柚皮素通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞極化

游麗萍，謝發(fā)江，馮 健，蘭 卓，何夕松，李亞菲，李家富

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是在沒(méi)有血壓異常和冠狀動(dòng)脈疾病伴隨情況下由糖尿病引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。在糖尿病心臟組織中，巨噬細(xì)胞受局部微環(huán)境的影響分化為不同表型并向環(huán)境中分泌不同細(xì)胞因子，發(fā)揮不同功能，這一過(guò)程稱(chēng)之為巨噬細(xì)胞極化[1]。在DCM中，主要分化為促炎型巨噬細(xì)胞(M1型)和抗炎型巨噬細(xì)胞(M2型)兩種類(lèi)型，小分子G蛋白R(shí)hoA和其下游效應(yīng)分子Rho激酶(ROCK)參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)和細(xì)胞骨架重組[2]。研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號(hào)通路過(guò)度激活是DCM心肌纖維化的關(guān)鍵機(jī)制之一[3]。在1型糖尿病小鼠模型中，ROCK抑制劑法舒地爾(F)可能通過(guò)抑制M1型極化、誘導(dǎo)M2型極化進(jìn)而減輕DCM心肌纖維化[4]。進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)，高糖通過(guò)激活RhoA/ROCK信號(hào)通路刺激巨噬細(xì)胞向M1型活化并產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子。

柚皮素(naringenin, NAR)是柑橘類(lèi)植物中主要的黃烷酮類(lèi)化合物。研究發(fā)現(xiàn)，NAR能夠下調(diào)RhoA/ROCK信號(hào)通路，改善1型糖尿病小鼠心肌纖維化，保護(hù)心臟功能[5]，但其是否可通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化尚不明確。本研究通過(guò)高糖條件下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞模擬糖尿病高糖環(huán)境，并予以NAR干預(yù)后觀察巨噬細(xì)胞極化表型，探討NAR影響巨噬細(xì)胞極化的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、藥品與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 RAW264.7細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 C3 transferases protein購(gòu)自Cytoskeleton公司，Murine IFN-γ購(gòu)自Peprotech公司，LG-DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸法舒地爾、甘露醇、D-無(wú)水葡萄糖購(gòu)自上海思域化工科技有限公司；一氧化氮合酶(NOS)分型測(cè)試盒購(gòu)自南京建成有限公司，LG-DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)購(gòu)自日本DOJINDO公司；BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒購(gòu)自武漢阿斯本公司；抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-10抗體均購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司；抗CD80和CD206抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，抗RhoA抗體、ROCK1、抗ROCK2抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗p-MYPT1 Thr853 、iNOS和Arginase-1(Arg-1)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；抗MYPT1購(gòu)自Proteintech公司，抗β-actin抗體、山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Cytomat 10C細(xì)胞培養(yǎng)箱、TSE400D超低溫冰箱、DR-200Bs全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Multifuge X3臺(tái)式超速離心機(jī)、Micro CL冷凍離心機(jī)、9700 PCR儀均為Diatek公司產(chǎn)品；GNP9160恒溫培養(yǎng)箱為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋、sw-cj-2f型超凈工作臺(tái)均為蘇州凈化公司產(chǎn)品；倒置生物顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀為北京六一儀器廠公司產(chǎn)品；FACS Calibur流式儀為美國(guó)Becton-Dickinson公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)及iNOS活性測(cè)定 以100 mL/L FBS、10 g/L青霉素/鏈霉素、1 g/L葡萄糖的LG-DMEM培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基，細(xì)胞在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以第4代、第5代傳代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，為模擬巨噬細(xì)胞在DCM體內(nèi)的表型，RAW264.7細(xì)胞在含不同濃度葡萄糖(1、2、4、5、6 g/L)DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間(0、12、24、48 h)；以1 g/L葡萄糖為普通培養(yǎng)條件，100 U/mL IFN-γ[6]處理RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)其分化為M1型巨噬細(xì)胞；37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)細(xì)胞，分別在以上時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性：取出RAW264.7，PBS洗滌細(xì)胞2～3次，離心收集細(xì)胞懸液，用2 mL玻璃勻漿器破碎細(xì)胞，取破碎好的勻漿液收集于EP管中，取上清液50 μL按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定iNOS活性，同時(shí)測(cè)定樣本蛋白濃度。

