黃芪多糖通過激活脂聯(lián)素信號(hào)通路減輕小鼠潰瘍性結(jié)腸炎*

宋 艷， 何永恒， 楊 芳， 羅 敏， 劉 楊

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，湖南長沙410005）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥疾病，主要的發(fā)病部位為直腸和結(jié)腸，嚴(yán)重時(shí)會(huì)蔓延到整個(gè)結(jié)腸［1］。典型的臨床特征包括腹痛、腹瀉、黏液膿血便以及體重減輕，常反復(fù)發(fā)作，并伴隨一系列的并發(fā)癥，長期發(fā)展可能會(huì)引發(fā)癌變［2-3］。近年來，我國UC 的患病率逐漸增加，患病人群越來越趨于年輕化。目前，UC的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，普遍認(rèn)為由遺傳易感性、生活習(xí)慣、免疫反應(yīng)和腸道微生物失衡多種因素相互作用所致［4］。

黃芪多糖（Astragaluspolysaccharide，APS）為黃芪中重要的生物活性多糖，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、修復(fù)神經(jīng)損傷和免疫調(diào)節(jié)等功效［5-6］。已有研究表明，黃芪多糖對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠黏膜組織具有修復(fù)作用［7］，但對于其作用機(jī)制的研究仍相對較少，本研究通過構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，觀察黃芪多糖對潰瘍性結(jié)腸炎的干預(yù)作用及機(jī)制，為黃芪多糖治療潰瘍性結(jié)腸炎提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只健康SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，6～8 周齡，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。所有小鼠均飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、濕度為45%、12 h 光照與黑暗交替的飼養(yǎng)箱內(nèi)，期間自由進(jìn)食與飲水。

2 主要試劑

黃芪多糖（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sodium sulfate，DSS）購自MP Biomedicals；脂聯(lián)素（adiponectin，APN）和血紅蛋白（hemoglobin，Hb）檢測試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司）；HE染色試劑（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司），免疫組化染色試劑（上海古朵生物科技有限公司）；Trizol 試劑盒和SYBR Green qPCR Mas?ter Mix 試劑盒（TaKaRa），M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工生物有限公司）；RIPA 裂解緩沖液、BCA 蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；脂聯(lián)素受體2（adipo?nectin receptor 2，AdipoR2）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptorα，PPAR-α）和AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）抗體（北京中杉金橋生物有限公司）；GAPDH 抗體和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abcam）。

3 方法

3.1 小鼠分組、建模及給藥 將40 只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5 組：空白對照（blank control）組、模型（model）組、黃芪多糖低劑量（low-dose APS，low-APS）組、黃芪多糖中劑量（middle-dose APS，middle-APS）組和黃芪多糖高劑量（high-dose APS，high-APS）組，每組8 只。將所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)，空白對照組小鼠飲用蒸餾水，其余各組均自由飲用5% DSS 溶液10 d 誘導(dǎo)制成潰瘍性結(jié)腸炎模型［8］，每隔1 d 更換新鮮的DSS 溶液。于造模30 min 后，黃芪多糖各個(gè)劑量組分別按照100、200、400 mg/kg 劑量灌胃［9］，空白對照組與模型組分別予以相應(yīng)體積的蒸餾水灌胃，每日一次，連續(xù)給藥10 d。實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察記錄各組小鼠體重、糞便性狀及便血情況，進(jìn)行小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity in?dex，DAI）評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為：體質(zhì)量下降百分比（無下降或＜1%為0 分，1%～5%為1 分，6%～10%為2分，11%～15%為3 分，＞15%為4 分）、糞便性質(zhì)（正常為0 分，糞便松散為2 分，腹瀉或水樣便為4 分）和大便出血情況（無便血為0 分，輕度出血/隱血為2分，血便為4分）。

