鴨疫里氏桿菌OmpA基因真核表達載體構(gòu)建及免疫效果初步評價

余波，李婷，徐景峨，張亞楠，姜玲玲，周思旋，卜仕金

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；2. 貴州省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)感染引起的一種急性、敗血性傳染病[1]。鴨、鵝等水禽易通過呼吸道和皮膚傷口途徑感染，該細菌通過侵入血液，產(chǎn)生毒素，造成組織器官損傷。細菌的莢膜還能侵染幼齡動物的腦組織，引起神經(jīng)性癥狀。RA主要導(dǎo)致的病變特征為肝周炎、氣囊炎和纖維素性心包炎，統(tǒng)稱為“三炎”，還伴有干酪性輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等[2-3]。引起雛鴨的發(fā)病率和死亡率高，嚴重危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[4]。

RA血清型多且各血清型之間缺乏交叉保護，使得不同地區(qū)、同一地區(qū)的不同時段存在多種血清型或亞型的混合感染[5-6]。目前主要通過地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型分離株所研制的滅活疫苗來防控RA感染。由于臨床長期使用抗生素，致使RA易產(chǎn)生多重耐藥性，給該病的防治帶來很大困難[7]。鑒于處膜蛋白A(OmpA)在分離的RA菌株間具有高度保守性，不同血清型菌株OmpA蛋白之間存在交叉免疫原性，可制成一種針對多血清型的RA疫苗[8]。本研究旨在構(gòu)建OmpA真核表達質(zhì)粒，同時驗證其在DF-1細胞中的表達及其對雛鴨的免疫保護效果，為進一步開發(fā)和研制RA新型基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

陽性質(zhì)粒pUC57-OmpA由上海生工生物公司構(gòu)建；pVAX1真核表達載體由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院鮮思美老師饋贈；DF-1細胞購自豐暉生物公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA；DNA Ligation Kit、DNA Marker Ⅲ、DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ購自TaKaRa；大腸桿菌DH5α、DL2000、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技；羊抗兔IgG-FITC購自北京博奧森公司。鴨傳染性漿膜炎三價滅活疫苗(1型ZJ01株+2型HN01株+7型YC03株)購自齊魯動物保健品有限公司。HRP標記羊抗鴨IgG購自美國KPL公司。RA抗體陰性雛鴨購自貴州千里山生態(tài)食品股份有限公司種鴨場。

1.1.2 兔抗OmpA原核重組蛋白多抗血清的制備

將RAompA基因構(gòu)建入pET32a+原核表達載體，將重組表達質(zhì)粒pET32a+-RA -OmpA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21 (DE3)進行誘導(dǎo)表達，IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達后，經(jīng) 12% SDS-PAGE 分析，目標蛋白主要存在于沉淀中為包涵體，將重組蛋白尿素溶液裝入透析袋中進行復(fù)性，Ni+柱親和純化重組蛋白，將純化好的重組蛋白與弗氏完全佐劑混合，免疫3只新西蘭白兔(2～2.5 kg)，皮下免疫0.5 mg/次，以后每間隔14 d加強免疫1次，加強免疫使用弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白。通過間接ELISA方法檢測抗血清對PA OPMA重組蛋白的效價，結(jié)果3免后，效價為1∶12 800，采血分離血清制備成多抗血清。

1.2 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中ompA基因序列，結(jié)合pVAX1真核表達載體多克隆位點，利用Primer premier 5.0設(shè)計ompA基因的特異性引物。選用XhoⅠ和BamHⅠ作為酶切位點，引物由上海生工生物公司合成，上游引物：5′-GGATCCATGTTGATGACTGGACTTGGT-3′，下劃線為XhoⅠ酶識別位點；下游引物：5′-CTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTACT-3′，下劃線為BamHⅠ酶識別位點。

1.3 ompA基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將陽性質(zhì)粒pUC57-OmpA及載體質(zhì)粒pVAX-1分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素抗性LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，從轉(zhuǎn)化的卡那霉素 LB平板上挑選單個白色菌落，接種至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。采用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，同時以提取重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，將質(zhì)粒送往上海生工生物有限公司進行序列測定。

1.4 ompA基因真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細胞

1.4.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取

使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，抽提經(jīng)鑒定正確的真核表達質(zhì)粒pVAX1-OmpA和空載體質(zhì)粒pVAX1測定濃度及純度，選擇OD260與OD280比值為1.8～2.0對應(yīng)的質(zhì)粒。

1.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細胞

將DF-1細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液培養(yǎng)細胞長至80%～100%單層時，棄掉上清，PBS緩沖液清洗2～3次，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA和空質(zhì)粒pVAX1分別轉(zhuǎn)染DF-1細胞，空白組不作任何處理。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后更換新的含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.5 RT-PCR方法檢測ompA基因在DF-1細胞中的轉(zhuǎn)錄

