低分子肝素應用于早期不良妊娠結局的研究進展

王丹丹，孫大林，金保方

(1.東南大學醫(yī)學院，南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結合男科，南京 210009)

低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)是由普通肝素經酶或化學解聚而得到的平均分子量為4 000～5 000的片段，因其與蛋白質及細胞的結合減少，故具有生物利用度高、抗凝作用持續(xù)時間較長、無須實驗室頻繁監(jiān)測、肝素誘導的血小板減少癥風險及骨質疏松發(fā)生率較低等優(yōu)點[1-3]。近年來，LMWH被廣泛用于防治心腦血管疾病、肝腎疾病、下肢深靜脈血栓、肺栓塞及腫瘤等；同時，因其皮下給藥便于門診治療且不通過胎盤，亦不分泌于乳汁中，故目前逐漸成為生殖醫(yī)學領域防治不良妊娠結局(adverse pregnancy outcome，APO)的常用藥物[4-6]。然而，APO的產生，大多與胚胎染色體異常、自身免疫因素及血栓前狀態(tài)(prethrombotic state，PTS)有關，而LMWH兼具有調節(jié)免疫與抗凝的作用；此外，LMWH亦可作用于滋養(yǎng)細胞，具體表現(xiàn)為促進細胞增殖與遷移，但此效用并非劑量依賴性[7]。既往研究多集中于LMWH對妊娠中晚期APO(包括子癇前期、妊娠期肝內膽汁淤積癥、羊水過少及胎兒宮內生長受限等)的改善，而對早期APO的報道較少。現(xiàn)就LMWH應用于早期APO的研究進展予以綜述，以期為臨床治療提供參考。

1 LMWH的藥理作用

1.1抗凝、抗血栓 LMWH的主要生物學作用是調節(jié)凝血系統(tǒng)[8]。LMWH通過其獨特的戊糖序列與絲氨酸蛋白酶抑制劑抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)結合，繼而使AT-Ⅲ發(fā)生構象改變，導致AT-Ⅲ由凝血因子Ⅱa(又稱凝血酶)和凝血因子Ⅹa的慢速滅活劑變?yōu)榭焖贉缁顒罱K增強AT-Ⅲ的抗凝活性[9]。然而，凝血酶失活需要分子鏈長度至少為18個糖單位的肝素、AT-Ⅲ和凝血酶形成三元復合物，而LMWH分子鏈很少能達到以上長度，故對凝血酶的活性降低，即抗凝血因子Ⅹa/抗凝血因子Ⅱa比值約為4；由于減少了對凝血因子Ⅱa的抑制作用，LMWH在保持抗凝作用的同時降低了出血風險[10]。此外，LMWH亦可促進纖溶酶原向纖溶酶轉化，阻斷纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，進而起到抗血栓的作用，并降低血小板減少癥的發(fā)生風險[2]。

1.2抗炎 20世紀60年代，有學者提出了肝素可能具有抗炎作用，隨后一系列研究[10-12]證實了這一觀點。Poterucha等[10]認為，炎癥參與血栓形成，主要通過破壞內皮細胞功能、局部招募白細胞和促進促凝環(huán)境實現(xiàn)，且肝素作為炎癥的調節(jié)劑有其特定生物學基礎，可能通過多個水平發(fā)揮抗炎作用，具體表現(xiàn)為：①抑制中性粒細胞活化；②與血管內皮細胞相互作用，進而阻止激活固有免疫系統(tǒng)的炎癥介質(核因子κB、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、白細胞介素-8和白細胞介素-1β)表達；③抑制血管平滑肌細胞增殖；④通過抗凝作用抑制炎癥。值得注意的是，LMWH抗炎的作用并不弱于普通肝素。此外，有學者提出LMWH亦可能通過免疫途徑抑制炎癥，如Sheikhansari等[12]推測，LMWH可能通過結合選擇素、整合素后阻止白細胞黏附、抑制補體活化，進而發(fā)揮抗炎作用。

1.3免疫調節(jié) LMWH主要通過免疫細胞及細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)作用。如Hao等[8]提出，肝素通常儲存于肥大細胞顆粒中，而肥大細胞脫顆粒與血管通透性增加引起變態(tài)反應有關。此外，有文獻報道，LMWH可以抑制抗磷脂抗體產生的免疫反應，促進滋養(yǎng)細胞的增殖、侵襲及分化，抑制滋養(yǎng)細胞凋亡，保護血管內皮，促進胎盤形成[13]。另有研究報道，LMWH及乙二醇分裂肝素衍生物(一種改良型非抗凝劑LMWH)均可與可溶性fms樣酪氨酸激酶受體1相互作用，促進胎盤絨毛組織釋放胎盤生長因子，增強胎盤條件培養(yǎng)基中內皮細胞的形成，并通過抑制補體激活、白細胞與活化內皮細胞的黏附來抑制炎癥反應[14]。可見，LMWH具有非抗凝作用，但仍需進一步研究。

