基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芪-白術(shù)治療新冠肺炎的作用機(jī)制

涂文玲，朱景茹，李墨辭，陳梅妹，楊朝陽(yáng)，甘慧娟*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證研究基地，福建 福州350122；2.福建省2011中醫(yī)健康管理協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州350122；3.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識(shí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122）

爆發(fā)于2019年的新型冠狀病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，NCP，下稱(chēng)“新冠肺炎”）屬于急性呼吸道傳染病，傳染性強(qiáng)，部分感染者癥狀不明顯或者無(wú)癥狀，但是變化速度快。國(guó)家衛(wèi)健委將新冠肺炎納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類(lèi)傳染病，并采取甲類(lèi)傳染病的預(yù)防、控制措施［1］。自《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》開(kāi)始將中醫(yī)藥治療納入治療方案，中醫(yī)藥全程參與了NCP的防治，發(fā)揮著重要作用，彰顯了中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，新冠肺炎患者淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，免疫功能下降是發(fā)病重要原因之一［3］。中醫(yī)認(rèn)為免疫力即是“正氣”，正因?yàn)轶w內(nèi)正氣（免疫力）虛弱才會(huì)導(dǎo)致發(fā)病，因此應(yīng)從益氣補(bǔ)肺、扶正固本來(lái)進(jìn)行治療。董競(jìng)成教授團(tuán)隊(duì)近日發(fā)布新冠肺炎治療方中用黃芪-白術(shù)以顧護(hù)正氣［4］。黃芪甘微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表等功效；白術(shù)甘苦溫，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、固表止汗等功效。兩者與防風(fēng)同用，可益氣固表，祛邪止汗，治療虛人外感。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》和《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，黃芪-白術(shù)被應(yīng)用于恢復(fù)期肺脾氣虛型NCP患者，且在北京、江西、湖北、浙江等省推出的NPC預(yù)防方案中常被使用［5］。馬麗娟等［6］基于數(shù)據(jù)挖掘和關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得出黃芪-白術(shù)是治療新冠肺炎的高頻藥對(duì)?，F(xiàn)代藥理表明黃芪-白術(shù)在機(jī)體中均能不同程度地改善免疫力和機(jī)體免疫反應(yīng)性［7］，但是其作用機(jī)制仍不完整，因此有必要采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法進(jìn)一步探討黃芪-白術(shù)治療新冠肺炎的作用機(jī)制。

1 方 法

1.1 黃芪-白術(shù)有效活性成分收集與篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］，在“herbname”檢索框中分別以“黃芪”“白術(shù)”為檢索詞進(jìn)行檢索，收集黃芪、白術(shù)的活性成分信息。以口服生物利用度（OB≥30%）和類(lèi)藥性（DL≥0.18）為篩選依據(jù)，篩選出黃芪-白術(shù)的活性成分信息。

1.2 黃芪-白術(shù)作用靶點(diǎn)信息獲取 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的黃芪-白術(shù)的活性成分進(jìn)行蛋白靶標(biāo)獲取，然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中UniProtKB檢索功能對(duì)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行逐一檢索，并在檢索結(jié)果中將物種限定為“human”，對(duì)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)的基因名稱(chēng)轉(zhuǎn)換，獲取黃芪-白術(shù)有效活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 新冠肺炎作用靶點(diǎn)獲取 以“novel coronavirus pneumonia”為檢索詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）進(jìn)行檢索，獲取新冠肺 炎 作用靶點(diǎn)。利用Venny2.1.0在線工具，獲得黃芪-白術(shù)與新冠肺炎共同作用靶點(diǎn)，即是黃芪-白術(shù)治療新冠肺炎的作用靶點(diǎn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 把黃芪-白術(shù)的單味藥有效活性成分信息和有效活性成分-作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件（版本：3.7.2），繪制出單味藥有效活性成分網(wǎng)絡(luò)和有效活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，再選擇“Merge”功能將兩者合并成黃芪-白術(shù)的有效活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）“Multipleproteins”檢索框中，蛋白種類(lèi)設(shè)置為“homosapiens”，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建黃芪-白術(shù)與新冠肺炎共同作用靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），并對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.5 GO和KEGG富集分析 對(duì)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。先下載R軟件，在R軟件中進(jìn)行下載并安裝Bioconductor網(wǎng)站中的相關(guān)插件，包含“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”5個(gè)插件；安裝完成后用R軟件進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪-白術(shù)作用靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集、篩選（OB≥30%、DL≥0.18）出黃芪-白術(shù)活性成分27個(gè)，其中黃芪20個(gè)、白術(shù)7個(gè)。剔除未找到蛋白靶標(biāo)的活性成分，獲得19個(gè)有效活性成分（其中白術(shù)與黃芪有一個(gè)相同的活性成分），其中黃芪16個(gè)、白術(shù)4個(gè)，見(jiàn)表1。篩選出的有效活性成分包含槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、蛇床子素（hederagenin）、毛蕊異黃酮（calycosin）等。對(duì)所有獲取的蛋白靶標(biāo)進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換后，去除重復(fù)項(xiàng)，共獲得189個(gè)作用靶點(diǎn)。將篩選、轉(zhuǎn)化后的單味藥、有效活性成分及作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件（3.7.2版本）構(gòu)建黃芪-白術(shù)有效活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。該網(wǎng)絡(luò)包含210個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中圓形節(jié)點(diǎn)為單味藥，共2個(gè)；菱形節(jié)點(diǎn)為有效活性成分，共19個(gè)；六邊形節(jié)點(diǎn)為作用靶點(diǎn)，共189個(gè)。

