重樓單體PP-11對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用及其機制*

朱金艷， 葉靜怡， 劉志龍， 李 強， 趙 娜， 吳志慧，蔣建偉， 林 晨， 湯 杰

（暨南大學 1基礎醫(yī)學院微生物和免疫學系，2基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，3附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510632；4江蘇省溧陽市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇溧陽213300）

雖然通過外科手術(shù)及聯(lián)合放療、化療等治療手段，早期乳腺癌的5 年生存率可達70%以上，但仍有30%～40%面臨復發(fā)的風險，復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌5 年生存率僅20%，且都存在耐藥或嚴重毒副反應等方面的問題［1-2］。因此，研究抗乳腺癌新藥，對乳腺癌治療具有重要意義。

重樓（Paris polyphylla，PP）為百合科植物，是云南白藥、四川抗病毒沖劑、季德勝蛇藥片、宮血寧和熱毒清等著名中成藥的主要原料之一。本課題組吳霞等［3］選擇該植物的全草、花、莖葉、根、果實等藥用部位，分別用95%乙醇、水和水蒸氣進行提取，得到各部位的醇提物、水提物及部分揮發(fā)油樣品；接著采用MTT 法檢測這些提取物對人鼻咽癌CNE1 細胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)重樓的醇提物抑癌效果最顯著；隨后進一步采用MTT 法追蹤重樓抗腫瘤的有效成分，從重樓的醇提取物中分離出51 種活性單體，并篩選出16 種抗腫瘤效果優(yōu)于化療藥物順鉑的候選單體［4］，包括單體PP-11。承續(xù)上述工作，我們在本研究中探討單體PP-11 對人乳腺癌MDA-MB-231 細胞的抗腫瘤作用及分子機制。

材料和方法

1 主要試劑

重樓單體PP-11（結(jié)構(gòu)式見圖1A）為暨南大學藥學院王國才教授提供。大致提取過程為：取干燥的重樓根10 kg，粉碎后用40 L 70%乙醇滲漉提取，提取液經(jīng)合并后減壓濃縮得浸膏1.5 kg。浸膏用水分散，經(jīng)離心后取上清液過HP-20 型大孔吸附樹脂，依次用水及30%、60%和90%乙醇梯度洗脫。將90%乙醇洗脫部位減壓濃縮，所得浸膏（550 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇系統(tǒng)（99∶1→1∶1）梯度洗脫，薄層層析分析合并，得到14 個餾分，其中第10 餾分（Fr.10，共20.3 g）經(jīng)ODS（C-18）色譜柱、硅膠柱層析、羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）柱及高效液相色譜 技 術(shù)（high-performance liquid chromatography，HPLC）獲得化合物PP-10（66.3 mg）、PP-11（50.6 mg）、PP-13（164.0 mg）、PP-24（57.9 mg）和PP-26（45.5 mg）。其中，PP-11 經(jīng)HPLC 分析，在8.33 min處見單峰，純度98%以上（圖1B）。

人乳腺癌MDA-MB-231 細胞由中山大學腫瘤醫(yī)院實驗研究部朱孝峰教授提供。MTT 購自Sigma；Hoechst 333258 購自廣州威佳公司；caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bcl-xL、Bim、Bok、PARP、cleaved PARP、ERK、p-ERK、p38、p-p38、p-p53、Stat3、p-Stat3、c-Myc、cyclin D、Mcl-1、LC3-Ⅱ、p62/SQSTM1 和GAPDH 等Ⅰ抗均購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠的Ⅱ抗購于Proteintech；p38 抑制劑SB203580 購自上海陶素生化科技公司；總caspase抑制劑Z-VAD-FMK 購自Selleck；自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）購自上海碧云天公司。

Figure 1. The structure and purity of PP-11. A：the molecular structure of PP-11；B：the purity of PP-11 was determined by HPLC analysis with a single peak at 8.33 min.圖1 PP-11的結(jié)構(gòu)及HPLC測定結(jié)果

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，當細胞生長達到70%～80%時，用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 MTT 法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的MDA