采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，參照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，進行cDNA合成。以cDNA為模板，進行PCR 擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，取2×PCR MiX 12.5 μL，模板2 μL，上、下游引物(10 mol/μL)各1 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物于含核酸染料(Gold View)的1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.6 間接免疫熒光(IFA)檢測ompA基因表達

收集轉(zhuǎn)染后48 h的DF-1細胞，用預(yù)冷PBS洗3遍；加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，棄去固定液，用預(yù)冷PBS洗3遍；加入0.3% TritonX-100室溫透化20 min，棄去TritonX-100，用預(yù)冷PBS洗3遍；加入一抗(兔抗ompA原核表達蛋白血清)，37 ℃孵育1 h，棄去一抗，用預(yù)冷PBS洗3遍；加入二抗(FITC標記的羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，用預(yù)冷PBS洗3遍；加入細胞核染料DAPI，室溫作用4 min，用預(yù)冷PBS洗3遍；于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 Western blot檢測重組蛋白的表達

收集轉(zhuǎn)染后48 h的DF-1細胞進行裂解，12% SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以兔抗OmpA原核表達蛋白血清(1∶500)為一抗，羊抗兔 HRP-IgG(1∶2 000)為二抗，采用ECL顯色。

1.8 pVAX1-OmpA DNA疫苗的免疫保護試驗

采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA和pVAX1空質(zhì)粒，并測定核酸濃度。將1日齡RA抗體陰性健康雛鴨120只飼養(yǎng)至10日齡以適應(yīng)環(huán)境，將其隨機分成4組，30只/組，分別為100 μg/只pVAX1-OmpA質(zhì)粒免疫組、100 μg/只pVAX1質(zhì)?？瞻讓φ战M、0.2 mL滅活疫苗對照組、0.2 mL生理鹽水對照組。采用頸部皮下免疫接種，免疫7 d后對雛鴨進行二次免疫。首免疫后7、14、21、28、49、63 d，隨機抽取各組10只雛鴨，采血分離血清。

采用間接ELISA檢測雛鴨RA抗體，ELISA板每孔包被5 μg OmpA原核表達蛋白，雛鴨血清1∶100稀釋，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加入HRP標記羊抗鴨IgG(1∶2 000)，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3次，TMB室溫顯色15 min，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，測定OD450值。

攻毒保護試驗，對二免后14 d的試驗鴨，每組隨機抽出10只，采用菌液濃度為4×107CFU/mL(2倍LD50劑量) 1型RA菌懸液菌珠編號為GZSH001，來源于貴州三穗縣鴨場，使用RA分型血清鑒定為RA1型、通過腿部肌肉注射接種測定攻毒保護率，觀察記錄攻毒后1周內(nèi)的發(fā)病或死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 ompA基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

通過質(zhì)粒PCR(圖1)、雙酶切(圖2)及測序鑒定，結(jié)果表明ompA基因與pVAX1載體連接正確，ompA基因片段大小約為1 149 bp，將雙酶切與測序結(jié)果鑒定為陽性的重組真核表達質(zhì)粒，命名為pVAX1-ompA。

M. DL2000；1～2. pVAX1-OmpA；3. 陰性對照

M. DL5000；1. pVAX1-OmpA；2. pVAX1-OmpA雙酶切

2.2 RT-PCR檢測真核表達質(zhì)粒瞬時表達結(jié)果

真核表達質(zhì)粒pVAX1-OmpA和pVAX1轉(zhuǎn)染DF-1細胞48 h后，提取細胞總RNA，通過RT-PCR方法檢測到目的基因表達，見圖3。

M. DNA Marker D2000;1. pVAX1-OmpA;2. pVAX1，3. 正常細胞對照

2.3 IFA檢測真核表達質(zhì)粒瞬時表達

IFA檢測結(jié)果顯示，真核表達質(zhì)粒pVAX1-OmpA轉(zhuǎn)染DF-1細胞48 h后，胞漿可見綠色熒光(圖4A)；pVAX1轉(zhuǎn)染組未見綠色熒光，顯示觀察視野為黑色(圖4B)。

圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細胞后IFA檢測結(jié)果

2.4 Western blot檢測重組蛋白的表達

重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA轉(zhuǎn)染DF-1細胞后48 h，收集細胞裂解后進行Western blot，結(jié)果顯示細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒在41 kDa左右出現(xiàn)條帶，與預(yù)測結(jié)果大小一致，而空載體未出現(xiàn)該條帶，見圖5。

