靶向α4β2 nAChR的戒煙藥物的合成與生物活性評價(jià)

羅蒙強(qiáng) 張耀紅

(紹興文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，浙江 紹興 312000)

0 引言

吸煙成癮嚴(yán)重威脅人類健康，研究表明吸煙與心臟病、癌癥、消化系統(tǒng)疾病、呼吸道疾病和心腦血管疾病等密切相關(guān)[1]，吸煙成癮主要原因是尼古丁與位于中腦緣多巴胺系統(tǒng)的神經(jīng)型α4β2 nAChR作用釋放神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺，從而引起獎賞效應(yīng)，而長期使用尼古丁可以導(dǎo)致中腦緣多巴胺系統(tǒng)α4β2 nAChR的數(shù)量和活性改變，進(jìn)而引起對尼古丁依賴和戒斷癥狀的發(fā)生[2].其次是α7 nAChR，α7 nAChR的激動與尼古丁引起的戒斷反應(yīng)密切相關(guān)[3].另外，神經(jīng)型α3β4 nAChR不但可以減少尼古丁和乙醇的給藥，還與尼古丁引起的戒斷反應(yīng)有關(guān)[4]，含有α5*或α6* nAChR也與尼古丁引起的獎賞效應(yīng)相關(guān)[5].因此，以神經(jīng)型nAChR為靶點(diǎn)開發(fā)戒煙藥物，是一種非常有效的治療策略.

目前，靶向nAChR的戒煙藥物分為四類：(1)尼古丁替代品.由于戒煙的過程仍需小劑量醫(yī)用尼古丁，仍具有成癮性，而且治療周期長，復(fù)吸率高，成功率較低(3%～36.8%)[6-7].(2)nAChR部分激動劑如法尼克蘭和金雀花堿.法尼克蘭是2006年美國FDA批準(zhǔn)上市的戒煙藥物，為α4β2 nAChR部分激動劑.它通過與α4β2 nAChR結(jié)合產(chǎn)生激動和拮抗雙重作用進(jìn)行戒煙，但是部分人服用后會產(chǎn)生抑郁和自殺傾向等副作用[8].金雀花堿是選擇性的α4β2nAChR部分激動劑，其血腦屏障滲透性較差，戒煙效率約僅是尼古丁取代治療的14%[9].(3)nAChR拮抗劑如Bupropion和Mecamylamine.Bupropion是α3β4 nAChR非競爭性拮抗劑，在1997年獲美國FDA批準(zhǔn)上市成為戒煙藥物，主要通過抑制去甲腎上腺素和多巴胺對神經(jīng)的激活和強(qiáng)化作用來減少對煙草的渴望和患者的戒斷癥狀，但是服用后會產(chǎn)生濕疹、蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫等不良反應(yīng)[10].Mecamylamine是非競爭性的α3β4 nAChR拮抗劑，但nAChR亞型選擇性較差[11].用于治療尼古丁成癮時(shí)，雖然可以阻止尼古丁的自我給藥，但是由于對nAChR亞型缺乏選擇性，并且有抗膽堿能的副作用，其臨床應(yīng)用受到限制[12].(4)nAChR別構(gòu)調(diào)節(jié)劑如Galanthamine.它可以減少尼古丁的自我給藥行為和促進(jìn)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，但是由于缺乏nAChR亞型選擇性，其臨床應(yīng)用受到限制[13].因此，靶向nAChR戒煙藥物的研究仍存在一定的問題，如戒煙成功率較低、復(fù)吸率高等.所以，開發(fā)安全有效的靶向nAChR的戒煙藥物具有重大的現(xiàn)實(shí)意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 靶向α4β2 nAChR的戒煙藥物的合成

1.1.1 試劑及儀器

樣品的分析數(shù)據(jù)由以下儀器測定：MS (ESI)：Shimatzu LCMS-2010；熔點(diǎn)：Büchi B-540型熔點(diǎn)儀(溫度計(jì)未經(jīng)校正)；1H NMR和13C NMR：Bruker核磁共振儀(400 Hz, 100 MHz).

