細(xì)菌纖維素合成菌的篩選、鑒定及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)表征

李婷婷，趙 鑫，任葉琳，任佳楠，韓雪容*

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是微生物生產(chǎn)的類似于纖維素的由D-吡喃葡萄糖單體以β-1,4-糖苷鍵聚合而成的胞外直鏈高分子多糖；該多糖由直徑3～4 nm的微纖維組成40～60 nm纖維束交織形成超精細(xì)3D納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。細(xì)菌纖維素這種獨(dú)特高分子結(jié)構(gòu)和超細(xì)3D納米結(jié)構(gòu)[2]，使其具有高持水能力[3]、高聚合度[4]、高機(jī)械強(qiáng)度[5]、高結(jié)晶度[6]等優(yōu)異性能。如細(xì)菌纖維素膜抗撕拉能力是等厚度聚乙烯膜、聚氯乙烯膜的6倍[7]；其高吸水持水能力，經(jīng)100 ℃干燥后的再溶脹能力與短棉絨相當(dāng)[8]；其聚合度和結(jié)晶度均高于大多數(shù)植物纖維，具有更穩(wěn)定的物理力學(xué)和熱學(xué)性質(zhì)[9]；另外，細(xì)菌纖維素還具有生物相容性、生物可降解性，可以將其用于傷口敷料以及組織工程支架的開發(fā)[10]，是一種新型環(huán)境友好型生物材料。目前，細(xì)菌纖維素作為諸多傳統(tǒng)合成材料的代替品，在生物醫(yī)學(xué)、造紙、化妝品、環(huán)境污染治理以及食品制造等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[11]。

細(xì)菌纖維素自1886年BROWN A J[12]首次報(bào)道以來，因其優(yōu)異的材料性能越來越受到廣泛關(guān)注，尤其是在細(xì)菌纖維素合成菌株篩選、鑒定[5]，細(xì)菌纖維素合成機(jī)理及調(diào)控機(jī)制[10]，細(xì)菌纖維素發(fā)酵工藝優(yōu)化生產(chǎn)[13]，細(xì)菌纖維素表面改性[14]等方面研究報(bào)道較多。然而，目前細(xì)菌纖維素由于生產(chǎn)菌種單一、合成產(chǎn)率低、合成碳源成本高等原因，仍難以滿足應(yīng)用市場(chǎng)對(duì)細(xì)菌纖維素材料的需求[15-16]。

為解決以上問題，本研究以含糖量較多的腐敗葡萄為篩選源，篩選、分離鑒定高產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株，并通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅立葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）、凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）、X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）等觀察、分析測(cè)試手段鑒定獲得菌株合成膜的微觀結(jié)構(gòu)、分子表面的官能團(tuán)特性、分子質(zhì)量分布特征以及結(jié)晶度等，為后續(xù)細(xì)菌纖維素的規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

腐敗葡萄（產(chǎn)地：中國(guó)新疆）：市售。

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（均為生化試劑）：英國(guó)OXOID公司；葡萄糖、十二水合磷酸一氫鈉、氯化銨、氫氧化鈉、無水乙醇、五氧化二磷、硫酸、硝酸、碳酸鈉、二甲基亞砜（均為分析純）：北京化工廠；熒光增白劑：美國(guó)Sigma公司；檸檬酸（分析純）：上海源葉生物公司；五氧化二磷（分析純）：上海阿拉?。ˋladdin）公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基采用馬血清（horse serum，HS）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO42.7 g/L，檸檬酸1.15 g/L，蒸餾水；滅菌條件為120 ℃，20 min。

HS平板篩選培養(yǎng)基：HS液體培養(yǎng)基中加入1～3 μg/mL熒光增白劑和15 g/L瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

FB224電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ZHJH-C1109B超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DW-86L626立式超低溫保存箱：海爾集團(tuán)；BOX EF-E凝膠成像系統(tǒng)：香港基因有限公司；JY-ECP3000電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Life Touch TC-96/G/H聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：杭州博日科技股份有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；DMXY系列光學(xué)顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；Sigma500場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡：德國(guó)蔡司公司；L1600400傅立葉紅外光譜儀、Bruker D8 X射線衍射儀：德國(guó)Bruker（布魯克）公司；Waters1515凝膠滲透色譜儀：美國(guó)Waters公司。

