跌打紅藥片中紅花主要成分的含量測定及提取條件優(yōu)化

王 睿 ，郭文全，張春禮，程江雪 ，鄒俊波 ，郭東艷 *

（1.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046；3.陜西立眾制藥有限公司，陜西 咸陽 712046）

跌打紅藥片是由三七、紅花、川芎、白芷、當歸和土鱉蟲六種藥材組成的中藥復方制劑，常用于治療跌打損傷、筋骨瘀血腫痛、風濕麻木等癥，有活血止痛、祛瘀生新之功效。此復方制劑中君藥為三七，《本草綱目》稱三七為“金不換”，具有化瘀止血、活血定痛的功效[1]；臣藥為紅花，有活血通經(jīng)、散瘀止痛之功效[2]，《本草匯言》中有載:“紅花，破血，行血，活血，調(diào)血之藥也，氣血不和之證非紅花不能調(diào)也”[3]。此外，川芎、白芷、當歸和土鱉蟲都具有良好的活血行氣止痛作用。

在本復方中，紅花與君藥三七二者相須為用，增強活血化瘀功效，現(xiàn)有研究對跌打紅藥片的質(zhì)量標準主要集中在君藥三七的主要成分三七皂苷[4]和人參皂苷[5-7]，對于臣藥紅花的研究較少。紅花中含有羥基紅花黃色素A（HSYA）[8]、山柰素、槲皮素等多種化學成分，其中HSYA 是紅花的主要藥效成分，由于紅花中山柰素的測定需要鹽酸水解，而蘆丁水解產(chǎn)物有槲皮素和異槲皮苷等，若同時測定山柰素則需要對紅花進行水解，對紅花中蘆丁及槲皮素含量有影響[9]，因此為了進一步研究和完善該制劑的質(zhì)量控制標準，本研究利用高效液相色譜法對該復方制劑中紅花的HSYA[10-11]、槲皮素和蘆丁進行了含量測定，并以三種成分為指標優(yōu)化了跌打紅藥片中紅花的提取條件，為提升跌打紅藥片的質(zhì)量標準研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

跌打紅藥片（生產(chǎn)批號：20190820、20190821、20190822，陜西立眾制藥有限公司）；跌打紅藥片陰性樣品（生產(chǎn)批號：20190820，陜西立眾制藥有限公司）；HSYA 對照品（純度＞98%，寶雞市辰光生物科技有限公司）；蘆丁對照品（批號：10080-200306，純度＞91.7%，原中國藥品生物制品檢定所）；槲皮素對照品（批號：10081-200406，純度＞97.3%，原中國藥品生物制品檢定所）；色譜甲醇（美國飛世爾科學世界公司）；磷酸（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）； SartoriusMC BT125D 型十萬分之一電子天平（北京科普爾科技發(fā)展公司）；KH-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器 （昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 （1）混合對照品溶液的制備 精密稱取HSYA 4.0 mg、蘆丁2.0 mg、槲皮素2.1 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，定容，得混合對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備 取跌打紅藥片10片，除去糖衣，研細，混勻，稱取約1 g，置于帶塞錐形瓶中，加入25%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min 后，放冷，再次稱定質(zhì)量，25%甲醇補足失重，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

（3）陰性樣品溶液的制備 按“1.2.1（2）”項下供試品溶液制備方法制備不含紅花的陰性樣品溶液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸梯度洗脫；檢測波長：373 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：32 ℃；進樣量：15 μL；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫表Tab. 1 Gradient elution table

1.2.3 線性關(guān)系考察 分別吸取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 混合對照品溶液至10 mL 容量瓶，甲醇定容至刻度，分別吸取15 μL 在色譜條件下進樣，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，μg/mL）進行線性回歸。

1.2.4 專屬性考察 分別取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液，在“1.2.2”色譜條件下進樣，得到色譜圖。

1.2.5 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液在“1.2.2”項下色譜條件下重復進樣6 次，得到三種成分的峰面積，計算RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性考察 取跌打紅藥片樣品，按照“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，精密吸取同一份供試品溶液，在0、4、8、12、16、24 h 分別進樣，得到三種成分的峰面積，計算RSD。