1.1.2 合成路線[14]

如式1所示.

式1 ?；h(huán)胍化合物的合成

1.1.3 合成方法

以MBHA樹脂為載體，在DIC/HOBt作用下與L-Boc氨基酸縮合，在三氟醋酸作用下脫Boc并堿化后得到化合物2，接著再與羧酸在DIC/HOBt作用下縮合生成化合物3，然后在BH3-THF作用下還原并用哌啶處理得到化合物4，再通過與CNBr的環(huán)合得到化合物5。接下來將上述反應(yīng)得到的化合物5在HUBU和DIEA的作用下與R3COOH室溫反應(yīng)26 h得到樹脂負(fù)載的化合物6，然后通過在0 ℃HF作用下進(jìn)行切割，將目標(biāo)分子7從固相載體上游離出來.

1.1.4 合成的目標(biāo)化合物

利用不同的R1，R2和R3進(jìn)行組合共合成了14個(gè)目標(biāo)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如表1所示.

表1 所合成的目標(biāo)化合物

1.1.5 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征

2-(3,4-Dichlorophenyl)-N-(1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)acetamide(1)：白色固體，收率35%.1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ 8.49-8.47(m,2H),8.43(s,1H), 7.49(dt, J=7.6, 2.0 Hz,1H),7.45(d, J=2.0 Hz,1H),7.23(dd,J=7.6,4.8 Hz,1H),7.14(dd,J=8.4,2.0 Hz,1H),3.62-3.57(m,6H),3.42-3.37(m,2H), 2.86(t, J=7.2 Hz,2H);13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 183.16,163.13,150.01,148.06,138.08,136.44,134.19,132.00,131.69,130.20,130.05,129.21,123.68,46.87,45.25,45.18,40.91,31.15; MS(ESI)m/z[M+H]+:377.(S)-2-(3,4-Dichlorophenyl)-N-(5-methyl-1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)acetamide(2)：白色固體，收率38%.1H NMR(400 MHz,DMSO):δ 8.47-8.46(m,2H),8.41(s,1H),7.48(dt,J=7.6,1.6 Hz,1H),7.45(d,J=2.0 Hz,1H),7.20(dd,J=7.2,4.8 Hz,1H),7.15(dd,J=8.4,1.6 Hz,1H),3.90-3.85(m,2H),3.70(t,J=8.8 Hz,1H),3.62(s,2H),3.47-3.42(m,1H),3.25(q,J=7.2 Hz,1H),2.97-2.89(m,2H),1.29(d,J=6.0 Hz,3H);13C NMR(100 MHz,DMSO) δ 183.20,164.17,150.03,149.04,140.23,138.64,136.29,133.15,132.33,131.41,130.88,129.94,125.66,56.00,47.61,45.42,42.91,31.69,16.95.MS(ESI) m/z [M+H]+:391.

(R)-2-(3,4-Dichlorophenyl)-N-(5-methyl-1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)acetamide(3)：白色固體，收率35%.1H NMR(400 MHz,DMSO):δ 8.49-8.46(m,2H),8.41(s,1H),7.50(dt,J=7.6,1.6 Hz,1H),7.48-7.46(m,1H),7.23(dd,J=7.2,4.8 Hz,1H),7.17(dd,J=8.8,1.6 Hz,1H),3.91-3.85(m,2H),3.71(t,J=8.8 Hz,1H),3.63(s,2H),3.46-3.42(m,1H),3.24(q,J=7.2 Hz,1H),2.95-2.88(m,2H),1.30(d,J=6.0 Hz,3H);13C NMR(100 MHz,DMSO) δ183.21,164.20,150.00,149.07,140.26,138.62,136.33,133.16,132.35,131.41,130.89,129.91,125.68,56.01,47.61,45.43,42.92,31.70,16.93.MS(ESI) m/z [M+H]+:391.(S)-N-(5-Benzyl-1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)-2-(3,4-dichlorophenyl)acetamide(4)：淡黃色固體，收率32%.1H NMR(400 MHz,DMSO):δ 8.49(s,1H),8.42(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.60(d, J=8.0 Hz,1H),7.36-7.30(m,2H),7.34-7.31(m,2H),7.30-7.21(m,3H),7.11-7.09(m,2H),3.89-3.85(m,2H),3.49(t,J=9.2 Hz,1H),3.34-3.28(m,2H),3.01(d J=5.6 Hz,1H),2.97-2.90(m,2H),2.88-2.85(m,2H),2.69(q,J=8.0 Hz,1H);13C NMR(100 MHz,DMSO)δ 182.01,163.18,150.00,148.50,139.36,137.09,136.53,135.21,133.25,130.88,130.41,129.22,129.00,127.48,125.46,123.71,122.69,60.35,50.66,46.21,43.72,39.53,31.04; MS(ESI) m/z [M+H]+:467.

