不同添加劑發(fā)酵處理對汽爆玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量的影響

高雪梅，焦 婷，雷趙民，冉 福，趙生國，李雄雄，秦偉娜，王苗苗

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中–美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

中國作為全球農(nóng)業(yè)大國之一，具有非常豐富的農(nóng)作物秸稈資源。據(jù)統(tǒng)計，2015 年全國主要農(nóng)作物秸稈可收集資源量為9 億t，利用量為7.209 億t，秸稈利用率為80.1%[1]。近年來，玉米秸稈作為反芻動物飼料成為新的研究趨勢[2]，但玉米秸稈中粗纖維含量高，質(zhì)地粗硬，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)較少，適口性差，必須對其進(jìn)行加工處理，以提高消化率，降低粗纖維含量[3]。常見的處理方法主要有物理法、化學(xué)法、生物法和綜合法[4]。

蒸汽爆破技術(shù)是一種物理與化學(xué)相結(jié)合的加工技術(shù)，能夠明顯破壞秸稈纖維結(jié)構(gòu)，顯著降低半纖維素含量，使粗蛋白、可溶性糖等營養(yǎng)成分含量升高[5]。張慧玲等[6]研究發(fā)現(xiàn)，汽爆處理對藜麥(Chenopodium quinoa)秸稈半纖維素、木質(zhì)素具有顯著影響。但經(jīng)汽爆處理后的玉米秸稈含水量一般在60%～80%，無法直接飼喂家畜，需要進(jìn)行干燥或發(fā)酵等處理[7]。楊雪霞等[8]報道表明，將玉米秸稈進(jìn)行汽爆處理后再進(jìn)行固體發(fā)酵，其產(chǎn)物粗蛋白含量高達(dá)16.65%；張志軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，汽爆與汽爆后發(fā)酵處理可改善棉花秸稈的營養(yǎng)價值，降低棉花(Gossypium spp.)秸稈酸性洗滌木質(zhì)纖維素。

在生產(chǎn)中，為了保存秸稈營養(yǎng)品質(zhì)，可將收獲籽實(shí)后的玉米秸稈進(jìn)行厭氧發(fā)酵，但由于原料品質(zhì)的限制，不僅要調(diào)節(jié)水分，還要補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)及微生物菌劑。而汽爆處理可以增加可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)，豐富微生物發(fā)酵底物。若將干黃的玉米秸稈先進(jìn)行汽爆處理，再進(jìn)行發(fā)酵處理，待發(fā)酵完成后便可直接飼喂。但汽爆處理會將玉米秸稈中的各種微生物均殺死，所以需要加入外源乳酸菌等有益微生物來促進(jìn)發(fā)酵。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對微生物添加劑在玉米秸稈營養(yǎng)價值、發(fā)酵品質(zhì)等方面的研究頗多。Liu 等[10]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和纖維素酶的組合能提高青貯全混合日糧[羊草(Leymus chinensis)、甜玉米苞葉、苜蓿(Medicago sativa)和啤酒糟等組成]的青貯發(fā)酵品質(zhì)及營養(yǎng)特性。尉小強(qiáng)等[11]發(fā)現(xiàn)在全株玉米中添加乳酸菌可以有效改善玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)。為此，通過對干黃的玉米秸稈進(jìn)行汽爆預(yù)處理，加入不同添加劑進(jìn)行厭氧發(fā)酵，通過對營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量的綜合評價，篩選最經(jīng)濟(jì)有效的處理方式，以期為提高玉米秸稈利用效率、改善利用方式提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用汽爆原料為上一年收獲籽粒后堆垛的、汽爆前將水分調(diào)為65%～70%、汽爆裝置的汽爆腔壓力1.0 Mpa、維壓10 m in 下汽爆的玉米秸稈(表1)。青貯添加劑宜生貯寶Sila-Max(美國瑞科動物營養(yǎng)公司提供，純化纖維素酶、淀粉、純化纖維素酶，乳酸菌≥ 2 × 1010cfu·g?1)；青貯添加劑Sila-M ix(美國瑞科動物營養(yǎng)公司提供，硅酸鈣、黑曲霉、總鈣含量25%～29.5%，乳酸菌≥ 1.8 × 106cfu·g?1)?；钚岳w維菌(平?jīng)鲮`臺康莊牧業(yè)公司自購，含乳酸菌、纖維素分解菌、纖維素酶、淀粉)。發(fā)酵桶為20 L 圓形旋蓋白色塑料桶。試驗(yàn)在甘肅靈臺康莊牧業(yè)有限公司牛場進(jìn)行。

