五味子醇甲通過調(diào)控自噬流減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

臧 瑞， 郭 濤， 李旭華， 楊繼蘋， 何紅云， 武煜明△， 鄧儀昊△

（1云南中醫(yī)藥大學(xué)，2昆明理工大學(xué)，云南昆明650500）

缺血性腦卒中是大腦血液供應(yīng)中斷的結(jié)果，腦缺血發(fā)生后由于神經(jīng)元對(duì)能量需求較高，故對(duì)葡萄糖和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的缺乏敏感，在血液供應(yīng)嚴(yán)重受限的情況下，ATP 合成水平急劇下降但其利用仍然存在，隨即細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞膨脹、破裂［1］。腦組織及細(xì)胞的缺血損傷不僅導(dǎo)致梗死區(qū)域神經(jīng)元死亡，而且由于突觸結(jié)構(gòu)局部能量衰竭，使樹突功能以及神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)受損，導(dǎo)致周圍梗死區(qū)域存活神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能受損［2］。缺血性腦卒中發(fā)生后3～4.5 h 內(nèi)予靜脈注射重組纖溶酶原激活劑治療可減輕疾病死亡率，促進(jìn)患者早期康復(fù)［3］。缺血灶的再灌注雖可避免對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成永久性傷害，但會(huì)引起對(duì)腦組織產(chǎn)生包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞Ca2+超載、自由基毒性損傷、興奮性氨基酸和NO 毒性作用在內(nèi)二次損傷［4-6］。越來越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究試圖探求缺血再灌注發(fā)生的病理機(jī)制，從而為腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展提供參考資料。

自噬作為一種生物過程，自噬溶酶體可對(duì)自噬產(chǎn)物進(jìn)行有效降解并再次利用以促進(jìn)新的生物合成，從而避免受損細(xì)胞發(fā)生凋亡［7-8］。腦缺血再灌注后隨即發(fā)生神經(jīng)元自噬，抑制自噬可增強(qiáng)缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，而適當(dāng)激活神經(jīng)元自噬可以緩解缺血缺氧對(duì)腦組織造成的損傷［9-10］。自噬有復(fù)雜的分子機(jī)制，雙膜囊結(jié)構(gòu)的自噬體形成后將未折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器包裹，與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體［11］。自噬激活早期微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）向自噬泡募集，通過加工形成LC3-I，活化后與自噬泡表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合成LC3-II，因此檢測(cè)LC3-II 可提示自噬體累積［12］。但自噬體累積的原因可能是由于誘導(dǎo)自噬使自噬體生成增多，也可能是自噬途徑阻滯導(dǎo)致成熟自噬體累積所致，因此需要通過對(duì)“自噬流”的分析來區(qū)分自噬體累積的具體原因是由于自噬誘導(dǎo)還是“自噬流”下游步驟受阻［13］。神經(jīng)元自噬激活后自噬小體形成，線粒體因缺氧造成功能失調(diào)分泌泛素（ubiquitin，UB），泛素與自噬小體中P62 蛋白質(zhì)結(jié)合，使受損線粒體聚集并進(jìn)一步被分解代謝［14］。原溶酶體內(nèi)組織蛋白酶B（cathep?sin B，CTSB）在溶酶體內(nèi)未被激活，當(dāng)自噬小體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體后，CTSB 在自噬溶酶體的酸性環(huán)境中被激活為活性酶，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器的完全降解。同時(shí)，自噬溶酶體膜表面溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome-associat?ed membrane protein 1，LAMP1）可保護(hù)自噬溶酶體免受水解酶水解［15-16］。因此，CTSB 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平可反映自噬溶酶體水解酶激活程度，P62 與UB 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平可反映自噬溶酶體內(nèi)水解酶活性，評(píng)價(jià)“自噬流”是否受阻。