1.2.2NAR的配制及毒性檢測(cè) 取適量NAR粉末溶于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)溶劑中，配置成濃度為20 mmol/L保存液，在-20 ℃條件下保存。使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋配制成所需濃度，并且保證DMSO最終在培養(yǎng)基中濃度不超過(guò)0.1%。

RAW264.7細(xì)胞按每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入含不同終濃度的NAR(0、20、40、60、80、100 μmol/L)DMEM培養(yǎng)液處理24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下吸光度(A)。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率百分比：細(xì)胞存活率(%)=(A處理組/A對(duì)照組)×100%。每個(gè)濃度的樣本設(shè)立5個(gè)重復(fù)孔，篩選出實(shí)驗(yàn)所需NAR合適的濃度以排除其毒性作用而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 LG-DMEM、HG-DMEM分別為含1、5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基，取傳代3～4代的RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板(每孔約2×105個(gè)細(xì)胞)，對(duì)照組分為正常對(duì)照(NG)和滲透壓對(duì)照(NG+M)，NG組加入2 mL LG-DMEM，以LG-DMEM為稀釋液配制濃度為4 g/L甘露醇(mannitol，M)混合液，NG+M組加入2 mL甘露醇混合液；藥物處理前用HG-DMEM作稀釋液分別配制濃度為60 μmol/L NAR、30 μmol/L法舒地爾[7]、2 μg/mL C3轉(zhuǎn)移酶[8]的混合液，HG組加入2 mL HG-DMEM，HG+NAR組加入2 mL NAR混合液，HG+F組加入2 mL法舒地爾混合液，HG+C3組加入2 mL C3轉(zhuǎn)移酶混合液；將6孔板置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blotting檢測(cè)RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1、iNOS、Arg-1蛋白表達(dá) 用PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞2～3次，加入適當(dāng)體積的RIPA裂解液(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，根據(jù)樣品濃度確定上樣量，保證每個(gè)樣品總蛋白上樣量均為40 μg。按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，切膠，300 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于 50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，除去封閉液后抗RhoA、抗ROCK1、抗ROCK2、抗MYPT1、抗p-MYPT1、抗iNOS、抗Arg-1加入一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜5 min×3次；加入Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育30 min，TBST洗膜5 min×4次，化學(xué)發(fā)光法定影顯色，將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度值；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5ELISA法測(cè)定IL-6、TNF-α、IL-10濃度 收集細(xì)胞懸液，4 ℃、2 000 g×10 min離心，去不溶物，取上清-20 ℃保存?zhèn)溆茫凑誆LISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-6、TNF-α、IL-10濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)分選M1、M2巨噬細(xì)胞 為了鑒定細(xì)胞表型，細(xì)胞在冰冷的PBS中洗滌3次，然后用FITC-抗鼠CD80、FITC-抗鼠CD206、PE-抗鼠iNOS、PE-抗鼠Arg-1抗體標(biāo)記；在4 ℃下孵育20 min，用流式細(xì)胞儀分析標(biāo)記細(xì)胞(Becton-Dickinson，圣何塞，CA，美國(guó))。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 iNOS活性的檢測(cè)結(jié)果給予含不同葡萄糖質(zhì)量濃度的DMEM完全培養(yǎng)液刺激后，隨質(zhì)量濃度增加RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS活性提高，在5 g/L葡萄糖及24 h時(shí)活性達(dá)最大值，大于5 g/L質(zhì)量濃度時(shí)活性降低；與IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞所繪得的折線圖相比較，5 g/L葡萄糖組的iNOS活性曲線與IFN-γ活性曲線最接近(圖1)，IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞向M1型分化，提高細(xì)胞內(nèi)iNOS活性，可以認(rèn)為該葡萄糖質(zhì)量濃度能最大程度刺激巨噬細(xì)胞分化。因此，選擇5 g/L葡萄糖作為本實(shí)驗(yàn)的高糖刺激質(zhì)量濃度，藥物干預(yù)時(shí)間為24 h。