1.4抗腫瘤 LMWH可以通過與多種介質(如生長因子、黏附分子和酶)相互作用來干擾腫瘤的生物學過程，其具體機制可能為：①抑制血管生成；②抑制淋巴管生成；③抗轉移(包括抑制腫瘤細胞對內皮細胞的黏附、抑制腫瘤細胞-血小板-中性粒細胞復合物的形成、促進自然殺傷細胞清除腫瘤細胞)；④調節(jié)CXC趨化因子配體12、CXC趨化因子受體4和組織因子途徑抑制物來促進腫瘤細胞凋亡；⑤增加抑癌基因、減少原癌基因，從而直接調節(jié)腫瘤細胞功能[15]。此外，有學者推測，LMWH可能通過與P選擇素的相互作用進而減少腫瘤的轉移[8]?？傊琇MWH抗腫瘤的作用機制較為復雜，目前尚不完全清楚，需進一步深入研究。

1.5降脂 此外，LMWH還具有降血脂的作用。李良玉等[16]通過構建高脂血癥小鼠模型并喂養(yǎng)不同劑量的肝素類物質，觀察到高劑量LMWH可降低小鼠三酰甘油水平，且LMWH的降血脂能力優(yōu)于普通肝素；并進一步提出，LMWH可能通過其戊糖結構與膽固醇、膽酸形成復合物，繼而抑制脂肪吸收、促進脂肪降解及排泄來降低血脂。陳杰等[17]通過臨床對照研究發(fā)現(xiàn)，加用LMWH治療2周可有效降低妊娠中期血脂異常孕婦的三酰甘油、總膽固醇及低密度脂蛋白水平，進而降低妊娠期糖尿病及高血壓的發(fā)病風險。

1.6其他 除上述作用外，有文獻報道，LMWH還具有抗病毒及抑制氧化應激的作用[8，18]。Bal Dit Sollier等[19]發(fā)現(xiàn)，LMWH之所以具有以上特殊藥理作用的原因為：其能夠與內皮細胞上的糖萼發(fā)生交換。此外，有研究顯示，對LMWH的結構進行修飾可以構建出多種衍生物，進而更有針對性地應用于臨床[15]。可見，LMWH仍具有很大的臨床應用潛力，值得學者們深入挖掘與研究。

2 LMWH在改善早期APO方面的臨床應用

APO是指與妊娠、分娩相關并發(fā)癥對母體和胎兒近期或遠期的影響[20]。APO是一泛指名詞，對母體近期的影響主要為子癇前期、妊娠期糖尿病、妊娠期肝內膽汁淤積癥、產后出血等；而對胎兒的影響主要為流產、死胎、胎兒宮內生長受限、胎兒畸形、新生兒窒息等；以及對母體遠期心血管疾病的影響[20-21]。其中，APO根據妊娠時長又可分為早期(妊娠12周內)和中晚期。既往文獻報道多集中在與APO發(fā)生相關的影響因素上[22]，而關于LMWH對其防治方面的研究較少。以下主要介紹LMWH在改善早期APO方面的應用，包括反復種植失敗(recurrent implantation failure，RIF)、反復生化妊娠(recurrent biochemical pregnancy，RBP)及早期復發(fā)性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)等。其中，RIF屬于著床失敗的一種類型，發(fā)生于應用輔助生殖技術治療中。RIF大多是由于胚胎與子宮內膜建立緊密聯(lián)系之前的某個環(huán)節(jié)發(fā)生異常，導致胚胎不能著床；而RBP是指胚胎已經開始著床，其分泌的人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)進入母體血液并達到可檢測出的水平，但沒有繼續(xù)妊娠至能用超聲診斷出孕囊的階段；RSA則是發(fā)生在胚胎著床以后臨床妊娠的丟失?？梢?，RIF、RBP及RSA均屬于APO的范疇，但發(fā)生在不同的生理階段[23]。然而，也有學者提出，RSA應該包括連續(xù)發(fā)生的生化妊娠[24]。