(R)-N-(5-Benzyl-1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)-2-(3,4-dichlorophenyl)acetamide(5)：淡黃色固體，收率36%.1H NMR(400 MHz,DMSO):δ 8.50(s,1H),8.43(d,J=8.0 Hz,1H),7.61(d,J=8.0 Hz,1H),7.38-7.31(m,2H),7.30-7.27(m,2H),7.30-7.28(m,2H),7.25-7.20(m,1H),7.13-7.08(m,2H),3.89-3.84(m,2H),3.50(t,J=9.2 Hz,1H),3.34-3.28(m,2H),3.00(d J=5.6 Hz,1H),2.96-2.90(m,2H),2.88-2.85(m,2H),2.70(q,J=8.0 Hz,1H);13C NMR(100 MHz,DMSO)δ 182.03,163.19,150.03,148.48,139.39,137.05,136.50,135.24,133.22,130.85,130.45,129.28,129.06,127.42,125.45,123.71.,122.67,60.34,50.66,46.20,43.71,39.53,31.03; MS(ESI) m/z [M+H]+:467.

(S)-2-(3,4-Dichlorophenyl)-N-(5-(naphthalen-2-ylmethyl)-1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)acetamide(6)：白色固體，收率36%.1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ 8.48-8.38(m,1H),7.94-7.92(m,1H),7.90-7.87(m,1H),7.84-7.79(m,2H),7.58-7.53(m,2H),7.52-7.48(m,1H),7.44-7.40(m,2H),7.39-7.35(m,2H),7.30(t,J=6.8 Hz,1H),7.22-7.18(m,1H),7.16-7.13(m,1H),4.45-4.38(m,1H),4.02-3.90(m,1H),3.72(t,J=10.0 Hz,1H),3.61-3.60(m,2H),3.55-3.51(m,1H),3.39-3.34(m,2H),3.32-3.23(m,1H),3.01-2.76(m,2H); MS(ESI) m/z [M+H]+:517.

(S)-2-(3,4-Dichlorophenyl)-N-(5-methyl-1-(pyridin-3-ylmethyl)imidazolidin-2-ylidene)acetamide(7)：白色固體，收率39%.1H NMR(400 MHz,DMSO):δ 8.47-8.46(m,2H),8.41(s,1H),7.48(dt,J=7.6,1.6 Hz,1H),7.45(d,J=2.0 Hz,1H),7.20(dd,J=7.2,4.8 Hz,1H),7.15(dd,J=8.4,1.6 Hz,1H),3.90-3.85(m,2H),3.70(t,J=8.8 Hz,1H),3.62(s,2H),3.47-3.42(m,1H),3.25(q,J=7.2 Hz,1H),2.97-2.89(m,2H),1.29(d,J=6.0 Hz,3H);13C NMR(100 MHz,DMSO) δ 182.16,165.27,152.09,150.14,147.45,138.55,136.08,134.11,132.76,131.54,130.24,129.75,124.89,57.59,46.88,44.75,33.52,17.02.MS(ESI) m/z [M+H]+:377.