表1 黃芪-白術(shù)有效活性成分

2.2 黃芪-白術(shù)治療新冠肺炎的作用靶點(diǎn) 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到新冠肺炎作用靶點(diǎn)259個(gè)，將黃芪-白術(shù)的作用靶點(diǎn)和新冠肺炎的作用靶點(diǎn)分別輸入Venny2.1.0在線工具分析，得到共同作用靶點(diǎn)41個(gè)，包括前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、二肽基肽酶4（DPP4）、一氧化氮合酶2（NOS2）、前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合酶1（PTGS1）、鈣調(diào)蛋白1（CALM1）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、絲裂原激活的蛋白激酶14（MAPK14）、RELA原癌基因（RELA）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、BCL2細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑（BCL2）、凋亡調(diào)節(jié)劑（BAX）、半胱天冬酶3（CASP3）、絲裂原激活的蛋白激酶8（MAPK8）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1（STAT1）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、BCL2凋亡調(diào)節(jié)劑（BCL2L1）、Fos原癌基因（FOS）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）、RB轉(zhuǎn)錄核心加壓因子1（RB1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、半胱天冬酶8（CASP8）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、蛋白激酶CAlpha（PRKCA）、熱休克蛋白家族A（Hsp70）成員5（HSPA5）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、CCMotif趨化因子配體2（CCL2）、蛋白激酶CBeta（PRKCB）、一氧化氮合酶3（NOS3）、熱休克蛋白家族B（HSPB1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、絲氨酸（SERPINE1）、白細(xì)胞介素-1A（IL-1A）、聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）、CXC主題趨化因子配體11（CXCL11）、CXC基序趨化因子配體2（CXCL2）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、CXC基序趨化因子配體10（CXCL10）、CD40配體（CD40LG）、干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）。

圖1 黃芪-白術(shù)有效活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將41個(gè)共同作用靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建出這41個(gè)共同作用靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，見(jiàn)圖2。該網(wǎng)絡(luò)包含41個(gè)節(jié)點(diǎn)（即共同作用靶點(diǎn)），430條節(jié)點(diǎn)連接線（連接線表示兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用，粗細(xì)代表相互作用關(guān)系的強(qiáng)弱）。該網(wǎng)絡(luò)平均度值為21（度值指某一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)，度值越大，連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多），其中IL-6、MAPK8、CASP3、MAPK1、CCL2、ICAM1、IL-1B、IL-4、MAPK14、PTGS2、RELA、FOS、EGFR、IL-2、CASP8、HMOX1、BCL2L1、NOS2、PPARG、STAT1、CXCL10和NOS3的度值高于平均度值，即為相對(duì)核心靶點(diǎn)。

圖2 共同作用靶點(diǎn)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析 通過(guò)R軟件進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程富集分析，獲得P＜0.05的GO條目84個(gè)，結(jié)果表明黃芪-白術(shù)治療新冠肺炎過(guò)程主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程，做出前二十名GO富集氣泡圖，見(jiàn)圖3。越紅代表富集程度越高，P值越小。