表 1 玉米秸稈原樣成分Table 1 The nutrient com position of corn straw

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)設(shè)4 個處理，3 種添加劑(Sila-Max、Sila-M ix和活性菌)和1 個空白對照(無添加劑)；汽爆后的玉米秸稈在各添加劑處理下分別進(jìn)行裝桶密封發(fā)酵，每個處理裝6 桶，即6 次重復(fù)，Sila-Max、Sila-M ix 和活性菌添加量分別為0.002 5、1.000 0 和0.500 0 kg·t?1，將添加劑與汽爆原料混勻后裝桶(每桶12～13 kg)，密封，置于室內(nèi)，發(fā)酵60 d。

1.3 測定指標(biāo)

發(fā)酵60 d 后，開桶取樣，去掉上部3～4 cm 的樣品，然后將桶內(nèi)樣品混勻后進(jìn)行取樣，用真空包裝袋保存。將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，在105 ℃ 烘箱內(nèi)烘干、粉碎，進(jìn)行營養(yǎng)品質(zhì)測定。粗蛋白 (crude protein, CP)、粗灰分 (crude ash, Ash)采用張英麗[12]方法測定，中性洗滌纖維 (neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維 (acid detergent fiber, ADF)采用Van Soest[13]方法測定，淀粉 (Starch) 分析按照AACC 方法[14]進(jìn)行，乳酸、揮發(fā)性脂肪酸采用液相色譜儀測定。

將桶子樣品稱重后，把桶中發(fā)霉的部分單獨(dú)取出并稱重，計算發(fā)霉量。發(fā)霉量(m ildew rate) = 樣品發(fā)霉部分含量/樣品重量 × 100%。

各取20 g 發(fā)酵后的新鮮汽爆玉米秸稈，加入180 m L、0.85%的滅菌生理鹽水，稀釋得到適合濃度后，采用平板梯度稀釋法測定青貯料中主要微生物類群數(shù)量(MRS 培基測定乳酸菌數(shù)量，采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定好氧細(xì)菌數(shù)量，采用虎紅瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)量，強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基測定梭菌數(shù)量)。

1.4 綜合評價

利用相關(guān)性分析和主成分分析法將4 個不同處理下的14 個指標(biāo)降維簡化評價指標(biāo)數(shù)量，然后利用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法計算各處理所選指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，并將所選指標(biāo)隸屬函數(shù)值求和，再取均值，以均值大小進(jìn)行排名，均值越大，排名越靠前。

隸屬函數(shù)計算公式[15]:式中：R(Xi)表示某指標(biāo)隸屬函數(shù)值，Xi表示該指標(biāo)的測定值；Xmax表示該指標(biāo)最大值；Xmin表示該指標(biāo)最小值。若測定指標(biāo)與飼料的營養(yǎng)價值呈正相關(guān)關(guān)系，則用式(1)計算；若呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，則用式(2)計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑處理對汽爆玉米秸稈營養(yǎng)品質(zhì)的影響

不同添加劑處理后，汽爆玉米秸稈CP、NDF、ADF、Ash 含量呈現(xiàn)出不同程度的變化(表2)。添加劑組CP 含量較CK 組減少了1.5%～1.7%；NDF含量Sila-Max 組最高，活性菌組最低，二者間無顯著差異(P ＞ 0.05)；淀粉含量活性菌組最高，與CK組、Sila-Max 組差異不顯著(P ＞ 0.05)，與Sila-M ix 組差異顯著(P ＜ 0.05)；添加劑組ADF 含量與CK 相比增加了0.5%～1.6%；Ash 含量Sila-Max 組最低，與對照組無顯著差異(P ＞ 0.05)。

