LncRNA-TDRG1促進宮頸癌細胞惡性生物學(xué)行為的實驗研究

范 陽，劉明暉，張逢香，張敏閣，田科寧，賀化鳳，王 芳，鄒余糧

(1. 西安航天總醫(yī)院婦科，陜西西安 710010；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061)

宮頸癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計，全球每年新增宮頸癌確診病例近53萬例，發(fā)展中國家與宮頸癌相關(guān)的死亡人數(shù)顯著高于發(fā)達國家[1-2]。盡管手術(shù)、放療、化療等單獨治療或聯(lián)合治療方法已取得了一定進展，但仍有相當(dāng)一部分患者因復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而長期生存率不佳[3]。因此，探索宮頸癌的發(fā)病機制，并尋找新的診斷和治療方法具有重要臨床意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類超過200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本家族，這些核苷酸缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，但與多種癌癥的生物活性密切相關(guān)[4]。最近，新發(fā)現(xiàn)的睪丸發(fā)育相關(guān)基因1(human testis development-related gene 1, TDRG1)是一種新的人類睪丸特異性基因，轉(zhuǎn)錄本為1.1 kb，位于6p212.1-p21.2，全長1.18 kb，包含2個外顯子和1個內(nèi)含子[5]。TDRG1最初被認(rèn)為是精子活力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]，并參與睪丸生殖細胞腫瘤的發(fā)生和進展[7]。此外，TDRG1作為生殖器官相關(guān)的lncRNA，在上皮性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的細胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[8-9]。然而，TDRG1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其潛在的分子調(diào)控機制尚未充分闡明。

1 資料與方法

1.1 主要試劑RNA提取試劑盒：GenEluteTMTotal RNA Purification Kit(Sigma-Aldrich, Germany)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：Prime Script RT Reagent Kit(TaKaRa, Ohtsu, Shiga, Japan)。熒光定量試劑盒：SYBR Premix ExTaqTMⅡ kit (TaKaRa, Ohtsu, Shiga, Japan)。細胞轉(zhuǎn)染：LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA)。FITC/PI凋亡試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA, USA)。TDRG1及管家基因GAPDH引物由上海生工生物公司合成。引物序列：lncRNA-TDRG1(F 5′-TCTTCCCTGGCTTGGC-3′；R 5′-TGGGCTCTTTCGTGGC-3′)；GAPDH(F 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′；R 5′-TGGTG-AAGACGCCAGTGGA-3′)。

1.2 細胞株宮頸癌細胞株：Siha(目錄號：TCHu113)、Hela(目錄號：TCHu187)、C-33A(目錄號：TCHu176)、Caski(目錄號：TCHu137)購自上海中國科學(xué)院細胞庫；正常宮頸細胞株Ect1/E6E7(編號：BNCC339959)購自北京北納生物細胞庫。細胞復(fù)蘇后，使用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在含50 mL/L CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，當(dāng)細胞鋪滿培養(yǎng)板70%～90%時，使用Lipofectamine 3000進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說明書進行，轉(zhuǎn)染48 h后處理細胞，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.3 實時定量PCR按RNA提取試劑盒說明書，提取培養(yǎng)細胞的總RNA，并進行質(zhì)控。將總RNA(1 μg)按照Prime Script RT Reagent Kit說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ kit說明書，確定轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，將獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，使用FastStart Essential DNA Green Master (Roche)檢測lncRNA-TDRG1表達，實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)反應(yīng)條件：95 ℃變性10 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。所有樣品均設(shè)復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt計算和標(biāo)準(zhǔn)化lncRNA-TDRG1的相對表達量。