2.1RIF 隨著輔助生殖技術的應用，目前RIF已成為限制其發(fā)展的熱點與難點問題。RIF通常被定義為移植4個或4個以上高質量胚胎后，仍未能實現(xiàn)臨床妊娠，其患病率為10%～15%[25-26]。有學者提出，胚胎成功種植的免疫機制包括：①胚胎滋養(yǎng)細胞、胎盤膜能保護胚胎不受母體免疫細胞的攻擊；②絨毛外滋養(yǎng)細胞中人類白細胞抗原Ⅰ類分子表達的改變，能夠調節(jié)母胎界面母體成分中自然殺傷細胞、巨噬細胞和輔助T淋巴細胞的功能；③各種細胞因子(白細胞介素-10、白細胞介素-4等)和補體在母胎界面的免疫調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用[27]。胚胎作為半同種異體移植物，不僅與母胎界面免疫調節(jié)密切相關，且其種植是否成功與胚胎質量、子宮內膜容受性(endometrial receptivity，ER)兩方面因素均有關。ER通常是指子宮內膜在激素調控下、月經周期的第20～24天(“種植窗”)內處于允許胚胎著床的接受狀態(tài)[28]。既往有關胚胎種植的研究大多以胚胎為中心，而對子宮內膜因素的研究較少。近年來，國內外學者針對ER降低進而影響RIF的研究逐漸增多，主要集中在子宮內膜厚度、形態(tài)類型及子宮動脈血流上。如土增榮等[29]研究發(fā)現(xiàn)，粒細胞集落刺激因子聯(lián)合LMWH能明顯改善薄型子宮內膜(厚度≤7 mm)RIF患者的胚胎種植率及臨床妊娠率。譚小方等[28]觀察并提出，LMWH能夠降低RIF患者子宮動脈血流阻力指數和血流速度峰谷比，增加胚胎種植時子宮動脈的血供、提高ER，進而改善種植結局。此外，牛凱迪等[30]提出良好的ER可能減少RIF的發(fā)生，且ER與基因多態(tài)性、免疫細胞、黏附分子及非編碼RNA均有內在的聯(lián)系，有待進一步深入研究。然而，Siristatidis等[31]提出，LMWH與潑尼松聯(lián)合應用于RIF患者并不能提高臨床妊娠率。這與上述研究結果相互矛盾，但不排除樣本量過小引起的臨床偏倚。另外，有學者亦關注到LMWH的降脂作用與體重及RIF之間的相關性。如齊改梅等[32]提出，LMWH能提高PTS合并超重的RIF患者再次移植的妊娠成功率。因此，需進一步研究LMWH降血脂的具體作用機制，以期為改善早期APO提供新思路。

2.2RBP 生化妊娠是指發(fā)生在妊娠5周以內、血或尿中HCG陽性而超聲檢查宮內未見孕囊的早期流產[33]。而RBP是指連續(xù)發(fā)生≥2次的生化妊娠[13]。RBP病因復雜，有文獻報道，自身免疫異常、輔助生殖、自然流產≥3次是其獨立危險因素[34]。目前，許多研究集中在影響輔助生殖技術中生化妊娠發(fā)生的ER上，但臨床尚無評價ER的統(tǒng)一指標與共識。林丹換和覃春容[35]提出，ER的超聲學評估指標主要包括子宮內膜厚度、形態(tài)類型及血流動力學參數，且三者綜合評價ER時效果較可靠。相關研究報道也大多集中在以上幾個方面，但結果并不完全統(tǒng)一。如陳國慶和喬寵[36]認為，HCG注射日或黃體生成素峰日子宮內膜厚度<9 mm、子宮內膜息肉<2 cm、子宮內膜形態(tài)呈B型的患者發(fā)生生化妊娠的可能性大。楚琪等[37]則認為，薄型子宮內膜雖是影響ER的主要因素之一，但其閾值定義尚不明確，因此不能作為輔助生殖技術妊娠結局的預測指標。亦有學者提出，子宮內膜區(qū)動脈血流信號數雖對 ER有一定的預測價值，但與生化妊娠的發(fā)生可能沒有必然聯(lián)系[38]?？梢?，ER的超聲學診斷指標尚不明確，仍需進一步總結規(guī)律并制訂相應標準。此外，學者們亦通過在基因水平上尋找ER的標志物(同源框基因A10、血小板內皮細胞黏附分子1、黏蛋白1等)來探究LMWH提高ER的相關機制[30，39]。如牛凱迪等[39]通過米非司酮構建胚泡植入障礙模型證實，LMWH可通過Wnt通路提高ER，并推測其作用機制可能與血小板內皮細胞黏附分子1相關。另外，臨床隊列研究發(fā)現(xiàn)，生化妊娠可能會影響下次妊娠結局，因此預測生化妊娠的發(fā)生顯得尤為重要[40]。Tarin等[41]進一步總結發(fā)現(xiàn)，在經歷一系列體外受精/卵胞質內單精子注射治療周期的女性中，生化妊娠病史與日后活產率呈負相關，并提出導致生化妊娠的最后胚胎移植周期數、女性年齡及少、弱、畸精子癥3個預測因子可以很好地預測日后的活產率。以上研究結果對于臨床預測具有很好的借鑒意義。