MB-231 細胞，調(diào)整細胞密度為5×107/L，取100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。將DMEM 培養(yǎng)液稀釋的PP-11 加入各孔，終濃度分別為0、1.875、3.75、7.5 和15 μmol/L。每個濃度設5 個復孔，培養(yǎng)24、48和72 h 后，各孔加入5 g/L 的MTT 工作液20 μL，放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h 后棄上清，加入150 μL DMSO，用多功能酶標儀在570 nm 波長測定吸光度（A）值，計算細胞活力抑制率?；盍σ种坡剩?）=（1-A實驗組/A對照組）×100%，重復3次。

2.3 細胞集落形成實驗 取對數(shù)生長期的MDAMB-231 細胞消化后，調(diào)整細胞密度，接種到6 孔板中，使每孔細胞數(shù)為1×103；待細胞貼壁后，加入PP-11（0 和4 μmol/L），終體積為2 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，棄上清，4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.1%結(jié)晶紫液染色20 min，流水沖洗，晾干，觀察、拍照。

2.4 Hoechst 33258 染色檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細胞，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整密度為4.0×108/L；取1 mL 細胞懸液加入于6 孔板中，輕輕搖勻細胞板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中；待細胞貼壁后加入PP-11，終濃度分別為0 和4 μmol/L，終體積為2 mL，作用24 h 后PBS 洗滌，加入500 μL 的Hoechst 33258 染液，制成細胞涂片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.5 Annexin V-FITC/PI 雙染及流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)同上，調(diào)整細胞密度為5.0×108/L；待細胞貼壁后，加入PP-11，終濃度為0、1、2 和4 μmol/L，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行孵育；24 h 后消化收集細胞，離心洗滌3 次，加入200 μL Binding Buffer，然后加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕吹打混勻，置于常溫避光孵育20 min；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

2.6 Western blot 檢測細胞凋亡相關蛋白 細胞培養(yǎng)同上，不同濃度的PP-11 作用MDA-MB-231 細胞24 h；加入細胞裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000×g離心15 min，吸取上清，BCA 法測蛋白濃度。取適量蛋白，常規(guī)制膠上樣，蛋白電泳；然后轉(zhuǎn)膜，封閉，加已稀釋的Ⅰ抗，4℃搖床孵育過夜；TBST 洗膜，加相應辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（1∶5 000），室溫下振蕩孵育2 h；TBST 洗膜，化學發(fā)光顯色，凝膠成像儀中進行顯影拍照。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)均為3 次獨立實驗所得出的結(jié)果，以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 PP-11抑制MDA-MB-231細胞活力

采用MTT 法測定PP-11 對MDA-MB-231 細胞活力的影響，如圖2A 所示，與對照組細胞相比，使用不同濃度（0、1.875、3.75、7.5和15 μmol/L）的PP-11處理MDA-MB-231細胞24、48和72 h后，細胞活力抑制率隨著PP-11 濃度的增加而升高。PP-11 對MDAMB-231 細 胞 作 用24、48 和72 h 后 的IC50分 別 為5.64、4.58 和3.06 μmol/L。細胞集落形成實驗進一步證明，與對照組相比，PP-11 作用于MDA-MB-231細胞7 d，細胞集落形成受到顯著抑制，見圖2B。

Figure 2. Effect of PP-11 on the proliferation of MDA-MB-231 cells. A：the MDA-MB-231 cells were exposed to various concentra?tions of PP-11 for 24，48 and 72 h，and the cell viability inhibitory rate was determined by MTT assay. B：the MDA-MB-231 cells were seeded in 6-well plates at density of 1 000 cells per well and treated with 4 μmol/L PP-11 for 7 d. All colo?nies were stained with crystal violet solution and images of the colonies were captured by a digital camera.圖2 PP-11對MDA-MB-231細胞增殖的影響

2 PP-11誘導MDA-MB-231細胞凋亡

4 μmol/L 的PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞24 h 后，經(jīng)Hoechst 33258 染色，在熒光顯微鏡下觀察到，與對照組細胞相比，PP-11 處理組細胞出現(xiàn)細胞核固縮，呈高密度狀甚至裂解，并且伴有核邊聚的塊狀熒光（圖3A）。

流式細胞術(shù)測定結(jié)果也證明，不同濃度的PP-11（0、1、2 和4 μmol/L）處理MDA-MB-231 細胞24 h 后，細胞發(fā)生凋亡，且隨著PP-11 濃度的增加，細胞凋亡率也相應增加（圖3B）。