五味子是“地黃飲子”、“生脈飲”等傳統(tǒng)方劑中的主要成分之一，其中分離出的生物活性成分五味醇甲（schisandrin A，Sch A）可改善大鼠缺血性腦卒中引起的血腦屏障功能障礙，能夠直接透過血腦屏障在神經(jīng)細(xì)胞上發(fā)揮相應(yīng)作用［17-18］。有研究報(bào)道，Sch A 可通過增加成年小鼠海馬齒狀回下神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)元的成熟及存活［19］。同時(shí)Sch A可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕MCAO 大鼠神經(jīng)元損傷［20］。此外，在對(duì)帕金森病（Parkinson disease，PD）的研究中顯示，Sch A 預(yù)處理可激活神經(jīng)元自噬，通過保護(hù)酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞，減輕炎癥和氧化應(yīng)激，增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性，從而最終改善大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)，減少運(yùn)動(dòng)功能障礙，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)［21］。前期我們進(jìn)行的相關(guān)研究結(jié)果顯示，Sch A可通過誘導(dǎo)MCAO 大鼠腦缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬，對(duì)腦卒中后大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［22］，但Sch A的抗缺血再灌注作用是否是通過逆轉(zhuǎn)自噬相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)、減少自噬產(chǎn)物堆積實(shí)現(xiàn)目前尚無研究。因此，本研究旨在探討Sch A 對(duì)MCAO 大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的自噬機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF 級(jí)8 周齡健康雄性SD 大鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周至體重達(dá)到250～280 g。

1.2 藥物及主要試劑 Sch A 為純度98.49%的白色粉末，購(gòu)自Selleck，批號(hào)S382301。2%TTC 染色液（Solarbio）；抗β-actin、UB 和P62 抗體及DAPI（Cell Signaling Technology）；抗CTSB 抗體（Santa Cruz）；抗LAMP1 抗體（ABclonal）；抗LC3-II 抗體（Sigma）；抗NeuN抗體（Abcam）。

2 動(dòng)物模型制備及給藥

2.1 動(dòng)物模型制備 參照改良Zea Longa 法［23］制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（360 mg/kg）深度麻醉，頸部正中切口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），活結(jié)左側(cè)CCA 及ECA，對(duì)頸外動(dòng)脈的分枝枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈和咽升動(dòng)脈進(jìn)行分離結(jié)扎。無創(chuàng)傷微血管夾夾閉ICA 主干，ECA 近心端剪開小口，插入栓線栓子后松開微血管夾，栓子穿過ICA 入顱，至栓線進(jìn)入血管距離分叉處（20±1）mm 處并感輕微阻力，代表栓子已達(dá)到左側(cè)大腦中動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流阻斷。90 min 后取出栓子，結(jié)扎血管，縫合術(shù)口。假手術(shù)組，大鼠麻醉后將ECA 和ICA 暴露，僅結(jié)扎ECA，不閉塞大腦中動(dòng)脈，其他手術(shù)操作相同。

2.2 側(cè)腦室注射 將10%水合氯醛注射到大鼠腹腔，待其完全麻醉后在腦立體定位儀上進(jìn)行固定。剪開頭部皮膚暴露顱骨，顱鉆鉆孔安裝小螺絲。做側(cè)腦室注射點(diǎn)定位：前囟后0.8～1.0 mm，正中線向左旁開1.2～1.3 mm，硬腦膜下3.8～4.0 mm。確定側(cè)腦室注射點(diǎn)后鉆孔埋入給藥管，牙托自凝水泥包埋小螺絲及給藥管。

2.3 分組及給藥實(shí)驗(yàn) 大鼠DMSO 給藥濃度可控制在10%～20%［24］，為保證安全性及足夠給藥劑量，以10% DMSO 為溶劑最大濃度計(jì)算Sch A 為8.62 g/L，選取8 g/L 時(shí)動(dòng)物給藥濃度為160 μg/kg。預(yù)實(shí)驗(yàn)將SD 大 鼠 分 為Sch A（160 μg·kg-1·d-1）組、10%DMSO 溶劑組與空白模型組（n=3），給藥后觀察7 d均未出現(xiàn)明顯毒性作用，故確定Sch A最高給藥劑量160 μg·kg-1·d-1，倍數(shù)遞減中、低劑量為80 μg·kg-1·d-1和40 μg·kg-1·d-1。Sch A 各組在造模后立即予1 μL/min 的速度左側(cè)腦室給藥5 μL，給藥后留針5 min，后續(xù)每天給藥1次，MCAO 組大鼠每天予相同體積對(duì)照溶劑10% DMSO 左側(cè)腦室注射，各組大鼠均給藥7 d。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦組織TTC 染色 依照modified neurological severity scores（mNSS）［25］評(píng) 分法，給藥7 d 后對(duì)每組6 只大鼠進(jìn)行評(píng)分。進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分后麻醉處死取腦，置于-20℃冷凍20 min，在腦槽中將其切成2 mm 連續(xù)冠狀切片，然后在37℃避光環(huán)境中用0.2% TTC 染液孵育30 min。染色后梗死區(qū)域呈蒼白色，正常腦組織呈暗紅色。ImageJ 分析軟件對(duì)相關(guān)圖片進(jìn)行分析，計(jì)算梗死范圍百分比。計(jì)算公式：腦梗死體積百分比（%）=梗死體積/對(duì)側(cè)大腦半球體積×100%。

