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    TLN-58和hLYZ基因融合表達載體的構(gòu)建及其細胞毒性研究

    2021-03-10 08:29:12王小月李丹藍肇煜武靜橋范真瑋姚景麗何敬文趙微陳婷金天明
    畜牧與獸醫(yī) 2021年3期
    關(guān)鍵詞:真核細胞周期孵育

    王小月,李丹,藍肇煜,武靜橋,范真瑋,姚景麗,何敬文,趙微,陳婷,金天明

    (天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384)

    抗菌肽(antimicrobial peptides)是一類具有免疫功能的小分子多肽,由10~60個氨基酸殘基構(gòu)成,廣泛存在于各種生物體內(nèi)[1]。由于抗菌肽易被蛋白酶分解,在生物體內(nèi)不易形成殘留,因此,不易形成耐藥性,現(xiàn)已成為抗生素替代領(lǐng)域的研究大熱點。TLN-58是2016年被發(fā)現(xiàn)于人掌跖膿皰病中的一種抗菌肽[2],含有58個氨基酸,帶有7個靜正電荷,疏水性為34%,對人紅細胞無溶血活性,對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和鏈球菌均具有抑菌活性[3]。人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ)又名N-乙?;谒崴饷?,是人體免疫防御的組成部分,其通過水解細菌細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4糖苷鍵而起到裂解細菌的作用[4]。hLYZ抗菌作用廣,因獨特的作用機理使得其不會產(chǎn)生抗藥性、耐藥性、藥物蓄積、藥物殘留及其他副作用。hLYZ對致病菌(包括革蘭陽性和陰性菌)都具有明顯的抑菌作用,還可增強機體的免疫力[5]。鑒于上述特性,本試驗對TLN-58和hLYZ融合基因的細胞毒性進行檢測,為后續(xù)利用hLYZ和TLN-58融合基因替代常規(guī)抗生素時的安全性提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試驗材料

    pMD-TLN-58(KanR)、pMD-hLYZ(KanR)、pEGFP-N1 Vector(KanR)、大腸桿菌XL-10Gold感受態(tài)細胞購自上海捷瑞生物工程有限公司;HEK293細胞由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

    1.2 重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建

    根據(jù)The Antimicrobial Peptide Database中的TLN-58基因序列(APD ID:AP02750)和GeneBank中hLYZ基因標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_000012.10)結(jié)合真核表達載體pEGFP-N1分別設(shè)計特異性引物(見表1),引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

    表1 擴增目的片段的引物

    利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分別對質(zhì)粒pMD-TLN-58、pMD-hLYZ和真核表達載體pEGFP-N1進行消化。通過薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對消化產(chǎn)物進行回收和純化,采用SanPrep柱式膠回試劑盒回收酶切產(chǎn)物。利用T4 DNA連接酶,將雙酶切后膠回收獲得的hLYZ和TLN-58基因分別與真核表達載體pEGFP-N1于16 ℃連接過夜,采用融合表達的方式構(gòu)建雙基因重組質(zhì)粒。將制備成功的重組真核質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL-10Gold,再經(jīng)PCR鑒定和測序分析篩選出陽性菌。

    1.3 重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件的摸索

    根據(jù)文獻設(shè)定重組真核質(zhì)粒pEGFP-N1-TLN-58、pEGFP-N1-hLYZ和pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58的DNA用量分別為0.5、1、1.5和2 μg,GeneTwinTW轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的比例設(shè)定為1∶3。將GeneTwinTW稀釋液滴加到DNA稀釋液中,獲得轉(zhuǎn)染復(fù)合物,然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到24孔板各孔中央,置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。分別在8,12,24及48 h,用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄,計算轉(zhuǎn)染后細胞存活率,確定質(zhì)粒DNA的最佳用量,GeneTwinTW轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的比例及轉(zhuǎn)染時間,試驗重復(fù)3次。

    1.4 RT-PCR檢測目的基因表達情況

    采用TRIzol法從轉(zhuǎn)染24 h后的HEK293細胞中提取細胞總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA模板后,以表1中的引物,PCR檢測目的基因,對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行鑒定。

    1.5 DAPI染色和AO/EB染色檢測細胞凋亡

    首先選擇DAPI作為染色劑,將轉(zhuǎn)染成功的HEK293細胞,棄上清液,加少量DAPI覆蓋樣品,室溫染色5~10 min;吸出DAPI染色液,用PBS洗滌2~3次;置熒光顯微鏡下觀察,激發(fā)波長360~400 nm,試驗重復(fù)3次。然后進行AO/EB染色,當(dāng)轉(zhuǎn)染成功的HEK293細胞匯合度達到80%~90%且生長狀態(tài)良好時,離心后調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL,取90 μL細胞懸液,加入5 μL AO染色液和5 μL EB染色液(AO∶EB=1∶1),室溫避光孵育1~5 min,充分作用后置于熒光顯微鏡下觀察,試驗重復(fù)3次。