2.2 不同添加劑發(fā)酵處理對汽爆玉米秸稈發(fā)霉量的影響

如表3 所列，Sila-M ix、Sila-Max 組未出現(xiàn)霉變情況，而CK 組和活性菌組均發(fā)霉了，CK 組發(fā)霉量達(dá)7.75%，活性菌組霉變量為5.07%，二者差異不顯著(P ＞ 0.05)。

表 2 不同添加劑發(fā)酵對汽爆玉米秸稈營養(yǎng)品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Effects of different additives on the nutrient content of corn steam exploded straw (basis on dry metter) %

表 3 不同添加劑發(fā)酵對汽爆玉米秸稈發(fā)霉量的影響Table 3 Effects of different additives on moldy amount of steam-exp loded corn straw

2.3 不同添加劑發(fā)酵處理對汽爆玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響

圖 1 不同添加劑發(fā)酵對汽爆玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響Figure 1 Effects of different additives on fermentation quality of steam-exp loded corn straw

如圖1 所示，乳酸含量活性菌組顯著高于其他處理組(P ＜ 0.05)，其余處理間無顯著差異(P ＞ 0.05)；乙酸、丙酸和丁酸含量Sila-Max 處理組最高，顯著高于其他處理(P ＜ 0.05)，其余處理間無顯著差異(P ＞ 0.05)。

2.4 不同添加劑發(fā)酵處理對汽爆玉米秸稈微生物數(shù)量的影響

如表4 所列，Sila-Max 處理組乳酸菌數(shù)量顯著高于其他處理(P ＜ 0.05)，Sila-M ix 組次之；好氧細(xì)菌含量CK 組最高，顯著高于Sila-M ix 組、活性菌組(P ＜ 0.05)，與Sila-Max 組無顯著差異(P ＞ 0.05)；梭菌含量不同處理組差異顯著(P ＜ 0.05)，其中CK 組最高，Sila-M ix 組最低；霉菌含量在Sila-Max 組、Sila-M ix 組中未檢測到，而在CK 組、活性菌組含量較高，二者差異顯著(P ＜ 0.05)。

2.5 主成分分析

根據(jù)特征值大于1 的標(biāo)準(zhǔn)挑選出3 個主成分(表5)，14 個指標(biāo)中前3 個特征值的累積貢獻(xiàn)率達(dá)100%，說明14 個指標(biāo)的相關(guān)信息可由前3 個主成分來概括。其中，第1 主成分的特征值為6.947，貢獻(xiàn)率高達(dá)49.620%，對應(yīng)特征向量中，絕對值較大的性狀為乙酸、丙酸、丁酸、乳酸菌和發(fā)霉量，所以第1 主成分主要代表揮發(fā)性脂肪酸成分；第2 主成分的特征值為4.612，貢獻(xiàn)率達(dá)32.942%，對應(yīng)特征向量中，絕對值較大的性狀為CP、NDF、ADF、淀粉、乳酸，所以第2 主成分代表營養(yǎng)成分；第3 主成分的特征值為2.441，貢獻(xiàn)率達(dá)17.438%，對應(yīng)特征向量中，絕對值較大的性狀為Ash、好氧細(xì)菌、梭菌、霉菌，所以第3 主成分代表微生物成分。

2.6 不同指標(biāo)相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步進(jìn)行主要性狀篩選，對這14 個指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析（表6），丙酸、丁酸、乳酸菌與乙酸極顯著正相關(guān)(P ＜ 0.01)，丙酸與丁酸和乳酸菌極顯著正相關(guān)(P ＜ 0.01)，丁酸和乳酸菌極顯著正相關(guān)(P ＜0.01)，淀粉與ADF 顯著正相關(guān)(P ＜ 0.05)，乳酸與NDF 顯著負(fù)相關(guān)(P ＜ 0.05)，梭菌、霉菌與發(fā)霉量顯著正相關(guān)(P ＜ 0.05)；其余指標(biāo)間無顯著相關(guān)性(P ＞0.05)。