圖1 葡萄糖不同劑量和各培養(yǎng)時(shí)間下RAW264.7的iNOS活性Fig.1 Activity of iNOS after RAW264.7 cultured with glucose at various dose and timeA：RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS活性隨葡萄糖質(zhì)量濃度變化的曲線；B：RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS活性隨時(shí)間變化的曲線。n=3，與1 g/L對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 NAR毒性的檢測(cè)結(jié)果與0 μmol/L組相比，NAR的濃度在20、40、60、80 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞活性影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而當(dāng)NAR濃度達(dá)100 μmol/L時(shí)，RAW264.7巨噬細(xì)胞活性下降(P<0.05，圖2)。因此，選擇以NAR濃度60 μmol/L作為下一步NAR干預(yù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

圖2 柚皮素對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of naringenin on cell viability

2.3 NAR下調(diào)RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白和iNOS蛋白表達(dá)并上調(diào)Arg-1蛋白表達(dá)RhoA/ROCK信號(hào)通路包括RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白，其中MYPT1為ROCK下游底物分子之一，p-MYPT1為MYPT1(Thr853)磷酸化，與NG相比，NG+M組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖3)，排除滲透壓對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，后述實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再贅述，n=3，與0 μmol/L組比較，*P<0.05。

HG組RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1表達(dá)增加，M1型標(biāo)記分子iNOS表達(dá)增加，M2型標(biāo)記分子Arg-1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)；與HG組相比，HG+NAR組、HG+F組、HG+C3 transferase組RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1表達(dá)降低，M1型標(biāo)記分子iNOS表達(dá)下降，M2型標(biāo)記分子Arg-1表達(dá)增高(P<0.05，圖3)，HG+NAR組與陽(yáng)性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 Western blotting檢測(cè)各組RAW264.7細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT、p-MYPT、iNOS、Arg-1蛋白的表達(dá)及比較Fig.3 The protein levels of RhoA, ROCK1, ROCK2, MYPT, p-MYPT, iNOS and Arg-1 in different groups determined by Western blottingn=3，與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

2.4 NAR減少炎癥因子IL-6、TNF-α分泌并增加抗炎因子IL-10分泌與NG相比，HG組炎癥因子TNF-α、IL-6分泌增加，抗炎因子IL-10分泌減少(P<0.05)；與HG組相比，HG+NAR組、HG+F組、HG+C3 transferase組炎癥因子TNF-α、IL-6分泌降低，抗炎因子IL-10分泌增加(P<0.05)，HG+NAR組與陽(yáng)性對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖4)。

圖4 ELISA檢測(cè)各組RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的變化及比較Fig.4 The cytokines levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 in different groups determined by ELISAn=3，與NG組比較，*P<0.05，**P<0.01; 與HG組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.5 NAR減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞數(shù)量而增加M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量且M1/M2比值降低與NG相比， HG組M1細(xì)胞數(shù)量增多，M2細(xì)胞數(shù)量減少，M1/M2比值增大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與HG組相比， HG+NAR、HG+F組、HG+C3 transferase組M1細(xì)胞數(shù)量減少，M2細(xì)胞數(shù)量增多，M1/M2比值減小(P<0.05)，HG+NAR組與陽(yáng)性對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖5)。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組RAW264.7細(xì)胞極化表型Fig.5 The proportion of M1 and M2 in RAW264.7 detected by flow cytometryn=3, 與NG組比較，*P<0.05，**P<0.01; 與HG組比較，#P<0.05。