總之，ER是影響胚胎植入的一大因素，目前已知LMWH可通過Wnt通路提高ER，是否存在其他通路尚在研究中；且LMWH是否通過提高ER進而改善RBP，仍需進一步探索與驗證。

2.3RSA RSA是指自然流產2次及2次以上、在妊娠28周前的胎兒丟失，其發(fā)生率為1%～5%[24，42]；早期RSA則多發(fā)生于妊娠12周以內。RSA病因復雜，涉及遺傳、內分泌、免疫、感染、解剖、環(huán)境及PTS等因素。其中，PTS導致RSA的證據等級為Ⅰ級；PTS主要分為遺傳性和獲得性兩大類，前者與凝血及纖溶相關基因突變有關，后者主要包括抗磷脂綜合征、獲得性高半胱氨酸血癥以及其他引起血液高凝狀態(tài)的疾病。對于遺傳與基因突變類的PTS，目前沒有針對性的治療手段；故大多數研究通過減少血栓形成及調節(jié)免疫失衡防治獲得性PTS。如有學者提出，抗磷脂綜合征中的抗磷脂抗體通過與內皮細胞、中性粒細胞、血小板和單核細胞相互作用促進血栓形成，此為“第一次打擊”；加上制動、感染、炎癥、外傷及口服避孕藥等“第二次打擊”因素，共同促進了母-胎界面血栓的形成[43]。另外，仍有30%～40%的流產原因不明，稱為不明原因復發(fā)性流產(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)，可能與母-胎免疫耐受失衡有關[44]。梁昀等[45]進一步研究表明，T細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序分子可能通過調節(jié)性T細胞發(fā)揮維持母-胎免疫耐受的作用。

此外，臨床亦存在LMWH聯(lián)合用藥或單藥使用來防治早期RSA的相關報道。如梁慶芬[46]報道，黃體酮、HCG加用LMWH治療URSA患者可以有效促進胚胎生長發(fā)育。隨后有文獻進一步報道，單用LMWH同樣可以提高URSA患者的妊娠成功率并減少并發(fā)癥的發(fā)生[47]。一項Meta分析顯示，LMWH聯(lián)合阿司匹林治療URSA患者提高活產率的機制，可能表現(xiàn)為保護血管內皮細胞、調節(jié)細胞增殖、降低血液黏度，最終改善子宮胎盤微循環(huán)[48]。然而，Schleussner等[49]研究表明，每日注射LMWH不會增加URSA患者的持續(xù)妊娠率或活產率，且考慮到注射的負擔，不建議將其用于防治流產。Rodger等[50]的Meta分析同樣顯示，LMWH似乎并不能降低RSA的風險。

可見，LMWH治療RSA時，首先需要充分評估患者，根據患者具體情況及其各項檢查、化驗指標，然后決定LMWH使用預防劑量還是治療劑量，進而確定用藥療程及停藥時間，同時監(jiān)測相關指標，盡量避免LMWH使用不當造成的出血、過敏等不良反應的發(fā)生。

3 小 結

LMWH是一種呈酸性帶負電荷的聚合物，具有與多種蛋白質結合的非特異性潛能。目前其所知的藥理作用主要歸因于與各種蛋白質的結合能力，如AT-Ⅲ、細胞黏附分子、生長因子等；但其降脂的藥理作用缺乏高級別循證資料證實。此外，LMWH在防治RIF、RBP及RSA等早期APO中所發(fā)揮的作用及效果仍存在爭議，亟須進行多中心、規(guī)范化的臨床隨機對照試驗，以期闡明LMWH發(fā)揮作用的確切機制，從而提供更精準的診治策略。另外，ER的評判標準缺乏規(guī)范，且增加ER標志物含量提高ER的研究尚處于基礎實驗階段，仍需制訂統(tǒng)一標準，并通過大量臨床研究進一步驗證。