF 組大鼠腭中縫的破骨細(xì)胞都顯著少于EO 組（圖2A）。

2.RANKL 免疫組織化學(xué)染色

RANKL 的陽性顯色大部分位于腭中縫的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞等的細(xì)胞質(zhì)中，少量位于這些細(xì)胞周圍的組織基質(zhì)中。這樣的組織分布特點(diǎn)在檢測(cè)的標(biāo)本之間都沒有顯著差異（圖3）。計(jì)算RANKL 陽性表達(dá)面積占比結(jié)果顯示，RANKL 的表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有相似的組間差異，即E+LF 組明顯多于EO 組（圖2B）。

3.OPG 免疫組織化學(xué)染色

OPG 在D7、D14 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織表達(dá)規(guī)律與RANKL 極為相似，即對(duì)于所有標(biāo)本OPG 的陽性顯色大部分位于標(biāo)本腭中縫的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞等細(xì)胞的胞質(zhì)中，少部分位于這些細(xì)胞周圍的組織基質(zhì)中（圖4）。計(jì)算視野中OPG 陽性表達(dá)面積的百分比結(jié)果表明:OPG 的陽性表達(dá)面積在D7、D14 兩個(gè)觀測(cè)點(diǎn)均為E+LF 組顯著大于EO 組（圖2C）。

圖2 免疫組織化學(xué)染色量化結(jié)果（柱頂豎條表示標(biāo)準(zhǔn)差；* 表示P＜0.05）

圖3 RANKL 免疫組織化學(xué)染色（比例尺100μm 如圖所示）

圖4 OPG 免疫組織化學(xué)染色（比例尺100μm 如圖所示）

利用上述RANKL、OPG 的陽性表達(dá)面積計(jì)算結(jié)果，計(jì)算OPG 和RANKL 表達(dá)量的比值。計(jì)算結(jié)果顯示:在D7 和D14，OPG/RANKL 表達(dá)量的比值在E+LF 組明顯大于EO 組（圖2D）。

討 論

本研究的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LF 灌胃可以在大鼠上頜擴(kuò)弓及復(fù)發(fā)的過程中促進(jìn)腭中縫的新骨形成，并且此作用呈一定的計(jì)量依賴性，1g/kg 體重的高濃度LF 灌胃可以在此過程中增強(qiáng)腭中縫的骨質(zhì)[3]。本研究便在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用1g/kg 體重LF灌胃，進(jìn)一步探究LF 在大鼠擴(kuò)弓和復(fù)發(fā)過程中對(duì)腭中縫骨吸收活動(dòng)的影響及其作用機(jī)制。

CTSK 是破骨細(xì)胞特異性表達(dá)與骨質(zhì)溶解密切相關(guān)的重要水解酶[7]，和TRACP 5b、降鈣素受體一同被視作破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物[8]。CTSK 的表達(dá)量常被用來衡量破骨細(xì)胞的活性[8～10]。CTSK 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明LF 灌胃干預(yù)可能不會(huì)影響腭中縫破骨細(xì)胞的組織分布，但可能在一定程度上抑制了上頜擴(kuò)弓及復(fù)發(fā)過程中腭中縫的破骨活動(dòng)。這與Hou 等[6]、Walli 等[11]的研究結(jié)果較為一致。然而，Kawazoe 等的大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[12]、Inubushi 等的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則得出了相對(duì)不同的結(jié)果。這兩個(gè)研究表明LF 只能抑制炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的骨吸收過程[13]，而對(duì)正畸應(yīng)力刺激導(dǎo)致的破骨活動(dòng)則沒有作用。聯(lián)系本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，可以推測(cè)產(chǎn)生這樣研究結(jié)果差異的原因可能是Kawazoe 等的實(shí)驗(yàn)采用的LF 大鼠灌胃濃度為500mg/kg 體重，尚未達(dá)到可以抑制應(yīng)力相關(guān)破骨活動(dòng)的濃度。

OPG/RANKL/RANK 作用軸是細(xì)胞間調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞破骨活性的重要通路[4]。RANK 分布在破骨前體細(xì)胞的細(xì)胞膜上，通過與成骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL結(jié)合從而活化破骨前體細(xì)胞。RANKL 與RANK 的作用受到OPG 的調(diào)節(jié)。OPG 也由成骨細(xì)胞表達(dá)，競(jìng)爭(zhēng)性與RANK 結(jié)合，阻礙破骨細(xì)胞破骨分化[5]。故OPG 與RANKL 的表達(dá)平衡調(diào)節(jié)著機(jī)體的破骨活動(dòng)以及骨代謝。當(dāng)OPG/RANKL 表達(dá)量的比例升高時(shí)，破骨功能受到抑制；而當(dāng)其比例降低時(shí)，破骨活動(dòng)則被促進(jìn)[14]。一項(xiàng)對(duì)去勢(shì)大鼠的LF 干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示LF是通過上調(diào)OPG/RANKL 表達(dá)比例來抑制破骨細(xì)胞活性的[6]。在大鼠腭中縫受應(yīng)力牽張以及復(fù)發(fā)改建的過程中，LF 對(duì)破骨活動(dòng)的抑制作用可能與OPG/RANKL/RANK 作用軸有關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，OPG 和RANKL 的表達(dá)量在LF 的干預(yù)作用下都有提高，這可能是由LF 導(dǎo)致的成骨樣細(xì)胞的增殖和骨膜下細(xì)胞向腭中縫區(qū)域的聚集引起的。OPG 和RANKL 都是由成骨細(xì)胞表達(dá)的，當(dāng)成骨細(xì)胞的量增加，自然會(huì)導(dǎo)致OPG 和RANKL 表達(dá)量的同時(shí)增加。然而OPG/RANKL 表達(dá)量的比值在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都因?yàn)長(zhǎng)F 的干預(yù)作用而顯著大于EO組，表明LF 在此過程中促使了OPG/RANKL 表達(dá)比例的上調(diào)。即LF 對(duì)破骨活動(dòng)的抑制作用是通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 作用軸來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，高濃度LF 灌胃可以在大鼠上頜擴(kuò)弓及復(fù)發(fā)的過程中抑制腭中縫的破骨活動(dòng)；對(duì)破骨活動(dòng)的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 作用軸實(shí)現(xiàn)的。