(S)-2-(3,4-Dichlorophenyl)-N-(5-methyl-1-phenethylimidazolidin-2-ylidene)acetamide(8)：白色固體，收率31%.1H NMR(400 MHz,DMSO):δ 8.48-8.43(m,2H),8.45(s,1H),7.52-7.46(m,3H),7.25(d,J=7.6 Hz,1H),7.20(d,J=8.8 1H),3.95-3.88(m,2H),3.69(t,J=8.0 Hz,1H),3.65(s,2H),3.47-3.42(m,1H),3.26(q,J=7.2 Hz,1H),2.95-2.87(m,2H),1.29(d,J=6.0 Hz,3H);13C NMR(100 MHz,DMSO) δ 182.17,165.70,150.04,149.21,144.16,138.55,136.25,133.16,132.35,131.00,129.68,126.34,56.54,46.61,44.63,32.08,16.95.MS(ESI) m/z [M+H]+:390.

(S)-2-(3,4-Dichlorophenyl)-N-(1-(3-fluorophenethyl)-5-methylimidazolidin-2-ylidene)acetamide(9)：黃色固體，收率29%.1H NMR(400 MHz,DMSO):δ 8.54(s,1H),8.45(s,1H),7.50(d,J=8.0 Hz,1H),7.48-7.45(m,2H),7.25(d,J=7.2 Hz,1H),7.13(dd,J=8.8,1.6 Hz,1H),4.01-3.97(m,2H),3.79(t,J=8.0 Hz,1H),3.70(s,2H),3.50-3.43(m,1H),3.30(q,J=7.2 Hz,1H),2.99-2.92(m,2H),1.35(d,J=6.0 Hz,3H);13C NMR(100 MHz,DMSO) δ 184.22,165.20(J=242.1 Hz),158.11,145.37,142.53,141.23(J=7.4 Hz),138.02,135.22,133.18,132.01,131.77(J=8.3 Hz),130.78(J=2.7 Hz),129.69(J=21.2 Hz),126.61(J=20.8 Hz),59.89,50.53,49.48,43.15,31.79,16.98.MS(ESI)m/z[M+H]+:408.

N-(1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)nicotinamide(10)：白色固體，收率36%.1H NMR(400 MHz,D2O):δ 8.90(s,1H),8.66(d,J=4.4 Hz,1H),8.50-8.48(m,1H),8.24-8.21(m,2H),7.83(d,J=8.0 Hz,1H),7.52(dd,J=8.0,5.2 Hz,1H),7.31-7.28(m,1H),3.84-3.81(m,2H),3.78-3.76(m,2H),3.03(t,J=5.6 Hz,2H),2.27-2.26(m,2H);13C NMR(100 MHz,D2O) δ 175.00,163.03,150.99,149.02,148.85,146.48,138.19,137.41,135.13,134.02,125.25,123.85,44.81,44.47,40.77,30.02; MS(ESI)m/z[M+H]+:296.

4-Tert-butyl-N-(1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)cyclohexane carboxamide(11)：白色固體，收率32%.1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ 8.46(d,J=5.6,2.0 Hz,1H),8.44(s,1H),8.40(dd,J=4.8,1.6 Hz,1H),7.67(dt,J=7.6,1.6 Hz,1H),7.29(ddd,J=7.6,4.8,0.8 Hz,1H),3.55(t,J=7.2 Hz,2H),3.44-3.41(m,2H),3.39-3.37(m,2H),2.84(t,J=7.2 Hz,2H),1.98-1.91(m,1H),1.86(dd,J=12.8,1.6 Hz,2H),1.75-1.73(m,2H),1.26-1.18(m,2H),0.98-0.93(m,3H),0.83(s,9H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6) δ 186.69,162.27,149.82,147.40,136.11,134.60,123.29,48.16,47.29,44.22,44.11,40.54,32.12,30.14,29.99,27.39,26.49; MS(ESI)m/z[M+H]+:357.

2-Phenyl-N-(1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)acetamide(12)：白色固體，收率41%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ 8.44(d,J=1.6 Hz,1H),8.41(dd,J=4.8,1.6 Hz,1H),8.36(s,1H),7.62-7.59(m,1H),7.30-7.27(m,1H),7.26-7.24(m,3H),7.20-7.15(m,1H),3.52(t,J=7.2 Hz,2H),3.43(s,2H),3.40(dd,J=9.2,1.6 Hz,2H),3.38-3.35(m,2H),2.80(t,J=7.2 Hz,2H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6) δ 181.61,162.04,149.84,147.44,137.86,136.10,134.47,129.25,127.79,125.72,123.33,47.41,44.27,44.14,40.59,29.93; MS(ESI)m/z[M+H]+:309.