Figure 3. PP-11 induced apoptosis of MDA-MB-231 cells. A：the morphological changes of apoptotic MDA-MB-231 cells were de?tected by Hoechst 33258 staining after the cells were exposed to 4 μmol/L PP-11 for 24 h（scale bar=50 μm）；B：annexin V-FITC/PI staining of MDA-MB-231 cells was performed after the cells were treated with increasing concentrations of PP-11 for 24 h.圖3 PP-11誘導MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡

3 PP-11以caspase依賴的方式誘導細胞凋亡

不同濃度的PP-11 處理MDA-MB-231 細胞24 h，Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著PP-11 藥物濃度的增加，PP-11 處理組caspase-9、caspase-3 及PARP 蛋白水平表達逐漸降低，而cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及cleaved PARP 蛋白水平逐漸升高（圖4A）。

采用總caspase 抑制劑Z-VAD-FMK 進行阻斷實驗，結(jié)果提示，與PP-11 組相比，PP-11 聯(lián)合Z-VADFMK 組cleaved caspase-3 蛋白水平顯著降低，凋亡效應分子caspase-3 蛋白的活化被抑制，細胞凋亡減少（圖4B）。

4 PP-11 對MDA-MB-231 細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位的異常是啟動線粒體途徑凋亡的關鍵。接下來我們采用JC-1染色方法觀察不同濃度PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞24 h，細胞內(nèi)線粒體膜電位的改變情況。如圖5 所示，與對照組相比，PP-11組細胞的熒光從高綠高紅轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔G低紅，即紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光相對紅色熒光增強，表明PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞后致使線粒體膜電位的降低。

Figure 5. Detection of mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231 cells with PP-11 treatment using JC-1 staining. Scale bar=50 μm.圖5 PP-11處理MDA-MB-231細胞后線粒體膜電位的改變

5 PP-11 對MDA-MB-231 細胞Bcl-2 家族蛋白表達的影響

不同濃度（0、1、2 和4 μmol/L）PP-11 處理MDAMB-231 細胞24 h，Western blot 結(jié)果顯示，與對照組細胞相比，隨著PP-11 作用濃度的增加，細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL 蛋白表達水平逐漸降低，促凋亡蛋白Bim 和Bok 蛋白表達水平則逐漸上升（圖6）。

6 PP-11對MDA-MB-231細胞MAPK通路的影響

采用Western blot 法測定不同濃度（0、1、2 和4 μmol/L）PP-11 作 用 于MDA-MB-231 細 胞24 h 后MAPK 信號通路相關蛋白表達情況，結(jié)果所示，隨著PP-11作用濃度的增加，p38和ERK水平不變，p-p38和p-p53 均呈顯著增加，p-ERK 蛋白表達顯著降低（圖7A）。

Figure 6. Effect of PP-11 on Bcl-2 family proteins in MDA-MB-231 cells. The expression levels of Bcl-2 family pro?teins in MDA-MB-231 cells were detected by Western blot after the cells were exposed to various concentra?tions of PP-11 for 24 h.圖6 PP-11 對MDA-MB-231 細胞內(nèi)Bcl-2 家族蛋白表達的影響

采用p38 專一性抑制劑SB203580 進行阻斷實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP-11 促進caspase-9 和PARP 蛋白表達的減少，促進cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP 蛋白水平升高，與前面Western blot結(jié)果相一致；PP-11 聯(lián)合SB203580 則部分逆轉(zhuǎn)了pp38、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP蛋白水平的升高（圖7B）。

7 PP-11 對MDA-MB-231 細胞JAK-Stat3 通路的影響

檢測PP-11 對MDA-MB-231 細胞JAK-Stat3 通路的影響，當不同濃度（0、1、2 和4 μmol/L）的PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞24 h，Stat3 蛋白表達不變，p-Stat3（Tyr705）蛋白水平下降，Stat3 下游蛋白c-Myc、cyclin D和Mcl-1的表達亦減少（圖8）。

8 PP-11對MDA-MB-231細胞自噬的影響

Western blot 檢測顯示，當不同濃度（0、1、2 和4 μmol/L）的PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞24 h，隨著PP-11濃度的增加，細胞自噬相關蛋白LC3-II表達逐漸增加，p62/SQSTM1表達逐漸下降（圖9A）。

采用自噬阻斷劑CQ 進行阻斷實驗。與對照組細胞相比，PP-11 組凋亡相關蛋白PARP 表達減少，cleaved PARP 水平升高，自噬標志性蛋白p62表達減少；PP-11聯(lián)合CQ逆轉(zhuǎn)了PP-11誘導的PARP表達減少、cleaved PARP水平升高和p62表達減少（圖9B）。

