苦蕎葉黃酮對(duì)糖尿病小鼠的肝腎保護(hù)效果及機(jī)制

李濤，韓雪梅，許效群，韓克光*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，長期存在的高血糖會(huì)導(dǎo)致各種組織受損，特別是造成眼、肝、腎、脾、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害以及功能障礙。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)（International Diabetes Federation，IDF）公布：2015 年用于糖尿病醫(yī)療保健的支出高達(dá)6 730 億美元；同年全球4.15 億糖尿病成年患者及3.18 億存在患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的人群中，中國占三分之一［1］。在我國糖尿病的發(fā)病率以每年100 萬的速度增加［2］。目前主要通過藥物控制血糖水平來減少高血糖對(duì)各組織器官的損傷，然而這些藥物可引起不同程度的不良反應(yīng)［2，3］。近年來，天然黃酮類化合物作為安全、有效的降糖降脂物質(zhì)引起國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，但不同來源的天然黃酮其構(gòu)成與功效不同。本課題組前期研究結(jié)果表明，盛花期的苦蕎葉黃酮化合物含量高達(dá)10.25%，遠(yuǎn)高于苦蕎籽粒及其它植物資源。提取的苦蕎葉黃酮（Fagopyrum tataricumleaf flavone，F(xiàn)LF）可促進(jìn)糖尿病模型小鼠胰島β 細(xì)胞的修復(fù)，具有顯著的降糖效果［4］，本研究將探討FLF 在降糖過程中對(duì)糖尿病小鼠臟器病損的保護(hù)修復(fù)作用及機(jī)制，為苦蕎葉黃酮及天然降糖物質(zhì)的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FLF 由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院苦蕎深加工研究課題組提供，由超聲波萃取、大孔吸附樹脂純化而得，純度為90%。鏈脲佐菌素為Sigma 產(chǎn)品，鹽酸二甲雙胍（Metformin Hydrochloride，Met）購自北京索萊寶，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、胰島素（INS）的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高速電動(dòng)勻漿器（天津恒奧），D-3752 高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma），723 可見分光光度計(jì)（上海菁華）；DNM-9606 酶標(biāo)分析儀（北京普朗）；RM2015 切片機(jī)（德國Leica）；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics）。

1.3 糖尿病小鼠模型的建立、分組、處理及樣品采集

清潔級(jí)ICR 雄性小鼠［（體質(zhì)量20±2）g］購自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［SCXK（晉）2015-0001］，通過高脂高糖飼料和腹腔注射鏈脲佐霉素（Streptozocin，STZ）建立糖尿病小鼠模型［4］，將建模成功的小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組（Model）、鹽酸二甲雙胍（Metformin hydrochloride）治療組（Met150 mg·kg-1bw）和3 個(gè)FLF 干預(yù)組，每組10只，另取10 只健康小鼠作為正常對(duì)照組（Nomal）。FLF 的高、中、低3 個(gè)劑量組分別為FLF-H（200 m·kg-1bw）、FLF-M（150 mg·kg-1bw）和FLF-L（100 mg·kg-1bw）。所有小鼠均飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，每日灌胃相應(yīng)的受試物，N 組和M 組灌胃等體積生理鹽水，期間測(cè)定小鼠體重，持續(xù)4 周后，脫頸處死小鼠，摘取肝臟和腎臟，稱重后，部分組織用于制備石蠟切片，剩余部分制成10%組織勻漿液，離心取上清液，-20℃保存。

1.4 切片制作及染色

肝和腎的組織切塊經(jīng)10%甲醛溶液固定后制備組織石蠟切片，切片厚度為4 μm，附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，經(jīng)二甲苯脫蠟處理和乙醇梯度脫水后，蘇木素伊紅染色，依次再經(jīng)95%、100%乙醇、二甲苯∶石碳酸（3∶1）、二甲苯處理后，中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。

1.5 臟器指數(shù)和抗氧化能力檢測(cè)

各臟器指數(shù)為臟器濕重與體質(zhì)量之比。嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定小鼠肝臟、腎臟組織中的SOD、GSH-PX、MDA 含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 5 軟件分析數(shù)據(jù)，所用數(shù)據(jù)以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，組間采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

表1 各組小鼠體重變化情況Table 1 Changes of mice body weight（g）in different groups during 4-week treatment 單位：g