1.4 CCK-8和細胞平板克隆實驗采用CCK-8和細胞平板克隆實驗檢測細胞的增殖能力。CCK-8檢測：轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，將細胞接種到96孔板，每孔5 000個細胞。在細胞培養(yǎng)的不同時間點(0、24、48、72 h)，每孔加入約100 μL CCK-8稀釋液，將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度(A)值，測定細胞活力。細胞平板克?。簩⒓毎臃N到6孔板，每孔300個細胞，正常培養(yǎng)14 d。最后對細胞集落進行成像和計數(shù)。所有檢測均設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 Transwell實驗采用Transwell實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力。侵襲實驗：將無血清培養(yǎng)基中的2×105個細胞加入到Matrigel膠包被的Transwell小室中。將含有200 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基加入下方腔室。48 h后，用棉簽將Transwell膜上表面殘留的細胞擦去，將細胞用甲醇固定，然后10 g/L結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下成像和計數(shù)。遷移實驗：將無血清培養(yǎng)基中的2×105個細胞加入無基質(zhì)膠包被的Transwell小室中，后續(xù)操作同侵襲實驗。

1.6 流式細胞學(xué)檢測采用流式細胞學(xué)檢測細胞凋亡。按照FITC/PI凋亡試劑盒說明書進行，siRNAs轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用Annexin V結(jié)合緩沖液(5×106/mL)重懸。然后細胞與Annexin V/FITC避光混合5 min。在細胞溶液中加入10 μL PI染料和400 μL PBS，采用BD流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

1.7 Western blotting檢測將TDRG1-siRNA和Negative-siRNA轉(zhuǎn)染Hela細胞48～72 h后，棄去培養(yǎng)上清，用PBS洗滌細胞，置于冰上，每孔加入100 μL的細胞裂解液，10 min后，用細胞刮收集裂解后細胞于EP管，低溫(4 ℃)、12 000 r/min，離心20 min，棄上清后向EP管中加入5×的上樣緩沖液，100 ℃蛋白變性5 min，BCA測定蛋白濃度。配制120 g/L的SDS-PAGE分離膠和50 g/L的上層膠，加入細胞總蛋白進行凝膠電泳，按照分子量切膠，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，50 g/L的新鮮配制脫脂牛奶封閉，加入一抗孵育，4 ℃冰箱搖床過夜。用TBST洗滌，次數(shù)不少于3次，每次大于5 min，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)室溫孵育約1 h。同樣，TBST洗滌3次，進行ECL化學(xué)發(fā)光。用ChemiDocTM XRS+儀器和配套的Image Lab TM軟件檢測蛋白條帶的灰度值并計算。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 不同類型宮頸癌細胞株中TDRG1的表達水平qRT-PCR檢測4種不同類型的宮頸癌細胞株(Hela、Caski、C-33a和Siha)及正常宮頸細胞株(Ect1/E6E7)中的TDRG1表達水平。結(jié)果顯示，TDRG1在宮頸癌細胞株(Hela、Caski、C-33a和Siha)中的表達明顯高于正常宮頸細胞株(Ect1/E6E7)(Helavs. Ect1/E6E7，t=10.34，P<0.05；Caskivs. Ect1/E6E7，t=11.63，P<0.05；C-33avs. Ect1/E6E7，t=8.49，P<0.05；Sihavs. Ect1/E6E7，t=12.06，P<0.05，圖1)。同時，和其他類型宮頸癌細胞株(Caski、C-33a和Siha)比較，Hela細胞株中的TDRG1表達水平相對較高(Helavs. Caski,t=6.22，P<0.05；Helavs. C-33a,t=7.84,P<0.05；Helavs. Siha,t=9.32,P<0.05，圖1)。

圖1 不同類型宮頸癌細胞株中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達水平Fig.1 The expression of lncRNA-TDRG1 in different cell lines of cervical cancer與Ect1/E6E7組比較，*P<0.05；與Caski、C-33a、Siha組比較，#P<0.05。

2.2 下調(diào)TDRG1表達抑制宮頸癌細胞增殖和集落形成qRT-PCR檢測TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染Hela細胞中TDRG1的表達，結(jié)果顯示,經(jīng)TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染后，Hela細胞中TDRG1的表達明顯低于對照組(Negative-siRNA)(t=8.51，P<0.001，圖2A)。采用CCK-8和細胞平板克隆實驗檢測細胞增殖能力，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)各個時間點(24、48、72 h)，TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞的增殖能力明顯低于陰性對照組(24 h：t=4.23，P<0.05；48 h：t=6.16，P<0.05；72 h：t=8.51，P<0.01，圖2B)。同時，TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞的克隆數(shù)量明顯低于對照組[(162±21)vs. (411±33)，t=11.53，P<0.05，圖2C]，提示下調(diào)TDRG1表達可抑制Hela細胞的集落形成。