3.2 血清APN 和血液Hb 水平測定 末次給藥后，各組小鼠禁食12 h，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，取適量于室溫下靜置20 min，并在4℃下以4 500×g 離心15 min，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中APN水平和血液中Hb水平，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.3 小鼠結(jié)腸長度測定 采血后處死小鼠，小鼠置于冰上解剖，將整個(gè)結(jié)腸自盲腸到肛門段取出，預(yù)冷的PBS 溶液沖洗結(jié)腸，無張力狀態(tài)下拉展平鋪，測量各組小鼠結(jié)腸長度，將一部分結(jié)腸組織使用體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛固定，另一部分快速冷凍后保存于-80℃冰箱。

3.4 HE 染色 將固定的結(jié)腸組織浸于梯度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm 的石蠟組織切片，蘇木精染色5 min，伊紅染色液染色3 min，無水乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

3.5 免疫組化染色 將制備的小鼠結(jié)腸石蠟切片脫蠟至水，采用檸檬酸鹽水浴煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10%羊血清室溫封閉30 min，滴加TNF-α 抗體（1∶400），在4℃下孵育24 h，PBS沖洗后，滴加Ⅱ抗室溫孵育30 min，PBS再次沖洗，滴加DAB 顯色10 min，經(jīng)蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，中性樹膠封片，在電子顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集，棕色至棕褐色著色為陽性表達(dá)。

3.6 Western blot 將結(jié)腸組織剪碎并加入RIPA 裂解緩沖液進(jìn)行裂解，提取組織總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測定，電泳。10% SDS-PAGE 分離蛋白，切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗（AdipoR2、PPAR-α 和AMPK 抗體以1∶1 000稀釋，內(nèi)參照GAPDH 抗體以1∶5 000稀釋），在4℃下孵育24 h。TBST 漂洗PVDF 膜，加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗常溫孵育1 h，TBST 洗膜后，滴ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白條帶灰度值。

3.7 RT-qPCR 根據(jù)Trizol 試劑盒抽提小鼠結(jié)腸組織總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA 的濃度及純度，用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因片段來檢測表達(dá)水平，具體操作參考SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說明書，以β-actin 為內(nèi)參照。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5 min（1 個(gè)循環(huán)）；95℃30 s，55℃15 s，72℃30 s（40個(gè)循環(huán)）。引物由上海生工生物有限公司合成，序列如下：AdipoR2 的上游引物序列為5'-TGGGGATCT?TATATGTTCGT-3'，下游引物序列為5'-CATTG?CAAGGTATGTGGGTA-3'；PPAR-α 的上游引物序列為5'-CGAGCTTCAGGACAATGCTGGTG-3'，下 游 引物序列為5'-AGCAGGTTGGTCAGCCACT-3'；β-actin的上游引物序列為5'-CTTCGCCGCTCCAGCACGC?TAC-3'，下游引物序列為5'-GCCGATCCACACG?GAGTAC-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA 相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠DAI評分比較

造模后，空白對照組小鼠未出現(xiàn)體重下降、腹瀉、血便的情況；模型組部分小鼠于第2 天出現(xiàn)大便隱血陽性，在第3 天開始出現(xiàn)腹瀉、血便，體重下降逐漸明顯，DAI評分顯著高于空白對照組（P＜0.05）；黃芪多糖給藥組小鼠體重下降、腹瀉、便血情況較模型組程度減輕，DAI評分顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性，見表1。

表1 各組小鼠DAI評分比較Table 1. Comparison of DAI scores of mice in each group（Mean±SD. n=8）

2 各組小鼠APN與Hb水平的比較

與空白對照組比較，模型組小鼠血清APN 與血液Hb水平均顯著降低（P＜0.05）；經(jīng)不同劑量黃芪多糖給藥的小鼠，血清APN 與血液Hb水平均顯著升高（P＜0.05），呈劑量依賴性，見表2。

表2 各組小鼠血清APN和血液Hb水平的比較Table 2. Comparison of serum APN and blood Hb levels in the mice of each group（Mean±SD. n=8）

3 各組小鼠結(jié)腸長度變化

與空白對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪多糖各給藥組小鼠結(jié)腸長度顯著變長（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1. Measurement of colon length of mice in each group.Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs blank control group；#P＜0.05 vs model group.圖1 各組小鼠結(jié)腸長度的測定