阻斷實驗后的MTT結(jié)果顯示，自噬阻斷劑CQ對細胞活力的抑制作用較弱，PP-11 降低了細胞活力（P＜0.01），而PP-11 聯(lián)合CQ 則逆轉(zhuǎn)了PP-11 對細胞活力的抑制（P＜0.05），見圖9C。

Figure 7. Effect of PP-11 on the expression of MAPK signaling pathway-related proteins in MDA-MB-231 cells. A：the cells were ex?posed to various concentrations of PP-11 for 24 h，and the protein levels of p38，p-p38，p53，p-p53，ERK and p-ERK were evaluated by Western blot；B：the cells were pretreated with or without 8 μmol/L SB203580 for 2 h before treatment with 4 μmol/L PP-11，and Western blot was performed to detect the levels of p38，p-p38 and apoptosis-related proteins.圖7 PP-11對MDA-MB-231細胞MAPK信號通路相關蛋白表達影響

討 論

百合科中藥重樓在我國擁有著悠久的藥用歷史，它是云南白藥、四川抗病毒沖劑、季德勝蛇藥片、宮血寧、熱毒清等著名中成藥的主要原料之一。在臨床上常配伍相應的藥物廣泛用于多種腫瘤如鼻咽癌、喉癌、胃癌、肝癌、直腸癌、肺癌、腦瘤、宮頸癌和急性白血病等的治療，均有一定效果?，F(xiàn)代藥理實驗提示，重樓化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，藥理活性較強［6-7］。

Figure 8. Effect of PP-11 on the levels of JAK-Stat3 signaling pathway-related proteins in MDA-MB-231 cells. The cells were exposed to increasing concentrations of PP-11 for 24 h，and the protein levels were analyzed by Western blot.圖8 PP-11 對MDA-MB-231 細胞JAK-Stat3 信號通路相關蛋白表達的影響

在已提取分離的51 種重樓活性單體中，本課題組譚桂香等提出重樓活性單體PP-22 可誘導鼻咽癌CNE-2細胞自噬和凋亡［8］；本課題組宮瑞松等提出重樓活性單體PP-22 作用于胃癌MGC803 細胞后，細胞阻滯在S期，并通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白、促進線粒體凋亡途徑使細胞發(fā)生凋亡，同時能夠提高MGC803細胞對化療藥物5-氟尿嘧啶和洛鉑的敏感性［9］。本課題組還提出PP-26 活性單體通過抑制Akt 信號通路使MDA-MB-231 細胞被阻滯于G2/M 期，并誘導細胞凋亡。

重樓的主要有效成分是甾體皂苷，按苷元的不同主要有兩類，一類為薯蕷皂苷元（diosgenin）的糖苷，另一類為偏諾皂苷元（pennogenin）的糖苷。本研究使用的重樓單體PP-11 與前期實驗中的重樓活性單體PP-22 分子結(jié)構(gòu)類似，屬于偏諾皂苷類化合物［8］。MTT 法及集落形成實驗結(jié)果顯示，PP-11能顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖（圖2）。

Figure 9. PP-11 induced autophagy of MDA-MB-231 cells. A：MDA-MB-231 cells were exposed to PP-11 for 24 h，and autophagic marker proteins were detected by Western blot；B：MDA-MB-231 cells were exposed to 4 μmol/L PP-11 with or without 10 μmol/L chloroquine（CQ）pretreatment，and the levels of apoptotic and autophagic marker proteins were determined by Western blot；C：MDA-MB-231 cells were exposed to 4 μmol/L PP-11 for 24 h after pretreatment with 10 μmol/L CQ for 2 h，and the cell viability was detected by MTT assay. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs PP-11 group.圖9 PP-11誘導MDA-MB-231細胞發(fā)生自噬