2 結(jié)果與分析

2.1 FLF 對(duì)DM 小鼠體重的影響

由表1 可見，糖尿病模型小鼠和正常小鼠的體重在灌胃受試物之前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)期間，N 組小鼠體重逐漸增加，M 組體重則不斷下降，第5 天時(shí)，M 組體重便顯著低于N 組（P＜0.05）。Met 組與FLF 高劑量組在給藥第5 天，體重顯著高于M 組（P＜0.05），中、低劑量組則分別在給藥第9 天和第13 天顯著高于M 組（P＜0.05）。給藥第9 天直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，Met 和FLF 高劑量組的小鼠體重均極顯著高于M 組（P＜0.01），以上結(jié)果說明FLF 可很好地改善糖尿病小鼠的體重下降情況，且呈一定的劑量效應(yīng)。

2.2 FLF 對(duì)DM 小鼠肝腎臟器指數(shù)的影響

由圖1 可見，M 組小鼠的肝臟、腎臟指數(shù)顯著高于N 組（P＜0.001），肉眼觀察明顯腫大。給藥4周后，F(xiàn)LF 各組及Met 組的肝臟、腎臟指數(shù)均極顯著低于M 組（P＜0.01 或P＜0.001），說明FLF 可明顯抑制糖尿病小鼠的肝臟和腎臟腫大。由圖1還可知，在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，F(xiàn)LF 劑量越大，抑制肝腎腫大的效果越好。

2.3 FLF 對(duì)DM 小鼠肝臟和腎臟T-SOD、GSHPX 水平的影響

超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性反應(yīng)機(jī)體的抗氧化水平，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。由圖2 可見，與N 組相比，M 組小鼠肝、腎組織中的T-SOD 和GSH-PX 含量極顯著下降（P＜0.001），說明DM 發(fā)生過程中小鼠肝臟和腎臟的抗氧化能力受損，器官處于氧化脅迫之下。給藥4 周后，與M 組相比，F(xiàn)LF 各劑量組及Met 組小鼠肝腎組織中的T-SOD 和GSH-PX 含量均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001），且呈劑量效應(yīng)，F(xiàn)LF高劑量組的改善效果甚至優(yōu)于藥物組，在數(shù)值上已經(jīng)接近正常組水平。

圖1 苦蕎葉黃酮對(duì)糖尿病小鼠肝臟指數(shù)（左）和腎臟指數(shù)（右）的影響Fig.1 Effects of flavonoids extracted from F.tataricum leaves on the liver（left）and the kidney（right）index of diabetes mellitus mice

圖2 苦蕎葉黃酮對(duì)糖尿病小鼠肝臟和腎臟組織T-SOD、GSH-PX 含量的影響Fig.2 Effect of flavonoids from F.tataricum leaves on liver and kidney T-SOD，GSH-PX levels of diabetes mice

2.4 FLF 對(duì)DM 小鼠肝臟腎臟MDA 水平的影響

丙二醛（MDA）是最常見的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量反映機(jī)體的脂質(zhì)過氧化程度和受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，從而間接反應(yīng)組織的受損程度。由圖3 可見，M 組小鼠肝腎組織中的MDA 含量極顯著高于N 組（P＜0.001）。給藥4 周后，除FLFL 組肝臟的MDA 含量外，其余處理組的MDA 含量均顯著低于M 組（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001），并且MDA 的含量隨著FLF 劑量的增大而減小，且FLF-H 組與Met 組差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 苦蕎葉黃酮對(duì)糖尿病小鼠肝臟和腎臟MDA 含量影響Fig.3 Effect of flavonoids from F.Tataricum leaves on MDA levels in liver and kidney of diabetes mice

2.5 苦蕎葉黃酮對(duì)糖尿病小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

對(duì)各組小鼠肝臟組織進(jìn)行HE 染色，觀察病理變化，N 組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)整，肝細(xì)胞呈多邊形，分布整齊，大小均一，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周放射排列（圖4）。M 組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，肝索結(jié)構(gòu)不清晰，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等不被染色的異常顆粒（圖4B 處），肝竇不清晰、有出血（圖4A 處）現(xiàn)象，肝臟組織嚴(yán)重受損。Met 組及FLF 高劑量組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肝索結(jié)構(gòu)較為清晰（圖4E 處），肝細(xì)胞排列較為整齊，胞內(nèi)異常顆粒減少，細(xì)胞炎癥、壞死、出血現(xiàn)象顯著改善。