4 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化

空白對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮組織完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，無病變現(xiàn)象；模型組小鼠結(jié)腸組織黏膜受損，腺體結(jié)構(gòu)不完整，且肌層明顯增厚，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤；而經(jīng)過各劑量黃芪多糖干預(yù)的小鼠結(jié)腸組織黏膜損傷程度較模型組明顯減輕，少見炎癥細(xì)胞浸潤，見圖2。

5 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α表達(dá)檢測

空白對照組小鼠結(jié)腸組織胞漿內(nèi)棕黃色顆粒較少，TNF-α 陽性表達(dá)率為（4.68±0.37）%；模型組小鼠結(jié)腸組織胞漿內(nèi)有大量棕黃色顆粒，TNF-α 陽性表達(dá)率為（46.71±3.37）%，較空白對照組顯著升高（P＜0.05）；黃芪多糖組小鼠結(jié)腸組織胞漿內(nèi)棕黃色顆粒均較模型組減少，低、中和高劑量組TNF-α 陽性表達(dá)率分別為（24.06±1.94）%、（15.36±1.05）%和（9.55±0.87）%，與模型組相比均顯著下降（P＜0.05），見圖3。

6 各組小鼠結(jié)腸組織AdipoR2 和PPAR-α mRNA表達(dá)的比較

與空白對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中AdipoR2 和PPAR-α 的mRNA 相對表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）；經(jīng)過各劑量黃芪多糖作用的小鼠，結(jié)腸組織中AdipoR2 和PPAR-α 的mRNA 相對表達(dá)量均較模型組顯著升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖4。

7 各組小鼠結(jié)腸組織AdipoR2、PPAR-α 和AMPK蛋白表達(dá)的比較

與空白對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中AdipoR2、PPAR-α 和AMPK 的蛋白相對表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，經(jīng)不同劑量黃芪多糖給藥的小鼠結(jié)腸組織中AdipoR2、PPAR-α 及AMPK 的蛋白相對表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖5。

Figure 2. HE staining was applied to detect pathological changes in mouse colon tissue. Blank contol group：the structure of mouse co?lon was complete and clear；model group：damaged mouse colonic mucosa；low-APS group：the damage of mouse colon tissue was slightly attenuated；middle-APS group：the damage of mouse colon tissue was significantly attenuated；high-APS group：the damage of mouse colon tissue was obviously attenuated，and the structure was relatively complete. Scale bar=20 μm.圖2 HE染色檢測小鼠結(jié)腸組織病理變化

Figure 3. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of TNF-α in mouse colon tissue. Blank control group：less brown-yellow particles in the cytoplasm；model group：a large number of brown-yellow particles in the cytoplasm；low-APS group：the brown-yellow particles in the cytoplasm were slightly reduced；middle-APS group：the brown-yellow particles in the cytoplasm were significantly reduced；high-APS group：very few brown particles in the cytoplasm. Scale bar=20 μm.圖3 免疫組化染色檢測小鼠結(jié)腸組織TNF-α的表達(dá)

Figure 4. RT-qPCR detection of AdipoR2 and PPAR-α mRNA expression levels in mouse colon tissue. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs blank control group；#P＜0.05 vs model group.圖4 RT-qPCR檢測小鼠結(jié)腸組織AdipoR2和PPAR-α的mRNA表達(dá)水平

討 論

UC 作為一種慢性炎癥疾病，在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年上升，且相關(guān)并發(fā)癥逐漸增多［4］。盡管目前治療UC 的方法較多，如氨基水楊酸制劑、皮質(zhì)類固醇、硫代嘌呤、免疫抑制劑或者結(jié)腸切除術(shù)等，但這些治療方法多伴隨著嚴(yán)重的副作用［10］。因此，探索UC 過程中炎癥反應(yīng)和發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療策略，研發(fā)療效更好、副作用更少的藥物或療法十分必要。