圖2 下調(diào)lncRNA-TDRG1表達抑制Hela細胞的增殖和集落形成Fig.2 Downregulation of lncRNA-TDRG1 inhibited the proliferation and colony formation of Hela cells與Negative-siRNA組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 下調(diào)lncRNA-TDRG1表達抑制宮頸癌細胞的侵襲與遷移能力Transwell實驗檢測宮頸癌細胞侵襲與遷移能力的結(jié)果顯示，與陰性對照組(Negative-siRNA)相比，TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染后，Hela細胞的侵襲[(86±13)vs. (315±38)，P<0.01]和遷移[(177±22)vs. (406±41)，P<0.01]數(shù)量均明顯減少(圖3)，提示下調(diào)TDRG1表達會抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力。

圖3 下調(diào)lncRNA-TDRG1表達抑制Hela細胞的侵襲和遷移能力Fig.3 Downregulation of lncRNA-TDRG1 inhibited the invasion and migration of Hela cells與Negative-siRNA組比較，**P<0.01。

2.4 下調(diào)lncRNA-TDRG1表達抑制Bcl-2蛋白表達并促進宮頸癌細胞凋亡流式細胞學(xué)檢測宮頸癌細胞凋亡水平，結(jié)果顯示，與陰性對照組(Negative-siRNA)相比，TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染組Hela細胞的凋亡比例明顯升高[(28%±1.5%)vs. (16%±1.2%)，P<0.05，圖4A]。同時，Western blotting檢測宮頸癌細胞中Bcl-2蛋白表達的結(jié)果顯示，TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染組Hela細胞中Bcl-2蛋白表達量明顯減少(P<0.05，圖4B)，提示TDRG1下調(diào)會促進宮頸癌細胞的凋亡水平。

圖4 下調(diào)lncRNA-TDRG1表達抑制Bcl-2蛋白表達并促進宮頸癌細胞凋亡Fig.4 Downregulation of lncRNA-TDRG1 inhibited the expression of Bcl-2 and induced apoptosis of cervical cancer cells與Negative-siRNA比較，*P<0.05。

2.5 下調(diào)lncRNA-TDRG1表達抑制宮頸癌細胞的自噬活性Western blotting檢測宮頸癌細胞中細胞自噬活性相關(guān)蛋白表達的結(jié)果顯示，與陰性對照組(Negative-siRNA)相比，TDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染組Hela細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達減少，LC3-Ⅰ蛋白向LC3-Ⅱ蛋白的轉(zhuǎn)化明顯減弱[LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ：(2.2%±0.2%)vs. (4.8%±0.5%)，P<0.05]；同時，細胞中p62蛋白的蓄積明顯增加(P<0.05，圖5)，提示下調(diào)TDRG1表達會明顯抑制宮頸癌細胞的自噬活性。

圖5 下調(diào)lncRNA-TDRG1表達抑制宮頸癌細胞的自噬活性Fig.5 Downregulation of lncRNA-TDRG1 inhibited the autophagy activity of cervical cancer cells與Negative-siRNA組比較，*P<0.05。

3 討 論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)有很高的發(fā)病率和致死率[10]。對于宮頸癌患者而言，能夠早期診斷和治療是獲得良好預(yù)后的關(guān)鍵。因此，尋找新的臨床生物標(biāo)志物或者可干預(yù)靶點，對于宮頸癌的早期診斷和治療以及預(yù)后判斷非常重要。