1.2.7 重復性考察 取同一批跌打紅藥片6 份，按照“1.2.1”項下方法，平行制備6 份供試品溶液，按照建立的色譜條件進樣分析，得到三種成分的峰面積，分別計算出三種成分的平均含量。

1.2.8 加樣回收率考察 取已知含量的樣品6 份，每份約1 g，分別按照跌打紅藥片中HSYA、蘆丁、槲皮素含量的80%、100%、120%加入對照品，按照供試品制備方法制得供試品溶液，分析并計算各自的加樣回收率及RSD。

1.2.9 單因素考察 （1）提取方法對提取效果的影響 取樣品約10 g，甲醇濃度：25%，控制料液比：1 ∶5，提取時間：40 min，分別采用超聲提取法和回流提取法進行提取，得到提取液，放冷濾過，測定HSYA、蘆丁和槲皮素的含量。

（2）超聲功率對提取效果的影響 取樣品約10 g，甲醇濃度：25%，控制料液比：1 ∶5，提取時間：40 min，采用超聲提取法，分別設(shè)置超聲功率為50、60、70、80、90、100 W 進行提取，得到提取液，放冷濾過，測定HSYA、蘆丁和槲皮素的含量。

（3）提取時間對提取效果的影響 取樣品約10 g，甲醇濃度：25%，控制料液比：1 ∶5，超聲功率：90 W，采用超聲提取法進行進行提取，分別設(shè)置提取時間為20、30、40、50、60、70 min，得到提取液，放冷濾過，測定HSYA、蘆丁和槲皮素的含量。

（4）溶劑濃度對提取效果的影響 取樣品約10 g，控制料液比：1 ∶5，提取時間：60 min，超聲功率90 W，分別設(shè)置溶劑甲醇濃度為25%、30%、50%、75%、95%，得到提取液，放冷濾過，測定HSYA、蘆丁和槲皮素的含量。

（5）料液比對提取效果的影響 取樣品約10 g，控制甲醇濃度： 75%，提取時間： 60 min，超聲功率：90 W，分別設(shè)置料液比為1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12，得到提取液，放冷濾過，測定HSYA、蘆丁和槲皮素的含量。

1.2.10 樣品含量測定 取三批跌打紅藥片各10片，除去糖衣，研細，精密稱取約1 g，在單因素考察優(yōu)化后的提取條件下進行提取，在“1.2.2”項色譜條件下進樣，計算跌打紅藥片中各成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

結(jié)果見表2，顯示各成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab. 2 Regression equation, correlation coefficient and linear range

2.2 專屬性考察

結(jié)果表明，在該色譜條件下各被測組分色譜峰分離度良好，且樣品中的其它成分對指標成分測定無干擾，方法專屬性良好。

2.3 精密度考察

精密度考察得出HSYA 的RSD 為0.41%，蘆丁的RSD 為1.35%，槲皮素的RSD 為2.13%，均小于3%，說明該方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性考察得出HSYA 的RSD 為0.04%，蘆丁的RSD 為1.09%，槲皮素的RSD 為1.49%，均小于3%，說明該方法穩(wěn)定性良好。

圖1 HPLC 色譜圖Fig. 1 Chromatogram of the sample

2.5 重復性考察

穩(wěn)定性考察分別得出三種成分的平均含量分別為2.26 mg/g、0.15 mg/g、0.77 mg/g，其RSD 分別是：HSYA 為0.15%，蘆丁為0.44%，槲皮素為1.31%，均小于3%，說明該方法重復性良好。

2.6 加樣回收率考察

加樣回收率考察分別得出HSYA 平均加樣回收率98.9%，RSD 為1.20%；蘆丁平均加樣回收率為98.0%，RSD 為1.10%；槲皮素平均加樣回收率為98.4%。RSD 為0.60%，RSD 值均小于3%，說明方法準確度良好。