圖4 各組小鼠經(jīng)HE 染色的肝臟組織切片圖（400×）Fig.4 HE stained liver sections of mice from different groups（400×）

2.6 苦蕎葉黃酮對(duì)Ⅱ-型糖尿病小鼠腎臟組織形態(tài)的影響

N 組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，細(xì)胞排列整齊，腎小管上皮細(xì)胞未見異常，無炎性細(xì)胞浸潤；M 組小鼠的腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒變性（圖5B 處）、空泡變性（圖5D 處），體積腫大，有少量的腎小管上皮細(xì)胞核固縮，壞死，腎間質(zhì)中可見多量淋巴細(xì)胞浸潤（圖4C 處），結(jié)締組織增生，腎組織纖維化。與M 組相比，Met 組及FLF 各劑量組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)明顯改善，腎小管上皮細(xì)胞可見輕微的顆粒變形、腫大，未見明顯壞死、炎性細(xì)胞浸潤、出血。

圖5 各組小鼠經(jīng)HE 染色的腎臟組織切片圖Fig.5 HE stained kidney sections of mice from different groups

3 討論

來自蕎麥不同部位的黃酮提取物均具有降糖降脂效果［5～12］。氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)生過程中具有重要作用，研究者證實(shí)了銀杏葉［13］、沙棘果［14］、杭白菊［15］、紫蘇［16］、桑葉［17］等其它植物來源黃酮提取物對(duì)DM 模型小鼠或大鼠抗氧化功能的改善作用。劉小娜等研究者指出蕎麥黃酮在降糖過程中對(duì)糖尿病動(dòng)物模型的腎臟保護(hù)作用與其具有降糖、降脂、降 低 非 酶 糖 基 化 及 氧 化 應(yīng) 激 水 平 相 關(guān)［18～20］。FLF 已經(jīng)被證實(shí)對(duì)DM 小鼠具有降糖降脂作用［4］，本研究證實(shí)了其對(duì)DM 小鼠肝臟和腎臟病理損傷的修復(fù)效果，并揭示了其增強(qiáng)肝、腎組織抗氧化能力的機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，DM 小鼠肝腎組織中的TSOD、GSH-PX 含量顯著下降，MDA 含量顯著升高，意味著這些器官的抗氧化能力顯著下降，自由基的產(chǎn)生與清除失衡，自由基不斷累積使這些臟器遭受高水平的氧化應(yīng)激［21，22］，引起組織受損和過度的細(xì)胞凋亡，因而病理切片可觀察到肝和腎發(fā)生了明顯的水腫、炎癥、出血、壞死等病變，所以腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，糖尿病腎病嚴(yán)重可導(dǎo)致腎功能衰竭。而肝臟是糖類、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的重要場(chǎng)所，又是機(jī)體很重要的內(nèi)分泌器官之一［23］，肝組織的上述病變導(dǎo)致代謝受阻，進(jìn)一步加劇了糖尿病小鼠的糖、脂代謝紊亂。大量研究表明，糖尿病患者幾乎都存在著自由基代謝紊亂的現(xiàn)象［24］，機(jī)體內(nèi)自由基水平直接影響糖尿病患者病情的發(fā)展［23，25］，因此糖尿病必須得及早進(jìn)行控制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)LF 可顯著提高糖尿病小鼠肝、腎、脾中T-SOD、GSH-PX 含量，顯著降低MDA 含量，說明FLF 能有效地清除糖尿病小鼠體內(nèi)的自由基，減少自由基造成的細(xì)胞損傷，使糖尿病小鼠的肝臟和腎臟指數(shù)顯著下降，病理切片可觀察到FLF 對(duì)受損肝腎組織明顯的修復(fù)效果。

4 結(jié)論

糖尿病可引起小鼠的肝臟和腎臟病變，F(xiàn)LF 在降糖、降脂過程中，通過增加肝腎組織的抗氧化活性，減少氧化應(yīng)激損傷，消除炎癥和組織壞死來修復(fù)DM 小鼠受損肝臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu)，恢復(fù)其生理功能，且具有量效關(guān)系。