2-(Pyridin-3-yl)-N-(1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)acetamide(13)：白色固體，收率33%.1H NMR(400 MHz,D2O):δ 8.52-8.45(m,4H),7.89(d,J=8.0 Hz,1H),7.85(d,J=8.0 Hz,1H),7.55-7.52(m,1H),7.48(dd,J=7.6,5.2 Hz,1H),3.73-3.71(m,1H),3.70-3.69(m,1H),3.68-3.67(m,1H),3.63(s,2H),3.62(t,J=1.2 Hz,1H),3.61-3.57(m,2H),2.85(t,J=7.2 Hz,2H);13C NMR(100 MHz,D2O) δ 179.25,158.55,148.59,147.79,146.95,145.33,139.68,138.28,134.60,134.32,124.59,124.46,47.56,45.04,41.38,40.53,29.63; MS(ESI)m/z[M+H]+:310.

(S)-4-tert-butyl-N-(5-(naphthalen-1-ylmethyl)-1-(2-(pyridin-3-yl)ethyl)imidazolidin-2-ylidene)cyclohexanecarboxamide(14)：白色固體，收率42%.1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ 8.60(s,1H),8.47(dd,J=4.8,1.6 Hz,1H),8.44(d,J=1.6 Hz,1H),7.90-7.88(m,1H),7.85(d,J=8.4 Hz,1H),7.80(d,J=8.4 Hz,1H),7.59-7.49(m,3H),7.43-7.39(m,1H),7.31-7.27(m,1H),7.23-7.19(m,1H),4.06-3.92(m,2H),3.57(dd,J=13.6,4.8 Hz,1H),3.39-3.28(m,3H),3.02-2.95(m,2H),2.94-2.85(m,1H),2.24-2.16(m,2H),2.07-2.03(m,2H),1.85(d,J=9.6 Hz,2H),1.69-1.61(m,2H),1.48-1.39(m,2H),1.06-1.01(m,9H);13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 190.39,163.02,150.33,148.18,136.47,134.54,134.16,132.41,131.87,129.35,128.17,127.65,126.71,126.13,125.66,123.57,122.93,56.39,49.25,47.90,46.54,43.71,35.86,32.62,31.70,30.93,27.74,27.09;MS(ESI)m/z[M+H]+:497.

1.2 靶向α4β2 nAChR的戒煙藥物的生物活性評價(jià)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

[3H]-地棘蛙素(Perkin Elmer)，未標(biāo)記的地棘蛙素(Sigma Aldrich).KXα3β4R2和KXα4β2R2細(xì)胞(Georgetown University)，Heck細(xì)胞(Torrey Pines分子研究所)， 雄性SpragueDawley大鼠(Charles River (Portage, MI)).

1.2.2 體外結(jié)合測試評價(jià)

(1)實(shí)驗(yàn)方法[15]

將小鼠的KXα3β4R2和KXα4β2R2細(xì)胞，在達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，加入10%的胎牛血清(FBS)，0.5%的青霉素/鏈霉素和0.4 mg/ml遺傳霉素(G418)，在7.5%的CO2和37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞在150 mm培養(yǎng)皿上傳代并在融合后收獲.然后將收獲的KXα3β4R2和KXα4β2R2細(xì)胞懸浮于Tris緩沖液(50 mM pH=7.4)中，使用勻漿器進(jìn)行勻漿，并在13 500 rpm下離心10分鐘，重復(fù)2次.在結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞膜、待測物質(zhì)(10-5-10-10nM)以及0.30 nM的[3H]-地棘蛙素在室溫下孵育2小時(shí).然后使用Tomtec細(xì)胞收獲儀過濾樣品.非特異性結(jié)合通過使用0.1 μM未標(biāo)記的地棘蛙素來測試.nAChR結(jié)合實(shí)驗(yàn)是用來測定非標(biāo)記的化合物(受試化合物)與放射性配體競爭性的結(jié)合同一受體的能力，常用Ki和IC50來表示親和力的大小，其中Ki是受試化合物與受體結(jié)合的解離常數(shù)，IC50是抑制50%時(shí)受試化合物的濃度.Ki值可以根據(jù)質(zhì)量作用定律Ki=IC50/(1+L/Kd)來計(jì)算，該公式中，L是放射性配體的濃度，Kd是放射性配體的結(jié)合能力.