2.2.3 缺乏有效的護(hù)患溝通和知識(shí)宣教。護(hù)士未落實(shí)責(zé)任制整體護(hù)理,往往重視患者的病情,而忽視了對(duì)患者的相關(guān)知識(shí)宣教和心理評(píng)估。長(zhǎng)期置管患者對(duì)管道的自我管理警惕性下降,7例患者中2例T管脫出均是來院拔管的患者。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選

將腐敗葡萄放入HS液體培養(yǎng)基（30 mL）中，30 ℃靜置培養(yǎng)1～3 d，選用液體表面產(chǎn)生纖維素凝膠膜的發(fā)酵液保存待用。

1.3.2 菌株分離純化

取上述從膜上擠壓的發(fā)酵液進(jìn)行濃度梯度稀釋后（10-2、10-4、10-6、10-8、10-10），用各濃度梯度的稀釋液100 μL分別在平板篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，30 ℃靜置培養(yǎng)16～24 h，挑取在紫外燈下發(fā)熒光的單菌落接種到富集培養(yǎng)液中再次富集培養(yǎng)。重復(fù)進(jìn)行上述操作6次，至平板篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)形態(tài)一致的單菌落。

1.3.3 菌株特征觀察

菌落形態(tài)觀察：觀察記錄培養(yǎng)3～5 d的篩選平板培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)，包括菌落色澤、形狀、大小、透明度等。

革蘭氏染色：滴一小滴蒸餾水于干凈的載玻片上，按無菌操作法用接種環(huán)取少許菌體，涂于水滴內(nèi)并做好標(biāo)記，涂勻，干燥，加熱固定；待涂片冷卻后，先滴加結(jié)晶紫染色1 min，用水沖去染液，瀝干，再滴加碘液媒染1 min，去碘液，水洗；以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇脫色20～30 s，水洗，最后滴加番紅復(fù)染2～3 min，水洗，干燥，鏡檢[17]。

生理生化特征：進(jìn)行接觸酶、乙醇氧化成酸[18]、乳酸鹽氧化成CO2和H2O[19]、乙酸鹽氧化成CO2和H2O[20]、甘油轉(zhuǎn)酮、葡萄糖生酮、丙二酸利用[21]、D-山梨醇產(chǎn)酸、麥芽糖產(chǎn)酸、甘露醇產(chǎn)酸、阿拉伯糖利用、Frateu's Hoyer的生長(zhǎng)等項(xiàng)目的檢測(cè)[22]。具體操作參照《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》。

1.3.4 菌株生物學(xué)分類

篩選菌株的16S rDNA擴(kuò)增：利用該菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）為模版，細(xì)菌16SrDNA通用引物1492 R：5'-GGTTAC CTTGTT ACGACT T-3'，27F：5'-AGAGTT TGATCC TGGCTC AG-3'，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增菌株的16S rDNA。擴(kuò)增程序：94 ℃、5 min，94 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃、1 min，72 ℃、7 min，循環(huán)數(shù)30。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收并純化PCR樣品送至吉林庫(kù)美公司進(jìn)行測(cè)序。將該菌株16S rDNA提交到美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）與其他細(xì)菌進(jìn)行比較，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建其分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定該菌株具體生物學(xué)分類。

1.3.5 合成物結(jié)構(gòu)表征

菌株的培養(yǎng)及合成物提?。簲U(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模至100 mL，在30 ℃、7～10 d培養(yǎng)后，取產(chǎn)生的菌膜經(jīng)蒸餾水多次沖洗至菌膜表面無雜物及培養(yǎng)基后，將其置于0.5%的NaOH溶液中，放入100 ℃烘箱中處理2 h，待其冷卻后再用蒸餾水多次沖洗至呈中性，瀝干水分并進(jìn)行凍干處理后得到干膜。

檢測(cè)分析：掃描電鏡觀察（SEM）、吸水性、紅外光譜檢測(cè)（FT-IR）、凝膠滲透色譜（GPC）、X射線衍射（XRD）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選純化結(jié)果