3.2 Western blot 分析 給藥7 d 后每組隨機(jī)6 只大鼠處死取腦，于冰上取其左側(cè)腦缺血半影區(qū)組織，BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒對(duì)各組樣本蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行逐一確定。調(diào)配濃度為12%的分離膠，上樣后電泳分離，濕轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。10%脫脂奶粉室溫下封閉1 h 后選取對(duì)應(yīng)分子量蛋白質(zhì)條帶分別封Ⅰ抗，4℃搖床孵育過夜后，TBST 洗膜3 次，用HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗稀釋液封膜，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光底物浸泡后放入暗盒，暗室內(nèi)用X 光片對(duì)條帶進(jìn)行壓片處理。蛋白條帶用ImageJ 軟件處理，進(jìn)行灰度值的分析。

3.3 免疫熒光雙標(biāo)染色 給藥7 d 后每組選取6 只大鼠，使用水合氯醛完全麻醉后生理鹽水心血管灌注，再用4%多聚甲醛繼續(xù)灌流固定、取腦，將大腦浸入4%多聚甲醛中固定24 h，轉(zhuǎn)30%蔗糖溶液中脫水。OCT 包埋劑包埋后冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為20 μm。將切片后腦組織PBS 漂洗，浸入0.2%Triton X-100 溶液內(nèi)室溫透化，用PBS 進(jìn)行再一次漂洗后置入濃度為10%的BSA 溶液中，在室溫環(huán)境下封閉1 h，加入Ⅰ抗NeuN 和LC3-II 抗體4℃封閉過夜后用PBS 對(duì)腦片再次進(jìn)行清洗。避光環(huán)境，添加熒光Ⅱ抗，室溫孵育1 h，DAPI復(fù)染前PBS漂洗，最后滴加抗熒光淬滅劑。繼續(xù)避光環(huán)境下熒光顯微鏡觀察并拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。選用單因素方差分析（one-way ANOVE）對(duì)各組中得到的數(shù)值進(jìn)行評(píng)估比較，兩組之間測(cè)量變量差異用Newman-Keuls 檢驗(yàn)評(píng)估。以P＜0.05 為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 五味子醇甲對(duì)MCAO 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

mNSS 評(píng)分結(jié)果顯示，sham 組大鼠沒有出現(xiàn)神經(jīng)功能方面的缺損，而MCAO 組損傷癥狀明顯，其mNSS 評(píng)分較sham 組顯著升高。與MCAO 組相比，Sch A 各劑量組神經(jīng)功能損傷癥狀減輕，mNSS 評(píng)分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且各治療組中神經(jīng)功能損傷評(píng)分隨Sch A 的給藥劑量增加而呈逐漸下降趨勢(shì)，其中Sch A（40 μg·kg-1·d-1）和Sch A（80 μg·kg-1·d-1）組間無顯著差異（P＞0.05），見圖1。

2 五味子醇甲對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響

Figure 1. Effects of Sch A on neurological deficit score in rats with cerebral I/R injury. Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO group；△P＜0. 05 vs 40 and 80 μg/kg Sch A group.圖1 Sch A對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

TTC 染色結(jié)果顯示，MCAO 大鼠出現(xiàn)白色腦梗死區(qū)域，經(jīng)Sch A 治療后，各治療組白色腦梗死區(qū)域體積縮?。桓鹘M腦梗死體積數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，Sch A 治療7 d 后，與MCAO 組大鼠相比，Sch A 各劑量組大鼠腦梗死區(qū)域體積顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），但Sch A（40 μg·kg-1·d-1）和Sch A（80 μg·kg-1·d-1）組無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

Figure 2. Effects of Sch A on the infract volume in rats with cerebral I/R injury（TTC staining）. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO group；△P＜0.05 vs 40 and 80 μg/kg Sch A group.圖2 Sch A對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響