表 4 不同添加劑發(fā)酵對汽爆玉米秸稈微生物數(shù)量的影響Table 4 Effects of different additives on m icrobial population of steam-exp loded corn straw lg cfu·g?1

表 5 主成分分析結(jié)果及各因子成分矩陣Table 5 Principal component analysis results and factor com ponent matrix

表 6 玉米秸稈評價指標(biāo)相關(guān)性矩陣Table 6 Correlation matrix of corn straw evaluation indexes

2.7 綜合得分及排名

綜合主成分分析與相關(guān)性分析結(jié)果，在第1 主成分中選擇乙酸、發(fā)霉量來代表其他性狀，在第2 主成分中選擇CP、NDF 代表其他性狀，第3 主成分中選擇灰分、好氧細(xì)菌來代替其他性狀，采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法進(jìn)行分析，結(jié)果表明(表7)，在所有處理中，Sila-Max 表現(xiàn)最好，平均隸屬值為0.55，其次為Sila-M ix，平均隸屬值為0.42，CK 組平均隸屬值小于0.4，綜合表現(xiàn)較差。

表 7 各因子綜合得分及排序Table 7 Com prehensive score and ranking of each factor

3 討論

3.1 不同添加劑對汽爆玉米秸稈營養(yǎng)成分的影響

CP 含量可以用來衡量粗飼料營養(yǎng)成分在制備過程中的流失或保留，飼料CP 含量越低，飼料品質(zhì)越差[16]。楊雪霞等[8]研究表明，進(jìn)行汽爆處理后再進(jìn)行發(fā)酵可以提高CP 含量。本研究得出相似結(jié)論，經(jīng)汽爆與發(fā)酵處理后，玉米秸稈CP 含量是原玉米秸稈的2.01～2.05 倍，這主要由于汽爆過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)[17]。NDF 和ADF 是反映飼草纖維品質(zhì)最主要的指標(biāo)[18]，ADF 與動物消化率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其含量越低，飼草的消化率越高，飼用價值越高[19]；NDF 影響反芻動物的瘤胃充盈度及采食量，其含量越高，飼料能量越低[20]。本研究中，經(jīng)汽爆與發(fā)酵處理后的玉米秸稈NDF、ADF 含量分別降低了18.16%～20.17%、2.38%～3.94%，說明汽爆與發(fā)酵處理能夠提高玉米秸稈營養(yǎng)品質(zhì)，但不同添加劑處理之間沒有顯著差異，這與Santos 和Avila[21]研究結(jié)果相似。同樣，趙苗苗和玉柱[22]使用乳酸菌添加劑對象草(Pennisetum purpureum)進(jìn)行青貯后，NDF 含量無明顯變化，孫文君等[23]發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌對稻草進(jìn)行青貯，稻草的ADF 和NDF 含量變化也不明顯，由此可以推斷乳酸菌作用效果與青貯原料有關(guān)，本研究中，汽爆后的玉米秸稈原料為上一年收獲籽粒后堆垛的玉米秸稈，其本身營養(yǎng)含量低，導(dǎo)致微生物可利用的底物濃度低，出現(xiàn)添加劑組與對照組CP、NDF、ADF 含量差異不顯著的情況。

從本研究結(jié)果來看，經(jīng)汽爆與發(fā)酵處理后，淀粉含量增加，這可能是在高溫、高濕、高壓條件下，細(xì)胞壁內(nèi)的部分纖維素會發(fā)生降解，產(chǎn)生葡萄糖及其衍生物[17]。而活性菌中添加有纖維素酶及淀粉，Sila-Max 中含純化淀粉酶，所以出現(xiàn)活性菌組淀粉含量增加、Sila-Max 組淀粉含量減少的現(xiàn)象。