2.7 單因素考察

（1）提取方法對提取效果的影響 如圖2 所示，在提取時間、料液比和溶劑濃度一定的條件下，超聲提取法的提取效果優(yōu)于回流提取。

圖2 提取方法對含量的影響Fig. 2 Effect of extraction method on content

（2）超聲功率對提取效果的影響 如圖3 所示，在提取方法、提取時間、料液比和溶劑濃度一定的條件下，超聲功率為90 W 時，提取效果最優(yōu)。

圖3 超聲功率對提取效果的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on extraction

（3）提取時間對提取效果的影響 如圖4 所示，在提取方法、料液比、超聲功率和溶劑濃度一定的條件下，提取時間為60 min 時，提取效果最優(yōu)。

圖4 提取時間對提取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction time on extraction

（4）溶劑濃度對提取效果的影響 如圖5 所示，在提取方法、料液比、提取時間、超聲功率一定的情況下，甲醇濃度為75%時，提取效果最優(yōu)。

（5）料液比對提取效果的影響 如圖 6 所示，在提取方法、提取時間、溶劑濃度和超聲功率一定的情況下，料液比為1 ∶8 時，提取效果最優(yōu)。

2.8 樣品含量測定

取三批跌打紅藥片各10 片，除去糖衣，研細，精密稱取約1 g，在最佳提取條件下進行提取，在“1.2.2”項色譜條件下進樣，計算跌打紅藥片中各成分的含量，結(jié)果見表3。

圖5 溶劑濃度對提取效果的影響Fig. 5 Effect of solvent concentration on extraction

圖6 料液比對提取效果的影響Fig. 6 Effect of material-liquid ratio on extraction

表3 3 批樣品含量測定結(jié)果Tab. 3 Determination results of 3 batches of samples

3 討論

在色譜條件優(yōu)化過程中，分別對流動相、檢測波長、柱溫和流速的選擇進行了考察[12]。在流動相選擇方面，分別考察了甲醇-乙腈-0.7%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、甲醇-0.5%磷酸、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.3%磷酸等不同流動相、不同梯度洗脫的分離效果。就洗脫能力和色譜峰峰形來說，乙腈要優(yōu)于甲醇，但由于乙腈毒性強、價格昂貴，綜合分離效果和經(jīng)濟成本，故選擇甲醇-0.5%磷酸為流動相進行洗脫[13-14]。在檢測波長的選擇方面，2020 年版《中國藥典》中記載，HSYA 在403 nm 處有最大吸收，蘆丁和槲皮素在265 nm 處有最大吸收，考察了波長265、300、360、373、403 nm，結(jié)果表明在373 nm 波長下各成分有較大吸收，故選擇373 nm 為檢測波長。在柱溫和流速選擇方面，考察了柱溫為25、30、32、35 ℃，流速為0.8、1 mL/min，得出柱溫改變會引起保留時間的改變，并不改變峰形和分離度[15-16]，綜合最佳分離效果和色譜柱壽命，選擇柱溫為32 ℃，流速為0.8 mL/min。

在提取條件優(yōu)化方面[14,17]，采用單因素法設(shè)計實驗，考察了提取方法、超聲功率、提取時間、溶劑濃度、料液比五個因素，確定了跌打紅藥片紅花中主要成分的最佳提取工藝，以75%甲醇為提取溶劑，料液比：1 ∶8，超聲功率：90 W，超聲提取60 min，優(yōu)化后的超聲提取工藝合理、穩(wěn)定、可行。在此提取條件下，測得HSYA、蘆丁和槲皮素的含量范圍分別為1.127 3 ～ 1.146 0 mg/ 片、0.231 7 ～ 0.238 7 mg/ 片 和0.368 6 ～ 0.388 1 mg/片。

4 結(jié)論

本研究初步建立了HPLC 法測定跌打紅藥片中紅花主要成分含量的方法，該方法準確、靈敏、分離度良好，適合于跌打紅藥片中各成分的定量分析，完善了跌打紅藥片的質(zhì)量控制標準，也為含有HSYA、蘆丁和槲皮素的其它制劑的檢測提供了依據(jù)。