    1.6 CCK-8法檢測重組真核表達產(chǎn)物的細胞毒性

    為了確定重組真核質(zhì)粒對HEK293細胞的的細胞毒性,通過CCK-8試驗檢測重組質(zhì)粒對細胞活力的影響。將對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的HEK293細胞調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL,充分混勻后,96孔板中每孔加100 μL,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。重組真核質(zhì)粒的DNA用量分別為0.5、1、1.5和2 μg,GeneTwinTW轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的比例為1∶3混勻,終體積為100 μL,每組均設(shè)5個復(fù)孔,同時設(shè)置PBS加細胞、培養(yǎng)基加細胞和只加培養(yǎng)基3組對照。孵育一定時間(24,48,72及96 h),到達檢測時間點時,棄去培養(yǎng)液,每孔加入100 μL稀釋后的CCK-8溶液;37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育0.5,1,2及4 h,使用酶標(biāo)儀檢測OD450值,試驗重復(fù)3次。

    按下列公式計算細胞活力:細胞活力(%)=(AC-A0)/(AS-A0)×100% 。

    AC(試驗組):轉(zhuǎn)染后細胞的吸光度;A0(空白組):不含細胞的吸光度;AS(對照組):有細胞,但細胞沒被轉(zhuǎn)染的吸光度。

    1.7 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對細胞周期的影響

    在6孔細胞培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染成功的HEK293細胞匯合度達到80%~90%且生長狀態(tài)良好時,進行細胞周期檢測。根據(jù)細胞周期檢測試劑盒KGA511-KGA512說明書處理細胞:用PBS洗滌2次,離心棄去上清后,收集并調(diào)整細胞濃度為1×106/mL,取1 mL單細胞懸液離心,去除上清液,在細胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μL固定(2 h至過夜),4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液,將Rnase A∶PI工作液按1∶9體積配制成染色工作液,在每管中各加500 μL染色工作液,室溫避光30~60 min,用流式細胞儀檢測,記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光,每組設(shè)3個重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建

    利用特異性引物,以pMD-TLN-58和pMD-hLYZ質(zhì)粒為模板,經(jīng)過雙酶切和產(chǎn)物膠回收轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞XL-10Gold,獲得重組真核質(zhì)粒,菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,分別擴增到638 bp的hLYZ和TLN-58融合基因片段、464 bp的hLYZ基因片段和197 bp的TLN-58基因片段,目的條帶與預(yù)期相符,結(jié)果見圖1。將測序結(jié)果與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)序列進行BLAST分析比對,結(jié)果表明,TLN-58基因和hLYZ基因序列與已發(fā)表的基因序列的同源性為100%,且無堿基缺失、增添和突變。陽性重組真核質(zhì)粒分別命名為pEGFP-N1-TLN-58、pEGFP-N1-hLYZ和pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58。

    M.DL2500 Marker;1.hLYZ-TLN-58 基因;2. hLYZ 基因;3. TLN-58 基因

    2.2 重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞的條件優(yōu)化

    在熒光倒置顯微鏡的藍色激發(fā)光下,觀察24孔細胞培養(yǎng)板中經(jīng)重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后的HEK293細胞綠色熒光蛋白表達量和細胞狀態(tài)。當(dāng)質(zhì)粒DNA用量為1 μg和GeneTwinTW轉(zhuǎn)染試劑用量為3 μL時,轉(zhuǎn)染24 h為最佳轉(zhuǎn)染條件,此時的綠色熒光蛋白表達量最高且細胞狀態(tài)較好,見圖2。

    2.3 RT-PCR檢測目的基因表達情況

    分別利用表1中的引物,PCR檢測各重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后的HEK293細胞中hLYZ-TLN-58融合基因、hLYZ基因和TLN-58基因轉(zhuǎn)錄情況,結(jié)果顯示分別在638、464和197 bp處獲得目的基因條帶(見圖3)。表明重組質(zhì)粒攜帶目的基因,并可在HEK293細胞中正確轉(zhuǎn)錄表達。

    2.4 重組質(zhì)粒對細胞凋亡的影響

    將重組真核質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞,24 h后將轉(zhuǎn)染后的細胞經(jīng)DAPI染色,顯微鏡下觀察,細胞核變化情況較對照組區(qū)別不大,未呈致密濃染,未見明顯細胞凋亡。用重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞24 h后,經(jīng)AO/EB染色結(jié)果顯示,對照組的細胞多呈綠色熒光,未見細胞病變(CPE),在pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58組中觀察到凋亡細胞現(xiàn)象較少,結(jié)果見圖4。