以腐敗葡萄作為篩選源，經(jīng)6次平板涂布篩選得到一株細(xì)菌纖維素合成菌，將其命名為菌株ZX C6-15。

2.2 菌株特征

2.2.1 菌落形態(tài)學(xué)觀察

由圖1A可知，菌株ZX C6-15單菌落呈乳白色、圓形、略微隆起、表面光滑、不產(chǎn)色素、產(chǎn)酸。由圖1B可知，經(jīng)革蘭氏染色制片后光學(xué)顯微鏡（10×100）下看到該菌呈短桿狀、單個(gè)或成對(duì)，顏色反應(yīng)呈紅色，說明ZX C6-15菌株為革蘭氏陰性菌。由圖1C可知，在紫外燈下發(fā)熒光、菌落直徑大約為0.5 mm。

圖1 菌株ZX C6-15菌落形態(tài)（A）、細(xì)胞形態(tài)（B）及紫外觀察結(jié)果（C）Fig.1 Colony morphology (A),cell morphology (B) and ultraviolet observation results (C) of strain ZX C6-15

2.2.2 生理生化檢測(cè)

對(duì)菌株ZX C6-15進(jìn)行生理生化特征檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可知，該菌株與醋酸菌類似，對(duì)接觸酶、阿拉伯糖利用、乙醇氧化成酸、甘油轉(zhuǎn)酮、葡萄糖生酮等反應(yīng)結(jié)果呈陽性，乳酸鹽氧化成CO2和H2O、乙酸鹽氧化成CO2和H2O、丙二酸利用、D-山梨醇產(chǎn)酸、麥芽糖產(chǎn)酸、甘露醇產(chǎn)酸、Frateu's Hoyer的生長(zhǎng)等反應(yīng)結(jié)果呈陰性。

表1 菌株ZX C6-15的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain ZX C6-15

2.3 菌株生物學(xué)分類結(jié)果

菌株ZX C6-15的16S rDNA序列全長(zhǎng)為1 362 bp，分子系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。由圖2可知，菌株ZX C6-15與Acetobacter syzygiistrain SZCPY4：KU555381.1相似性達(dá)到100%，屬于醋酸菌屬，因此將其鑒定為醋酸菌屬（Acetobactersp.）ZX C6-15（NCBI登錄號(hào)為：MT355921.1）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株ZX C6-15系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZX C6-15 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 菌株ZX C6-15產(chǎn)膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)表征

2.4.1 SEM觀察

由圖3可知，Acetobactersp.ZX C6-15菌株產(chǎn)膜的掃描電鏡圖中，菌膜表面有少許殘留物，纖維細(xì)而長(zhǎng)，微纖維互相交叉、纏繞、折疊形成密集網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種超微纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)決定了細(xì)菌纖維素的高持水性。產(chǎn)物掃描電鏡結(jié)果與文獻(xiàn)[23]中的細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)類似。

圖3 醋酸菌ZX C6-15產(chǎn)膜的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy image of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.2 吸水率檢測(cè)

菌株Acetobactersp.ZX C6-15產(chǎn)膜干燥后膜的吸水率測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 醋酸菌ZX C6-15產(chǎn)膜的吸水率測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of water absorption rate of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

由表2可知，該菌產(chǎn)膜的吸水率高于細(xì)菌纖維素模式菌株ATCC23769的吸水率，達(dá)到298%。結(jié)果表明，該菌株提取的產(chǎn)物具有良好的吸水性能，取決于產(chǎn)物具有的網(wǎng)狀納米纖維結(jié)構(gòu)。

2.4.3 FT-IR檢測(cè)

菌株Acetobactersp.ZX C6-15合成的樣品進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)結(jié)果見圖4。由圖4可知，波數(shù)3 352 cm-1處峰型寬且較強(qiáng)的為O-H鍵吸收峰；波數(shù)2 918 cm-1處為C-H鍵吸收峰；波數(shù)1 625 cm-1處為纖維素4'端半縮醛基吸收峰；波數(shù)1 159 cm-1處為C-O鍵吸收峰，與模式菌ATCC23769產(chǎn)ATCC-BC所含有的官能團(tuán)基本吻合，也與MACHADO R T A等[24]的研究結(jié)果相符。結(jié)果表明，Acetobactersp.ZX C6-15菌株產(chǎn)生膜是細(xì)菌纖維素。

圖4 醋酸菌ZX C6-15產(chǎn)膜的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.4 凝膠滲透色譜檢測(cè)