M. 蛋白Marker；1. pVAX1-OmpA轉(zhuǎn)染DF-1細胞；2. pVAX1空載體轉(zhuǎn)染DF-1細胞

2.5 pVAX1-OmpA DNA疫苗對雛鴨感染RA的保護試驗

以100 μg/只重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA采用頸部皮下免疫接種，免疫7 d后對雛鴨進行二次免疫，用間接ELISA法檢測免疫后RA抗體水平。結(jié)果，重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA試驗組于7 d、21 d極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)低于滅活疫苗對照組，而14、28、35、49、63 d差異不顯著，見圖6。

攻毒后7 d內(nèi)的發(fā)病或死亡情況結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA試驗組21 d保護率達100%，滅活疫苗對照組21 d保護率達90%，pVAX1空載體對照和生理鹽水對照組21 d保護率均為10%，見圖7。

圖6 不同免疫組抗體動態(tài)變化

圖7 雛鴨21 d攻毒保護試驗結(jié)果

3 討論

目前國內(nèi)外學(xué)者均致力于研究出一種對各血清型RA均有保護作用的新型有效疫苗，其中DNA疫苗是較為理想的發(fā)展方向。DNA疫苗不僅可同時誘導(dǎo)體液與細胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生持久性免疫應(yīng)答，還能交叉保護不同血清型，具有易生產(chǎn)，穩(wěn)定性強，貯存、運輸方便等優(yōu)點[9]。DNA疫苗研制的關(guān)鍵在于靶基因序列與表達載體的選擇，選擇一種或幾種具有交叉保護性的抗原成分能提供更全面的保護[10]。OmpA作為RA的主要外膜蛋白，其基因序列高度保守，具有良好的免疫原性，不僅能激發(fā)特異性體液免疫和細胞毒性反應(yīng)，輔助其他抗原交叉提呈，提高機體的免疫應(yīng)答水平，且能對不同血清型RA起到免疫交叉保護的作用，是RA核酸疫苗研制的首選靶基因[11]。雷云[12]成功構(gòu)建了ompA基因真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-OmpA，免疫雛鴨后證實該真核表達質(zhì)粒能刺激鴨體內(nèi)產(chǎn)生RA特異性抗體，對血清1型和2型RA均有一定的免疫保護作用。

真核表達質(zhì)粒誘發(fā)機體產(chǎn)生的免疫效果與質(zhì)粒載體表達抗原蛋白的能力呈正相關(guān)，因此構(gòu)建DNA疫苗還應(yīng)選擇高效的質(zhì)粒表達載體[13]。pVAX1作為哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中高效表達目的基因的表達載體，大小為3.0 kb，是基于pcDNA3.1上重建得到的新型真核表達載體，用卡那抗性代替安芐抗性篩選基因，能有效降低人類基因組重組的可能，且pVAX1載體為非融合載體，其產(chǎn)生的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然存在的蛋白質(zhì)幾乎相同[14]。由于具有BGH poly A信號和強大的人巨細胞病毒啟動子(CMV)，表達容量大，分子量小等優(yōu)點，pVAX1作為真核表達載體已用于構(gòu)建多種傳染病或寄生蟲病的重組核酸疫苗[15]。龔麗貞等[16]構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-Cal-SAG1和pVAX1-SAG1，免疫小鼠后，通過ELISA、CCK-8法和小鼠攻蟲試驗證明該DNA疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠機體產(chǎn)生體液和細胞免疫。張真等[17]構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6，經(jīng)體外轉(zhuǎn)染驗證其表達后，免疫小鼠證實均可激發(fā)較強的免疫反應(yīng)。

本研究選擇pVAX1作為真核表達載體，成功構(gòu)建了ompA基因的真核表達質(zhì)粒pVAX1-OmpA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至DF-1細胞，采用RT-PCR、IFA、Western blot試驗證實了真核表達質(zhì)粒pVAX1-OmpA能在DF-1細胞中瞬時表達。同時IFA試驗中pVAX1-OmpA真核表達蛋白能夠被OmpA基因原核表達蛋白免疫兔得到的多抗所識別，結(jié)合羊抗兔IgG-FITC，在細胞胞漿顯示出綠色熒光，Western blot結(jié)果也顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后在41 kDa左右出現(xiàn)條帶，表明該真核表達蛋白成功表達。對雛鴨感染RA的保護試驗中，重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA組誘導(dǎo)體液免疫水平在28 d后與滅活疫苗組相當，而攻毒試驗結(jié)果表明重組質(zhì)粒pVAX1-OmpA組免疫21 d后可為雛鴨提供高于滅活疫苗組的免疫保護效果，這可能與該DNA疫苗同時產(chǎn)生細胞免疫有關(guān)。在后續(xù)研究中，需要測定細胞免疫水平，以研究其體液免疫和細胞免疫與RA攻毒保護率的相關(guān)性，以及探討聯(lián)合應(yīng)用免疫增強劑以提高其體液免疫水平，以期能更好地對候選重組DNA疫苗進行全面的免疫效果評價。