2.5 KEGG富集分析 通過(guò)R軟件進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，根據(jù)P＜0.05篩選到151條信號(hào)通路，涉及到的信號(hào)通路類(lèi)型主要有病毒感染（人類(lèi)免疫缺陷病毒1感染、eb病毒感染等）、癌癥（小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌等）、信號(hào)傳導(dǎo)（IL-17信號(hào)、TNF信號(hào)、MAPK信號(hào)、P53信號(hào)、HIF-1信號(hào)、VEGF信號(hào)、B細(xì)胞和T細(xì)胞信號(hào)等）等，見(jiàn)表2。

3 討 論

通過(guò)對(duì)黃芪-白術(shù)活性成分、作用靶點(diǎn)查找與篩選，得到19個(gè)有效活性成分，包含槲皮素、山奈酚、蛇床子素、毛蕊異黃酮等。槲皮素具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫等作用［9-10］，能明顯增加淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和T淋巴細(xì)胞數(shù)目［11］；山奈酚具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)功能［12-13］，能有效抑制MAPK通路降低白介素8等炎癥因子產(chǎn)生，且能明顯提高T淋巴細(xì)胞的增殖能力，抑制胸腺細(xì)胞凋亡與巨噬細(xì)胞吞噬［14］；蛇床子素長(zhǎng)期應(yīng)用于皮膚瘙癢、濕疹等皮膚類(lèi)疾病，愈來(lái)愈多研究表明蛇床子素具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、抗癌等生物學(xué)功能［15-16］，彭建明等研究表明蛇床子素能有效促進(jìn)激活肺癌細(xì)胞H1299中促凋亡因子Bax來(lái)抑制NF-kB信號(hào)通路，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡［17］；毛蕊異黃酮是一種具有抗氧化、抗炎、抗癌和免疫調(diào)節(jié)功能的單體活性成分［18-20］。由此可見(jiàn)，黃芪-白術(shù)治療新冠肺炎是通過(guò)這些活性成分起到抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫的作用。

圖3 前二十名GO富集分析氣泡圖

表2 KEGG富集分析結(jié)果（基因數(shù)排名前十）

通過(guò)對(duì)PPI網(wǎng)路分析得出22個(gè)相對(duì)核心靶點(diǎn)。白介素中的IL-6、IL-1β、IL-4、IL-2是調(diào)控范圍最為廣泛的細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用［21］，其中IL-6可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體，也可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和激活從而參與機(jī)體的抗感染免疫和自身免疫。IL-1B是典型的促炎性細(xì)胞因子，炎性信號(hào)可通過(guò)激活炎癥小體而刺激分泌IL-1B，少量的IL-1B可產(chǎn)生適當(dāng)?shù)难装Y應(yīng)答從而激活特異性免疫反應(yīng)，起到免疫監(jiān)視作用［22］，IL-4具有抗炎效應(yīng)，可與具有促炎效應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)生拮抗作用，對(duì)于巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞具有較大影響［23］。IL-2可促進(jìn)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，對(duì)機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)感染的病原體有積極的作用［24］，另外有研究顯示：相對(duì)核心靶點(diǎn)中的CCL2對(duì)T、B淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)大的趨化活性，從而調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫［25］和CASP3在凋亡、抗炎過(guò)程中起到重要作用［26］。

通過(guò)GO富集分析可知，黃芪-白術(shù)對(duì)新冠肺炎的治療作用主要通過(guò)參與以下生物學(xué)過(guò)程而發(fā)揮療效：細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程。進(jìn)一步的KEGG富集分析提示黃芪-白術(shù)主要通過(guò)調(diào)控IL-17、P53、HIF-1、B細(xì)胞、T細(xì)胞等多種信號(hào)通路而達(dá)到治療新冠肺炎的作用。研究表明：IL-17是致炎性細(xì)胞因子，與許多炎癥性疾病和癌癥的易感性相關(guān)［27］，在抗感染、炎癥與自身免疫病的發(fā)生中起重要作用［28］；P53信號(hào)通路能夠?qū)Ψ谓Y(jié)核進(jìn)行免疫調(diào)控作用［29］；HIF-1參與缺氧代償反應(yīng)、免疫反應(yīng)、新生血管的生成與調(diào)節(jié)等［30］，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病密切相關(guān)；B細(xì)胞主要代表體液免疫，由造血干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)［31］，主要產(chǎn)生抗體；T細(xì)胞是一類(lèi)控制體內(nèi)免疫反應(yīng)性細(xì)胞群，在維持機(jī)體免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫方面具有重要作用［32］。

綜合有效活性成分、靶點(diǎn)基因、GO和KEGG富集分析，可表明黃芪-白術(shù)主要是通過(guò)抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫作用以達(dá)到治療新冠肺炎的目的。