Acetobactersp.ZX C6-15菌株產(chǎn)膜Aceto-BC樣品和模式菌株ATCC23769產(chǎn)膜ATCC-BC樣品進(jìn)行GPC檢測(cè)。將細(xì)菌纖維素樣品于硝酸和硫酸混酸溶液中硝化后，蒸餾水洗滌數(shù)遍，使用5%碳酸鈉溶液浸泡中和后，蒸餾水煮沸30 min。將樣品取出，使用無水乙醇浸泡1 h后過夜烘干。取適量處理后的細(xì)菌纖維素樣品溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中進(jìn)行檢測(cè)，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品為聚甲基丙烯酸酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA），檢測(cè)結(jié)果見表3。由表3可知，菌株ZXC6-15產(chǎn)膜的重均分子質(zhì)量（Mw）為14.1×104kDa，數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）為32.3×104kDa，分散度為2.28。對(duì)比細(xì)菌纖維素模式菌ATCC23769的產(chǎn)物，重均分子質(zhì)量增加，分散度降低，表明該菌株合成的細(xì)菌纖維素的聚合度更高，平均粒徑尺度更均勻。

表3 醋酸菌ZX C6-15菌株產(chǎn)膜的分子質(zhì)量分析Table 3 Molecular mass analysis of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.5 X射線衍射檢測(cè)

菌株Acetobactersp.ZX C6-15產(chǎn)膜樣品Aceto-BC和ATCC-BC進(jìn)行XRD檢測(cè)，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在2θ=14.64°，16.48°和22.74°處出現(xiàn)三個(gè)主要特征峰，分別對(duì)應(yīng)于Ⅰ型纖維素的（1-10），（110）和（200）晶面[25]，表明Aceto-BC屬于纖維素Ⅰ型晶體結(jié)構(gòu)。經(jīng)計(jì)算，Aceto-BC的結(jié)晶度指數(shù)為96%，高于ATCC-BC的結(jié)晶度指數(shù)82%。生物高分子的結(jié)晶度決定其纖維的形態(tài)、材料的分解溫度、拉伸強(qiáng)度等材料性能[26]，該細(xì)菌纖維素具有如此高的結(jié)晶度表明其具有良好材料性質(zhì)。

圖5 醋酸菌ZX C6-15產(chǎn)膜的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction spectrum of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.5 討論

本研究從水果中分離、純化得到能產(chǎn)膜的菌株ZX C6-15的生理生化分析結(jié)果表明該菌株具有接觸酶和甘油轉(zhuǎn)酮活性，但不具有甘露醇產(chǎn)酸、丙二酸利用以及麥芽糖產(chǎn)酸活性，說明菌株ZX C6-15與產(chǎn)酸的醋酸菌區(qū)別較大[27-28]。本研究得到的菌株ZX C6-15盡管與Acetobacter syzygiiSZCPY4具有很高的同源性，但可能是合成細(xì)菌纖維素的屬于醋桿菌的較新菌種。采用SEM、FT-IR、XRD、GPC等檢測(cè)手段對(duì)該菌株產(chǎn)膜的分析結(jié)果表明，該膜與模式菌株ATCC23769所產(chǎn)細(xì)菌纖維素類似，具有比模式菌纖維更致密的3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且具有細(xì)菌纖維素典型基團(tuán)的特征吸收峰。對(duì)比模式菌株ATCC23769所產(chǎn)細(xì)菌纖維素，菌株ZX C6-15合成細(xì)菌纖維素?cái)?shù)均分子質(zhì)量、分散度、結(jié)晶度和吸水率更高，表明該細(xì)菌纖維素的分子質(zhì)量的均度更好，具有更優(yōu)秀的材料性質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究以腐敗葡萄作為篩選源，經(jīng)篩選、分離純化得到一株能夠合成細(xì)菌纖維素且傳代穩(wěn)定性良好的菌株；該菌株可能屬于醋酸菌屬的較新菌種，命名為Acetobactersp.ZX C6-15；對(duì)比細(xì)菌纖維素模式菌ATCC23769，該菌株合成產(chǎn)物具有更致密的典型細(xì)菌纖維素3D納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和分子官能團(tuán)吸收；合成產(chǎn)物細(xì)菌纖維素的重均分子質(zhì)量為14.1×104kDa，分散度為2.28，結(jié)晶度為96%，吸水率為218%，均高于模式菌ATCC23769生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素，表明Aceto-bactersp.ZX C6-15所產(chǎn)細(xì)菌纖維素具有優(yōu)良的理化性質(zhì)和機(jī)械性能。