3 討 論

3.1 DCM巨噬細(xì)胞極化的研究現(xiàn)狀目前認(rèn)為糖尿病及其并發(fā)癥是全身慢性低度炎癥性病變，DCM與心肌細(xì)胞肥大、壞死、凋亡、CFs增殖和間質(zhì)區(qū)纖維膠原沉積增加有關(guān)，病理性纖維化嚴(yán)重影響心室順應(yīng)性[9]，早期表現(xiàn)為舒張功能障礙，晚期出現(xiàn)收縮功能障礙[10]。在DCM中，血糖、血脂異常及巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致炎性因子分泌，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑和心肌纖維化，導(dǎo)致心臟炎癥-纖維化病理發(fā)展[11-13]。FANG等[14]在1型糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)抑制小鼠體內(nèi)促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生有助于減輕糖尿病小鼠腎臟和心臟纖維化，保護(hù)糖尿病小鼠心腎功能；巨噬細(xì)胞是心臟組織的主要免疫細(xì)胞，參與心肌損傷后重構(gòu)；新生心肌組織中駐留巨噬細(xì)胞主要來(lái)源于卵黃囊和胎兒?jiǎn)魏俗婕?xì)胞，通過(guò)原位增殖穿插分布在心肌細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中，駐留細(xì)胞發(fā)揮著維持穩(wěn)態(tài)、組織修復(fù)、血管生成、免疫監(jiān)督等作用，當(dāng)心肌發(fā)生炎變或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，血單核細(xì)胞募集到心臟組織中并受微環(huán)境影響誘導(dǎo)其增殖分化成為主要的巨噬細(xì)胞群[15]；與Th1/Th2命名法相似，巨噬細(xì)胞經(jīng)歷兩種不同的極化狀態(tài)：經(jīng)典激活的M1表型和選擇性激活M2表型，M1型可通過(guò)IFN-γ、脂多糖(LPS)、集落細(xì)胞刺激因子(GM-CS)等誘導(dǎo)分化，IL-4、IL-13、IL-33主要為M2型誘導(dǎo)因子；這些巨噬細(xì)胞早期主要分化為M1型，以無(wú)氧糖酵解為產(chǎn)生能量的方式以適應(yīng)組織缺氧的微環(huán)境，產(chǎn)生活性氧(ROS)、氮中間體、IL-1β和IL-6等效應(yīng)分子發(fā)揮促炎作用加速組織損傷，心肌損傷后期，血單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞從血單核細(xì)胞池中獨(dú)立出來(lái)成為駐留巨噬細(xì)胞M2型，高表達(dá)清道夫受體、甘露醇受體、半乳糖受體、Arg-1、IL-10、IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)等發(fā)揮抗炎效應(yīng)及促進(jìn)組織修復(fù)[16-17]；在DCM中，巨噬細(xì)胞主要分化為炎癥型(M1型)和抗炎型(M2型)兩種類(lèi)型，其中M1型占主導(dǎo)地位，分泌IL-6、TNF-α等炎性因子[18]；增加M2型數(shù)量能夠增加IL-10等抗炎因子表達(dá)，減輕糖尿病誘導(dǎo)的心肌纖維化[19]。JIN等[20]發(fā)現(xiàn)，在DCM大鼠心肌組織內(nèi)以M1型為主，灌輸間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)M2型極化，促進(jìn)心臟組織修復(fù)。JADHAV等[21]在Zucker糖尿病大鼠模型中通過(guò)測(cè)定大鼠體內(nèi)單克隆抗體ED1和ED2表達(dá)水平分別量化M1、M2巨噬細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病組ED1表達(dá)顯著升高，ED2顯著減少，血紅素可逆轉(zhuǎn)Zucker大鼠向M1型極化，降低炎癥/氧化介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-1β、核因子NF-κB、c-JNK和AP-1表達(dá)，增加胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子胰島素受體底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB)的活性進(jìn)而改善胰島素抵抗及糖尿病大鼠心臟血液動(dòng)力學(xué)。以上對(duì)糖尿病動(dòng)物模型的研究顯示，過(guò)度的炎性反應(yīng)及巨噬細(xì)胞極化在DCM發(fā)病機(jī)制中的重要地位。