3 五味子醇甲對(duì)MCAO 大鼠腦缺血半影區(qū)自噬流相關(guān)蛋白的影響

Western blot 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與sham 組相比，MCAO 組大鼠腦皮層中P62 和UB 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），CTSB 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；經(jīng)Sch A 治療7 d 后，與MCAO 組相比，Sch A 低劑量組P62蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），P62 蛋白表達(dá)水平在中、高劑量組均顯著降低（P＜0.05），各治療組UB 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），而CTSB 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），均以Sch A 高劑量組的蛋白質(zhì)表達(dá)量變化最為顯著；MCAO 組LAMP1 的蛋白質(zhì)表達(dá)量較sham 有降低趨勢(shì)，用藥后Sch A 各治療組較MCAO 組LAMP1 的蛋白質(zhì)表達(dá)量有增加趨勢(shì)，但所有組別間無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

4 五味子醇甲對(duì)MCAO 大鼠腦缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬表達(dá)的影響

Figure 3. Effects of Sch A on expression of autophagic flux-related proteins after MCAO. The protein levels of P62，ubiquitin（UB），lysosome-associated membrane protein 1（LAMP1）and cathepsin B（CTSB）in the cortex of each group were evaluated by Western blot analysis. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05 vs MCAO group；#P＜0.05 vs 80 μg/kg Sch A group.圖3 Sch A對(duì)MCAO大鼠腦缺血半影區(qū)自噬流相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果提示，大鼠腦缺血半影區(qū)神經(jīng)元上出現(xiàn)LC3-II 的自噬活性表達(dá)。與sham 組相比，MCAO 組LC3-II 表達(dá)陽性的神經(jīng)元比例顯著升高（P＜0.01）；Sch A 治療7 d 后與MCAO 組相比，LC3-II 表達(dá)陽性的神經(jīng)元比例增加（P＜0.05 或P＜0.01），且與Sch A 低劑量及中劑量組相比，Sch A 高劑量組LC3-II 表達(dá)陽性的神經(jīng)元比例升高顯著（P＜0.05），見圖4。

討 論

Sch A 具有多種藥理活性，是中藥五味子中的有效成分。以往研究表明，在MCAO 大鼠缺血24 h 后Sch A 可使神經(jīng)元在急性缺血缺氧損傷中存活，減少由缺血性腦損傷引起的神經(jīng)功能障礙，同時(shí)逆轉(zhuǎn)了氧糖剝奪損傷引起的細(xì)胞死亡。這種神經(jīng)保護(hù)作用與Sch A 調(diào)節(jié)AMPK/Nrf2 通路抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，增加抗炎細(xì)胞因子濃度有關(guān)，通過抑制神經(jīng)元的氧化應(yīng)激，減少壞死神經(jīng)元的數(shù)量實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)［26］。

Figure 4. LC3-II expression positive neurons determined by immunofluorescence（scale bar=50 μm）. Autophagic cells were stained with LC3 antibody（red）. Neurons were stained with NeuN antibody（green）. Cell nuclei were visualized by DAPI（blue）.Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05 vs MCAO group；#P＜0.05 vs 80 μg/kg group.圖4 Sch A對(duì)MCAO大鼠腦缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬的影響