近年來的研究證實，宮頸癌中存在多種lncRNAs的異常表達，其作為癌基因或抑癌基因，參與了宮頸癌的病理進程[11]。例如，高水平的lncRNA-AFAP1AS1和lncRNA-CASC15與宮頸癌患者預(yù)后有關(guān)[12-13]。LINC01305沉默靶向?qū)m頸癌細胞中的TNXB，抑制PI3K/Akt信號通路，阻礙癌細胞的EMT、侵襲和遷移過程，為宮頸癌的潛在治療靶點提供了新的見解[14]。宮頸癌細胞中人乳頭瘤病毒E6/E7基因與lncRNA-TMPOP2的表達具有協(xié)同促進作用[15]。lncRNA-ZFAS1在宮頸癌組織中表達上調(diào)，沉默ZFAS1可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，增強腫瘤對順鉑的化學(xué)敏感性[16]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，lncRNA-TDRG1在宮頸癌組織中呈現(xiàn)出相對高表達狀態(tài)，并且其表達水平和宮頸癌患者的臨床病理分期和預(yù)后顯著相關(guān)[17]。本研究在不同的宮頸癌細胞株中證實了lncRNA-TDRG1的表達，發(fā)現(xiàn)與其他類型宮頸癌細胞株(Caski、C-33a和Siha)比較，Hela細胞株中的lncRNA-TDRG1表達相對較高，這可能和腫瘤細胞的惡性程度高低有關(guān)。利用篩選出的宮頸癌Hela細胞株，成功構(gòu)建了TDRG1-siRNA，并下調(diào)了Hela細胞中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達水平。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA-TDRG1下調(diào)后，Hela細胞的增殖、侵襲和遷移能力均明顯減弱，且細胞集落形成能力也大為降低。這說明lncRNA-TDRG1可能通過促進宮頸癌細胞的惡性生物學(xué)轉(zhuǎn)變，對患者的臨床進展和預(yù)后產(chǎn)生不良影響。

多項研究表明，lncRNA表達水平可影響宮頸癌細胞的凋亡水平。例如，利多卡因通過調(diào)控lncRNA-MEG3/miR-421/BTG1通路，抑制宮頸癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[18]。ARFHPV E7癌基因、lncRNA HOTAIR、miR-331-3p及其靶標(biāo)NRP2形成負反饋環(huán)調(diào)控細胞凋亡，促進HPV陽性宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-TDRG1下調(diào)會增加Hela細胞凋亡；同時，Bcl-2蛋白表達減少。Bcl-2是重要的癌基因，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，例如，microRNA-744通過調(diào)控Bcl-2誘導(dǎo)的細胞凋亡，抑制宮頸癌的生長和進展[20]。Bcl-2蛋白高表達的癌細胞具有更強的耐藥性[21]。因此，推測lncRNA-TDRG1可能通過促進Bcl-2翻譯抑制宮頸癌細胞的凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Hela細胞中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達會對腫瘤細胞自噬活性造成影響。自噬是細胞的一種自我保護機制，在細胞中形成自噬小體，實現(xiàn)物質(zhì)和能量循環(huán)利用。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的自噬行為有可能是細胞Ⅱ型程序性死亡，稱為過度自噬現(xiàn)象[22]。在本研究中，lncRNA-TDRG1表達被抑制時，Hela細胞的自噬活性明顯降低，這和TDRG1促進精原細胞瘤TCam-2細胞自噬活性作用一致[23]。結(jié)合Hela細胞凋亡明顯增加，提示lncRNA-TDRG1可促進宮頸癌細胞產(chǎn)生自我保護性自噬行為，利于維持腫瘤細胞穩(wěn)態(tài)。

研究表明，lncRNA具有多種生物學(xué)功能[24]，如介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)、組蛋白修飾，干擾下游基因表達；結(jié)合蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄本，形成互補雙鏈DNA復(fù)合體，干擾mRNA切割或?qū)е逻x擇性剪接，或產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；與特定蛋白結(jié)合以調(diào)節(jié)其活性；與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；結(jié)合特定蛋白質(zhì)改變蛋白質(zhì)細胞定位等。因此，lncRNA-TDRG1在宮頸癌中以何種方式作用于下游信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能，其分子機制仍需進一步探索。

綜上所述，lncRNA-TDRG1可明顯影響宮頸癌細胞的惡性生物學(xué)行為，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起積極作用，并與患者的不良預(yù)后直接相關(guān)。lncRNA-TDRG1可能作為潛在的診斷和治療靶點，為宮頸癌的治療帶來新的希望。