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果(如表2所示)：(1)R1是H或甲基對活性和選擇性都有利(化合物1,2和3)，但對活性影響較為顯著，隨著R1的增大，選擇性和活性都降低(化合物4,5和6).因此，R1對該類化合物的活性影響仍較為明顯，R1為小的取代基時(shí)可以增加生物活性，但是R1為大的取代基時(shí)生物活性和選擇性都降低；(2)R2處引入苯甲基或者3-氟苯甲基時(shí)表現(xiàn)出中等程度的活性，但是選擇性相對較差(化合物8和9).當(dāng)R2為3-吡啶甲基活性最好，R2為3-吡啶基活性最差，兩者選擇性都不好(化合物2和7)，原因可能是3-吡啶基的引入縮短了環(huán)胍核和吡啶基之間的碳鏈長度，使得配體與nAChR的作用減弱.(3)R3為3,4-二氯苯乙?；?-吡啶乙酰基時(shí)，活性和選擇性都較好(化合物1和13)，R3為3-吡啶甲?；?化合物10)、4-叔丁基環(huán)己基甲?；?化合物11和14)和3-苯乙酰基(化合物12)活性顯著降低，因此，R3對活性和選擇性的影響也較為明顯.(4)R1手性碳的構(gòu)型對活性影響不很明顯，化合物2和3的活性，S構(gòu)型優(yōu)于R構(gòu)型.但是化合物4和5的活性，卻是兩者相當(dāng)或R構(gòu)型優(yōu)于S構(gòu)型.

表2 ?；h(huán)胍化合物對α3β4和α4β2 nAChR的結(jié)合活性a

1.2.3 功能響應(yīng)測試評價(jià)

(1)實(shí)驗(yàn)方法[15]

通過測量nAChR誘導(dǎo)的膜電勢的變化進(jìn)行了nAChR功能測試，膜電勢可以通過使用電位分析試劑盒借助Flexstation 3讀板器進(jìn)行讀數(shù).α3β4或者α4β2 nAChR轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞系在實(shí)驗(yàn)前一天種植到96孔板(密度為4 000每孔).對于激動劑測試，經(jīng)過簡單沖洗后，使用225 μl HBSS(含有藍(lán)色顏料)測試緩沖液(pH=7.4)對細(xì)胞進(jìn)行負(fù)載，然后將細(xì)胞在37 ℃孵育.在室溫平衡30分鐘后，然后通過FlexStation在96孔板的每孔中分別加入25 μl的相應(yīng)的化合物，nAChR刺激誘導(dǎo)的膜電勢變化(每3秒記錄一次，共120秒)通過讀取在530 nm波長處激發(fā)的565 nm的熒光進(jìn)行記錄.對于拮抗劑測試，細(xì)胞被200 μl HBSS緩沖液(含有藍(lán)色顏料)負(fù)載后，在37 ℃孵育.20分鐘后，加入25 μl待測化合物，再過10分鐘后，通過FlexStateion加入25 μl地棘蛙素(或者尼古丁)，直到最終濃度是100 nM，熒光的測試如上所述.熒光的變化代表每孔最大響應(yīng)與最小響應(yīng)的差值，使用Graphpad PRISM來測定EC50值.