大鼠腦缺血再灌注發(fā)生后，為減輕缺氧缺血引起的神經(jīng)元壞死及腦損傷，通過PI3K-Akt 軸增加神經(jīng)元自噬發(fā)生可使beclin-1 和LC3-II 的表達(dá)升高［27-28］。我們前期研究表明，Sch A 可促進(jìn)神經(jīng)元be?clin-1 和LC3-II 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平從而增加自噬過程［22］。自噬激發(fā)后相較于本底水平自噬小體生成量增加，與溶酶體結(jié)合后生成自噬溶酶體，進(jìn)一步促進(jìn)自噬底物的降解，而自噬溶酶體融合障礙或自噬溶酶體功能障礙時(shí)“自噬流”受阻也可引起自噬小體的累積增多［29］，以上情況均可導(dǎo)致LC3-II 的表達(dá)增加，因此單獨(dú)的LC3-II 的表達(dá)升高并不一定提示“自噬流”的通暢，需結(jié)合自噬流降解蛋白質(zhì)的水平變化綜合分析。CTSB 是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，在酸性環(huán)境中可激發(fā)其活性，當(dāng)溶酶體內(nèi)PH 值下降或自噬溶酶體形成后，CTSB被激活降解包裹蛋白質(zhì)或細(xì)胞器［30］。LAMP1 是自噬溶酶體膜上的標(biāo)志性蛋白，隨著自噬啟動(dòng)自噬溶酶體形成增多，LAMP1 及CTSB 的表達(dá)也應(yīng)隨之增加。同時(shí)，自噬溶酶體形成后會(huì)完成對(duì)自噬底物的包裹與分解，故使P62 與UB表達(dá)減少。本實(shí)驗(yàn)Western blot 結(jié)果提示Sch A 處理后各劑量組大鼠腦缺血半影區(qū)LAMP1 蛋白質(zhì)表達(dá)量?jī)H有上升趨勢(shì)，但并未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？紤]LAMP1 雖然是自噬溶酶體膜上的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，但其特異性不高，可存在于溶酶體、自噬體等多種細(xì)胞器膜上，所以單純檢測(cè)LAMP1 的表達(dá)升高或降低并不能夠判斷神經(jīng)元溶酶體或自噬溶酶體的存在［31］。大鼠腦缺血再灌注后LAMP1 表達(dá)降低可能是由于缺血半影區(qū)細(xì)胞死亡引起，給藥后隨著神經(jīng)保護(hù)作用的產(chǎn)生，存活細(xì)胞及其內(nèi)細(xì)胞器增多，故出現(xiàn)LAMP1 表達(dá)水平升高的趨勢(shì)。與sham 組對(duì)比，MCAO 組CTSB 低表達(dá)提示此時(shí)大鼠腦缺血半影區(qū)自噬溶酶體水解酶活性低，P62 及UB 的表達(dá)量增加則是由于自噬溶酶體水解酶活性降低導(dǎo)致的自噬底物堆積引起。與MCAO組比較，Sch A不同濃度處理7 d 后CTSB 表達(dá)水平提高，對(duì)應(yīng)P62 及UB 蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降，提示Sch A處理后逆轉(zhuǎn)大鼠缺血半影區(qū)自噬相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)，溶酶體水解酶活性提高，自噬底物被進(jìn)一步分解，此作用在Sch A高劑量組更為顯著。免疫熒光雙標(biāo)法做細(xì)胞定位，結(jié)果表明，與sham組相比，MCAO 組大鼠缺血半影區(qū)LC3-II蛋白表達(dá)，且此表達(dá)主要呈現(xiàn)于神經(jīng)元，提示大鼠腦缺血再灌注后自噬小體的形成主要發(fā)生于神經(jīng)元。Sch A 處理后各劑量組LC3-II 表達(dá)呈陽性的神經(jīng)元比例增加，提示Sch A 增加了MCAO 大鼠神經(jīng)元自噬小體的表達(dá)。結(jié)合Western blot 結(jié)果，自噬發(fā)生后自噬溶酶體內(nèi)水解酶活性提高進(jìn)一步分解自噬底物，因此神經(jīng)元自噬小體的增加并不是自噬底物堆積或自噬流的阻斷引起，而是由于Sch A處理后增加了神經(jīng)元的自噬誘導(dǎo)，隨著自噬流的進(jìn)行，自噬小體增加隨之增多。腦缺血和再灌注損傷均可導(dǎo)致神經(jīng)元受損，而神經(jīng)學(xué)評(píng)分及腦梗死體積是評(píng)估大鼠腦損傷的具體標(biāo)志［32］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)mNSS 評(píng)分及TTC 染色結(jié)果，Sch A 處理后降低大鼠mNSS 評(píng)分，減少缺血梗死體積，且表現(xiàn)出較好的劑量依賴性。綜合以上資料表明，Sch A 具有較好的抗缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與神經(jīng)元自噬相關(guān)。

綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，Sch A 處理MCAO大鼠后可逆轉(zhuǎn)其缺血半影區(qū)CTSB、P62及UB表達(dá)水平，減少自噬產(chǎn)物堆積而產(chǎn)生抗腦缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與神經(jīng)元自噬相關(guān)。Sch A 雖然在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護(hù)作用，但對(duì)MCAO 大鼠神經(jīng)元自噬的影響研究較少。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞生物過程，單純從此過程中部分蛋白的升高或降低不足以判讀自噬流的增強(qiáng)或減弱，因此在目前研究基礎(chǔ)上選擇適當(dāng)?shù)淖允呻A段及相對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)劑或抑制劑干預(yù)，以探究Sch A 對(duì)MCAO 大鼠神經(jīng)元自噬的影響是我們下一步將深入探討的課題。