黃芪多糖具有廣泛的生物學(xué)活性，已有研究表明，黃芪多糖可通過細(xì)胞周期停滯和線粒體凋亡途徑對胃癌MGC-803 細(xì)胞表現(xiàn)出誘導(dǎo)凋亡的作用［11］，還能夠通過下調(diào)CD40 的表達(dá)表現(xiàn)出抗黑素瘤的潛能［12］。此外，黃芪多糖對小鼠UC 有顯著的治療效果，為進(jìn)一步明確黃芪多糖在治療UC 中的作用，本研究通過DSS 誘導(dǎo)來建立UC 小鼠模型，給予黃芪多糖干預(yù)后評估其效果。本研究結(jié)果顯示，黃芪多糖可改善UC 中稀便、血便及體重下降等癥狀，并且可維持腸黏膜和腸上皮的完整性，減輕炎癥反應(yīng)程度。

UC 過程中組織炎癥通路激活后的炎癥因子釋放在組織損傷中起到重要作用，UC 腸道促炎因子和抗炎因子失衡后，炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，導(dǎo)致了UC 的慢性化發(fā)病過程［13-14］。TNF-α 是具有促進(jìn)炎癥作用的細(xì)胞因子，研究表明，TNF-α 能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化并產(chǎn)生浸潤作用，從而進(jìn)一步加重UC 結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng)［15］。本研究結(jié)果顯示，TNF-α 在UC 小鼠的結(jié)腸組織中表達(dá)水平升高，經(jīng)過黃芪多糖干預(yù)后的小鼠結(jié)腸組織中TNF-α 表達(dá)水平下降。說明黃芪多糖能夠抑制UC 中的炎癥反應(yīng)，從而減輕小鼠結(jié)腸組織的損傷程度。

Figure 5. Western blot for detecting protein expression of AdipoR2，PPAR-α and AMPK in colon tissues of mice in each group.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs blank control group；#P＜0.05 vs model group.圖5 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織AdipoR2和PPAR-α和AMPK蛋白表達(dá)水平

APN 是具有抗炎作用的特異性脂肪細(xì)胞因子，在肥胖和糖尿病患者血漿中APN 水平均降低，可視為抗肥胖和抗糖尿病激素［16］。還有研究表明，APN是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其在炎癥的進(jìn)程中起主要作用［17］。通常情況下，APN 水平在細(xì)胞中受到嚴(yán)格控制，并受到幾種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。炎癥性腸?。ò║C）患者血清APN水平明顯降低［18］，APN對于炎癥性腸病患者腸黏膜慢性炎癥有調(diào)節(jié)作用，但具體作用機(jī)制尚未進(jìn)行深入的探討。AdipoR包括AdipoR1、AdipoR2 及T-鈣黏素，且受體在不同部位的表達(dá)程度存在差異，受到諸多因子的調(diào)控作用［19］。

PPAR-α 信號(hào)通路和AMPK 信號(hào)通路是APN 及其受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的兩條重要通路。PPAR-α 是一種核受體，作為負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄因子，PPAR-α 直接參與過氧化物酶體和線粒體β 氧化途徑、脂肪酸攝取和甘油三酸酯分解代謝［20］。AMPK作為主要的代謝蛋白，是細(xì)胞內(nèi)主要的能量傳感器，可調(diào)節(jié)代謝合成與分解過程，從而保持糖脂代謝的平衡，也是APN 信號(hào)通路的重要下游通路［21］。在本研究中，UC 小鼠血清中APN 水平下降，同時(shí)AdipoR2、PPAR-α 及AMPK 表達(dá)水平降低，經(jīng)不同劑量黃芪多糖給藥后APN 水平升高，AdipoR2、PPARα及AMPK表達(dá)水平增加，說明黃芪多糖可能是通過APN 信號(hào)通路調(diào)節(jié)AMPK 和PPAR-α 的活性來實(shí)現(xiàn)對UC小鼠保護(hù)作用的。

綜上所述，黃芪多糖可提高UC小鼠血清APN和血液Hb 水平，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕UC 小鼠結(jié)腸組織受損，其機(jī)制可能與其調(diào)控APN 途徑及與之相關(guān)的PPAR-α 信號(hào)通路和AMPK 信號(hào)通路有關(guān)。然而研究中涉及的詳細(xì)機(jī)制和干預(yù)的有效靶點(diǎn)未證實(shí)，后續(xù)有待進(jìn)行深入探討。