3.2 不同添加劑對汽爆玉米秸稈乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的影響

Sila-Max 和Sila-M ix 是兩種青貯飼料乳酸菌類添加劑，Sila-Max 含有能產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶的菌類，而Sila-M ix 含有25.0%～29.5%的CaCO3。纖維活性菌含乳酸菌、纖維分解菌和能產(chǎn)生纖維素酶的菌類。譚樹義等[24]研究發(fā)現(xiàn)，添加纖維素降解酶和乳酸菌，能夠改善玉米秸稈發(fā)酵、保存秸稈原有的營養(yǎng)成分，并提高總揮發(fā)性脂肪酸含量。在青貯發(fā)酵過程中乳酸和乙酸的含量越高則青貯品質(zhì)越好[25]，所以在一定程度上可增加青貯飼料的乳酸、乙酸含量來提高青貯品質(zhì)。苗芳等[26]研究發(fā)現(xiàn)，乙酸等有助于提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性的有機(jī)酸，對減緩或防止青貯飼料二次發(fā)酵有明顯作用。丁酸的發(fā)酵程度是鑒定青貯飼料好壞的重要指標(biāo)，丁酸含量越多，青貯料品質(zhì)越差[27]，一般認(rèn)為優(yōu)質(zhì)的青貯飼料丁酸含量應(yīng)該低于干物質(zhì)含量的1%[28]。本研究中，活性菌組乳酸含量顯著高于其他處理，這是由于纖維活性菌中含有的纖維素酶、淀粉酶對部分纖維素進(jìn)行了分解，豐富了乳酸菌發(fā)酵底物，增加了乳酸含量；Sila-Max 組的乙酸、丙酸含量顯著高于其他處理，丁酸含量最高的Sila-Max 處理組，僅為0.61%，低于優(yōu)質(zhì)青貯飼料標(biāo)準(zhǔn)，說明添加劑Sila-Max 在增加汽爆玉米秸稈乙酸、丙酸含量，防止青貯飼料二次發(fā)酵方面具有較好的效果，這與其含有多種菌類發(fā)酵產(chǎn)物有關(guān)。

3.3 不同添加劑對汽爆玉米秸稈微生物數(shù)量及發(fā)霉量的影響

微生物作為青貯發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素，其種類含量將直接影響青貯發(fā)酵效果。乳酸菌是青貯發(fā)酵過程中最為關(guān)鍵的微生物，是青貯過程中乳酸發(fā)酵的驅(qū)動者[29]，其可以抑制有害微生物的生長繁殖，阻止發(fā)酵原料養(yǎng)分的分解，抑制蛋白質(zhì)在青貯過程中的水解[30]。霉菌會引起青貯飼料腐敗變質(zhì)，并產(chǎn)生霉菌毒素，導(dǎo)致青貯飼料品質(zhì)降低，危害家畜健康[31]。而青貯飼料霉變不僅會造成飼料營養(yǎng)的流失，而且產(chǎn)生的毒素會對畜禽生產(chǎn)者以及食品和飼料的加工企業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，霉變也成了制約反芻動物生產(chǎn)的重要因素[32]。本研究中，添加劑Sila-Max、Sila-M ix 均能增加青貯后玉米秸稈乳酸菌含量，降低梭菌、好氧細(xì)菌和霉菌數(shù)量，防止秸稈霉變；而添加劑活性菌與空白對照處理的玉米秸稈均存在霉菌與霉變現(xiàn)象，從飼料安全無毒方面考慮，在生產(chǎn)中應(yīng)不予考慮。

4 結(jié)論

不同添加劑對汽爆玉米秸稈營養(yǎng)品質(zhì)、揮發(fā)性脂肪酸含量及微生物數(shù)量的作用效果不同：活性菌能夠增加秸稈淀粉、乳酸含量，促使發(fā)酵成功；Sila-Max 可以提高乳酸菌、乙酸、丙酸含量，抑制有害微生物活動，具有抑制二次發(fā)酵的潛力；Sila-M ix能夠提高汽爆玉米秸稈乳酸菌數(shù)量，抑制好氧細(xì)菌、梭菌和發(fā)霉，說明其能抑制有害微生物的活動。通過主成分分析與隸屬函數(shù)法綜合評價表明，Sila-Max具有相對較好的維持和提高汽爆玉米秸稈品質(zhì)的效果。