    圖2 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染HEK293細胞

    M.DL2500 Marker;1.hLYZ-TLN-58 基因;2. hLYZ 基因;3. TLN-58 基因

    圖4 DAPI染色和AO/EB染色檢測細胞凋亡

    2.5 重組真核表達產(chǎn)物對細胞毒性作用的檢測

    重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞24 h后細胞活力隨著質(zhì)粒用量的增加而降低,當(dāng)質(zhì)粒用量為1 μg時細胞活力最大,加CCK-8后孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的光吸收值較穩(wěn)定。利用CCK-8測定分析重組質(zhì)粒的細胞毒性,當(dāng)pEGFP-N1質(zhì)粒用量為4 μg時,轉(zhuǎn)染96 h加CCK-8后孵育4 h其細胞活力最小為62.48%;當(dāng)pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58質(zhì)粒用量為2 μg時,轉(zhuǎn)染96 h加CCK-8后孵育2 h其細胞活力最小為61.01%;當(dāng)pEGFP-N1-hLYZ質(zhì)粒用量為4 μg時,轉(zhuǎn)染96 h加CCK-8后孵育4 h其細胞活力最小為65.47%;當(dāng)pEGFP-N1-TLN-58質(zhì)粒用量為4 μg時,轉(zhuǎn)染96 h加CCK-8后孵育4 h其細胞活力最小為66.62%。重組真核質(zhì)粒的細胞活力較好,說明重組真核質(zhì)粒的細胞毒性較小,為安全低毒,重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建是完全有意義的。結(jié)果見圖5-圖8。

    A. 孵育0.5 h;B. 孵育1 h;C. 孵育2 h;D. 孵育4 h

    A. 孵育0.5 h;B. 孵育1 h;C. 孵育2 h;D. 孵育4 h

    A. 孵育0.5 h;B. 孵育1 h;C. 孵育2 h;D. 孵育4 h

    A. 孵育0.5 h;B. 孵育1 h;C. 孵育2 h;D. 孵育4 h

    2.6 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對細胞周期的影響

    流式細胞儀檢測細胞周期,結(jié)果顯示,試驗組pEGFP-N1-TLN-58轉(zhuǎn)染的細胞與對照組未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞相比G1%、G2%比例升高,S%比例降低,但升高和降低均不顯著(見圖9)。經(jīng)重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的試驗組細胞與對照組的細胞相比G1%、G2%和S%無顯著區(qū)別。說明經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對細胞周期無顯著影響。

    圖9 流式細胞儀檢測細胞周期

    3 討論

    隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,抗生素的頻繁使用,導(dǎo)致越來越多的病原微生物對傳統(tǒng)抗生素不僅出現(xiàn)了耐藥性,還有很強的毒副作用。這一情況使得人類對新型抗菌藥物的探究變得非常迫切,利用基因工程技術(shù)在生物、食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域開展相關(guān)研究變得越來越廣泛[6]。研究表明抗菌肽是生物體內(nèi)天然防御系統(tǒng)的一個重要組成部分,抗菌肽TLN-58抗菌譜廣,對革蘭陽性菌和陰性菌均有抑制作用[7]。hLYZ具有廣譜抗菌性,對奶牛乳房炎的主要致病菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等都具有明顯的抑制作用[8]。TLN-58和hLYZ聯(lián)用可增加抑菌效果和抑菌譜。天然的TLN-58和hLYZ抗菌肽分布廣但獲取困難,因其分子量大,難以形成正確的空間構(gòu)象,無法實現(xiàn)人工直接合成,需要采用基因表達的方式純化出蛋白。通過本研究可實現(xiàn)TLN-58和hLYZ融合表達,無細胞毒性,為后續(xù)純化蛋白奠定基礎(chǔ)。

    一般情況下,通過篩選、優(yōu)化影響轉(zhuǎn)染效率最大的因素,即轉(zhuǎn)染試劑GeneTwinTW和DNA質(zhì)粒的用量以及轉(zhuǎn)染時間,進而確定轉(zhuǎn)染試劑和DNA質(zhì)粒的最佳用量[9]。本研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染試劑GeneTwinTW和DNA質(zhì)粒的用量及轉(zhuǎn)染時間都影響著細胞的轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)質(zhì)粒DNA用量為1 μg、GeneTwinTW轉(zhuǎn)染試劑用量為3 μL時,即GeneTwinTW轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA用量比例為1∶3,轉(zhuǎn)染時間為24 h時,能得到最佳的轉(zhuǎn)染條件,且該轉(zhuǎn)染條件不會影響綠色熒光蛋白的正常表達。本研究構(gòu)建的重組真核質(zhì)粒均在HEK293細胞中獲得轉(zhuǎn)錄,篩選出最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件可以提高目的基因的表達效率。

    通過DAPI染色、AO/EB染色和CCK-8法檢測細胞凋亡,測定經(jīng)過不同質(zhì)粒DNA用量轉(zhuǎn)染HEK293細胞的相對增殖率,可用于分析重組質(zhì)粒的細胞毒性[10]。本研究獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)試驗證實細胞毒性相對較小。利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期,結(jié)果顯示,在G1、G2及S期各處理組無顯著差異,證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒對HEK293細胞周期無顯著影響。

    綜上,本研究首次將TLN-58和hLYZ融合表達,構(gòu)建出能夠高效穩(wěn)定融合表達外源基因的真核表達載體pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58,通過對重組真核表達質(zhì)粒細胞毒性的驗證,為后續(xù)該融合蛋白抑菌活性研究奠定基礎(chǔ)。

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