誘導腫瘤細胞凋亡是臨床抗癌治療的策略之一［11］。細胞凋亡信號通路包括內(nèi)源性凋亡信號通路（線粒體相關的凋亡信號通路），外源性凋亡信號通路（死亡受體相關的凋亡信號通路）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的凋亡信號通路［12］。Bcl-2 家族蛋白在內(nèi)源性細胞凋亡信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的凋亡通路中具有重要作用，它包括抗凋亡、促凋亡及BH3-only 蛋白亞家族［13-14］。caspase-9 是線粒體凋亡信號通路所必需的caspase 的重要分子，caspase-9 被激活后，會裂解并激活效應分子caspase-3，并進一步切割下游蛋白。PARP 是caspase-3 的 切 割 底 物，caspase-3 切 割PARP，致使Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶活性增加，裂解核小體間的DNA，促進細胞凋亡［15-16］。本研究通過Hoechst 染色、流式細胞術(shù)、Western blot 等均證明PP-11 可促進人乳腺癌MDA-MB-231 細胞凋亡。進一步實驗提示，PP-11 抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 和BclxL 的表達，增加促凋亡蛋白Bim 和Bok 表達，降低細胞線粒體膜電位。同時，總caspase 抑制劑Z-VADFMK 逆轉(zhuǎn)了PP-11 導致的cleaved caspase-3 切割活化，說明重樓單體PP-11通過啟動線粒體凋亡途徑并以caspase依賴的方式介導MDA-MB-231細胞凋亡。

MAPK 為一類哺乳動物細胞普遍表達的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其信號通路的激活通過連續(xù)的酶促反應激活下游靶基因，最終參與細胞增殖分化、細胞周期、細胞凋亡等一系列的生化過程［17-18］。在本研究中，PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞24 h 后Western blot 檢測提示，p-ERK 蛋白水平降低，p38 磷酸化水平升高，下游蛋白p-p53 蛋白水平升高（圖7A）。SB203580（p38 專一性抑制劑）阻斷實驗提示，與對照組細胞相比，PP-11 組細胞cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 和cleaved PARP 蛋白水平升高，而PP-11 聯(lián) 合SB203580 組cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP 蛋白水平降低（圖7B），提示PP-11 通過激活p38 MAPK 通路，抑制ERK 通路，從而促進MDA-MB-231細胞凋亡。

Stat3屬于信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族中的重要分支。細胞接受到外界因素刺激時可激活胞內(nèi)非受體型蛋白酪氨酸激酶JAK，進而磷酸化并激活Stat3，活化后的Stat3 以二聚體的形式進入細胞核內(nèi)，并與相應的靶基因啟動子區(qū)域結(jié)合，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移和侵襲［19-20］。本實驗提示，PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞后，p-Stat3（Tyr705）水平下降，Stat3 下游蛋白c-Myc、cyclin D 和Mcl-1 的表達減少，提示PP-11 可通過抑制stat3 通路促進細胞凋亡（圖8）。

自噬在維持細胞正常生理功能和細胞穩(wěn)態(tài)中起著重要的調(diào)控作用。內(nèi)、外因素的刺激，如營養(yǎng)不足、化學藥物、紫外線刺激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等情況會促進細胞自噬發(fā)生。自噬對于腫瘤細胞的作用是雙面的，一方面自噬有利于腫瘤細胞克服不利的環(huán)境因素，促進腫瘤的發(fā)展；另一方面，細胞通過自噬性死亡抑制腫瘤的進展［21-22］。本實驗提示，PP-11 作用于MDA-MB-231 細胞，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達增加，p62/SQSTM1 表達下降（圖9A），提示PP-11 促進細胞自噬。當采用自噬阻斷劑CQ 阻斷自噬過程，則逆轉(zhuǎn)了PP-11 誘導的PARP 表達減少、cleaved PARP 水平升高和p62 表達減少等現(xiàn)象（圖9B），并部分地逆轉(zhuǎn)了PP-11 對細胞活力的抑制作用（圖9C），提示PP-11誘導的細胞自噬是保護性自噬。

綜上所述，重樓單體PP-11 能抑制MDA-MB-231細胞增殖，并通過激活p38 MAPK 通路，抑制Stat3 和ERK通路促進細胞凋亡及自噬（圖10）。

Figure 10. The schematic diagram demonstrating the mecha?nism of PP-11 inducing autophagy and apoptosis of MDA-MB-231 cells. PP-11 activated p38 mitogenactivated protein kinase（MAPK）pathway，inhibited ERK and STAT3 signaling pathway，and promoted the autophagy and apoptosis of MDA-MB-231 cells.圖10 PP-11 誘導MDA-MB-231 細胞發(fā)生凋亡與自噬的分子機制示意圖