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取了化合物1和13，利用α4β2 nAChR轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞株Heck細(xì)胞進(jìn)行功能響應(yīng)測試(如表3所示).結(jié)果表明二者都不活化α4β2 nAChR，但都阻止地棘蛙素誘導(dǎo)的膜電勢的增加，因此它們是拮抗劑.另外，利用α3β4 nAChR轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞株Heck細(xì)胞對化合物13也進(jìn)行了功能測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它也不活化α3β4 nAChR，它可以阻止地棘蛙素誘導(dǎo)的膜電勢的變化， EC50值為8 325 nM. 因此， 化合物13在nAChR功能測試時(shí)，亞型選擇性非常好.

表3 部分胍化合物對α4β2 nAChR的拮抗活性a

為了確定化合物是否為純拮抗劑以及拮抗機(jī)制是否為競爭性的，我們選取了拮抗活性最好的化合物13，并且利用α4β2 nAChR轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞測量了各種濃度下的化合物13誘導(dǎo)的膜電勢的變化(圖1)，以及各種濃度下的化合物13對尼古丁 的計(jì)量響應(yīng)(圖2)，結(jié)果表明化合物13是純拮抗劑，因?yàn)樗跐舛雀哌_(dá)10 μM都沒表現(xiàn)出激動劑活性(圖1).當(dāng)用化合物13進(jìn)行預(yù)處理，尼古丁誘導(dǎo)的膜電勢的增加被各種濃度的化合物13所阻斷，并且化合物13的濃度越高，尼古丁誘導(dǎo)的膜電勢的增加被化合物13阻斷得越嚴(yán)重，在很大程度上降低了尼古丁的最大活性.該結(jié)果表明，化合物13非競爭性的抑制了尼古丁的活性.

圖1 化合物13的拮抗活性

圖2 不同濃度下的化合物13對尼古丁的劑量響應(yīng)

1.2.4 條件性位置偏愛/厭惡實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)方法[15]

小鼠(n=7)在FR-1強(qiáng)化計(jì)劃下接受尼古丁自我給藥訓(xùn)練，每天6次，每次2小時(shí)，固定比例3(FR-3)，再給藥9次.每按三次主動杠桿，就會產(chǎn)生一次尼古丁劑量(0.03 mg/kg/0.1 ml輸注).每次尼古丁輸注后，都會出現(xiàn)20秒的暫停(TO)，在此期間，活性杠桿的反應(yīng)不會導(dǎo)致程序性后果.這一時(shí)間段與位于激活杠桿上方的提示燈的照明同時(shí)進(jìn)行，以發(fā)送正強(qiáng)化信號.此外，在2小時(shí)的尼古丁治療過程中，間歇性的音調(diào)(7千赫，70分貝)也會響起.對小鼠進(jìn)行自我尼古丁給藥訓(xùn)練，直到建立穩(wěn)定的強(qiáng)化基線.在受試者設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的拉丁方被用于藥物治療.實(shí)驗(yàn)開始前10分鐘， 給小鼠皮下注射藥物(0.0、 0.3和1.0 mg/kg).這些動物在藥物實(shí)驗(yàn)日之間至少每隔48小時(shí)接受平衡順序的所有治療.

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選擇化合物13，通過條件位置偏愛實(shí)驗(yàn)對它阻止尼古丁自我給藥的能力進(jìn)行了測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物13可以阻止尼古丁自我給藥(圖3).

圖3 化合物13在FR-3強(qiáng)化程序下對尼古丁自我給藥的影響

2 結(jié)論

我們合成了14個(gè)?；医Y(jié)構(gòu)的化合物，所有化合物結(jié)構(gòu)均經(jīng)1HNMR，13CNMR和LC-MS進(jìn)行表征.選取KXα3β4R2和KXα4β2R2細(xì)胞系對得到的14個(gè)化合物進(jìn)行nAChR的結(jié)合活性測試，并對構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行分析和討論.對于活性最好的化合物13，通過測量nAChR誘導(dǎo)的膜電勢的變化進(jìn)行功能測試，證實(shí)了該系列化合物為α4β2 nAChR拮抗劑，并且還對化合物13進(jìn)行了條件性位置偏愛研究，發(fā)現(xiàn)它可以阻止尼古丁自我給藥，因此，化合物13有可能成為潛在的戒煙藥物.