3.2 NAR通過(guò)下調(diào)RhoA/ROCK通路抑制M1極化并誘導(dǎo)M2極化NAR是柚皮苷的苷元，通過(guò)保護(hù)線粒體功能、抑制炎癥反應(yīng)和血管組織損傷等機(jī)制改善肥胖、高血壓、高脂血癥、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等代謝綜合征[22]。RhoA/ROCK信號(hào)通路包括RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白，其中MYPT1為ROCK下游底物分子之一，p-MYPT1為MYPT1(Thr853)磷酸化水平，p-MYPT1反映ROCK活性。本實(shí)驗(yàn)C3轉(zhuǎn)移酶、法舒地爾分別抑制RhoA、ROCK活性作為對(duì)照，Western blotting顯示NAR顯著降低RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，下調(diào)RhoA/ROCK通路活性。目前研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟缺血再灌注損傷模型中，ROCK抑制劑法舒地爾促使肝臟和外周血中的Kupffer細(xì)胞/單核細(xì)胞從M1轉(zhuǎn)化為M2減輕肝臟炎癥[23]；法舒地爾降低1型糖尿病小鼠M1型標(biāo)記分子及炎癥介質(zhì)表達(dá)，增加M2標(biāo)記分子和抗炎介質(zhì)表達(dá)[24]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HG組RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白表達(dá)增加、炎性因子iNOS、TNF-α、IL-6增多，M1型增加，證實(shí)RhoA/ROCK信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的潛在機(jī)制，NAR與法舒地爾、C3轉(zhuǎn)移酶組均顯著降低高糖刺激的巨噬細(xì)胞RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，增加抗炎分子分泌，誘導(dǎo)M2型極化。據(jù)此認(rèn)為NAR通過(guò)下調(diào)RhoA/ROCK通路改善巨噬細(xì)胞極化，其具體的下游靶點(diǎn)暫未進(jìn)一步研究。

3.3 NAR通過(guò)RhoA/ROCK通路改善DCM目前認(rèn)為NAR改善DCM可能與下列機(jī)制有關(guān)：①上調(diào)環(huán)氧二十碳三烯酸-細(xì)胞色素P450氧化酶通路(EETs-CYP2J3)，激活過(guò)氧化物酶體增長(zhǎng)因子活化受體(PPARs)表達(dá)改善糖尿病小鼠心肌肥厚[25]；②抑制瘦素介導(dǎo)的促分裂素原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路激活，減少高糖心肌細(xì)胞凋亡、ROS生成和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)耗散[26]；③降低葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶12(caspase 12)的基因和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)活性進(jìn)而減輕DCM大鼠心肌細(xì)胞線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激損傷[27]；④上調(diào)EETs/PPARs相關(guān)信號(hào)通路預(yù)防心肌細(xì)胞因高糖刺激引起的肥大[28]，下調(diào)蛋白激酶(PKC-β)蛋白表達(dá)、抑制NADPH氧化酶活性改善糖尿病小鼠心肌纖維化[29]。YANG等[30]通過(guò)高糖培養(yǎng)大鼠原代心肌成纖維細(xì)胞(CFs)激活RhoA/ROCK信號(hào)通路促進(jìn)I型前膠原蛋白表達(dá)及CFs增殖，發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑Y27632處理后膠原蛋白表達(dá)和CFs增殖減少；LAI等[31]用ROCK抑制劑法舒地爾喂養(yǎng)的糖尿病大鼠心肌纖維化得到改善，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)RhoA/ROCK信號(hào)通路，從而促進(jìn)舒張期Ca2+清除和肌動(dòng)蛋白重構(gòu)；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NAR下調(diào)1型糖尿病小鼠心肌組織內(nèi)RhoA/ROCK蛋白表達(dá)，改善心肌纖維化[5]，另有研究表明下調(diào)RhoA/ROCK通路可抑制糖尿病小鼠心肌組織內(nèi)M1巨噬細(xì)胞極化，誘導(dǎo)M2極化[4]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NAR下調(diào)RhoA/ROCK通路抑制M1、誘導(dǎo)M2，推測(cè)NAR通過(guò)調(diào)控RhoA/ROCK信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，這可能作為治療DCM機(jī)制之一。