下調(diào)CDKL1基因表達(dá)水平對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

陳曉燕，羅金鍵，汪秀梅，許亞坡，張茂華，王瑩瑩

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 消化科，河南 鄭州 450002)

食管癌占所有癌癥的1%，是全球第8種常見(jiàn)的癌癥類型，在癌癥相關(guān)死亡人數(shù)中居第6位[1]。每年約有508 585例食管癌患者死亡，占所有癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的6.6%[2]。所有診斷出的食管癌病例中有50%以上發(fā)生在亞洲國(guó)家，食管癌患者5 a生存率很低[3-4]。局部晚期食管癌患者的5 a生存率為20%[5]。食管癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方式主要包括手術(shù)治療、放療和化療。近年來(lái)有關(guān)食管癌的診斷及治療方面取得了重大進(jìn)展，但是由于腫瘤生長(zhǎng)迅速，轉(zhuǎn)移率高，食管癌患者的預(yù)后仍然很差。腫瘤分子靶向治療是新興的癌癥治療方法。鑒定分子標(biāo)志物可能為食管癌的診斷、治療提供關(guān)鍵的線索。細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白樣激酶1(cyclin dependent kinase like 1，CDKL1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白2(cell division control protein 2，CDC2)相關(guān)蛋白激酶家族[6-7]。CDKL包括5個(gè)成員，根據(jù)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)與CDKL1的結(jié)構(gòu)關(guān)系，鑒定了CDKL1～CDKL5[8]。CDKL1基因與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是胃癌[8]、乳腺癌[9]和結(jié)直腸癌[10]增殖和侵襲的重要調(diào)控因子。本研究探討CDKL1基因在食管癌患者中的表達(dá)情況，與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，以期為尋找最佳的臨床診療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院2017年6月至2019年6月經(jīng)病理確診的50例食管癌患者的臨床資料。所有標(biāo)本均在手術(shù)進(jìn)行中收集?；颊呒凹覍俸炇鹬橥鈺?shū)。人食管癌細(xì)胞系(TE1，TE7，EC1，EC109)和人正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RNAiso plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；倒置顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Leika公司；CDKL1的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和對(duì)照組的siRNA均購(gòu)自吉瑪公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液中(體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素和100 U·mL-1的鏈霉素)培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系，將培養(yǎng)液置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d更換1次培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(1)使用Trizol試劑從組織或細(xì)胞中提取RNA，采用Nanodrop核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度及純度。(2)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將得到的cDNA凍存于-20 ℃待用。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)：以第(2)步提取的cDNA作為模板，應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行PCR。應(yīng)用Agilent Mx3005P儀器行定量檢測(cè)和溶解曲線的分析，每個(gè)樣本反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并計(jì)算均值。內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列為5’-CACCCTGTTGCTG-TAGCCAAA-3’。CDKL1上游引物序列為5’-CGAATGCTCAAGCAACTCAAGC-3’，下游引物序列為5’-GCCAAGTTATGCTCTTCACGAG-3’。

1.4 siRNA的轉(zhuǎn)染根據(jù)CDKL1基因序列分別設(shè)計(jì)靶序列為5’-CTACTGTGATACCAAGAAA-3’的siRNA，即為si-CDKL1組，轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列組(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)為對(duì)照組。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液(opti-MEM培養(yǎng)液+ Lipofectamine 3000+siRNA)加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中，使其混合均勻。于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫育48 h后，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107L-1，在96孔板每孔中加入100 μL的細(xì)胞懸液，分別在0、1、2、3 d測(cè)定細(xì)胞在450 nm處的吸光度(optical density，OD)。測(cè)定前需要避光加入CCK-8混勻，每孔10 μL，培養(yǎng)箱中靜置孵育1 h。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞克隆形成能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的培養(yǎng)液中，將細(xì)胞懸液進(jìn)行倍數(shù)稀釋，按照每孔50個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，補(bǔ)加培養(yǎng)液至4 mL，靜置培養(yǎng)。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，使用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.7 transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力分別用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，每毫升約2×105個(gè)。將各處理組細(xì)胞用胰酶消化并接種于鋪有25 μL Matrigel膠的小室中。上室加200 μL細(xì)胞懸液，下室加600 μL含10%(體積分?jǐn)?shù))血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在熒光顯微鏡下觀察并記錄。于每孔中隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)并求其平均值。

1.8 免疫組化染色根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度(陰性為 0分，弱為1分，中等為2分，高為3分)和染色成陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞密度(0為0分，1%～40%為1分，41%～75%為2分，>75%為3分)評(píng)估染色情況。將強(qiáng)度得分和密度得分相乘，得到每個(gè)樣本的最終免疫反應(yīng)性得分。

2 結(jié)果

2.1CDKL1mRNA在食管癌癌組織及與其毗鄰的癌旁組織中的表達(dá)情況CDKL1mRNA在食管癌癌組織中的表達(dá)水平(1.805±0.157)較癌旁組織中的表達(dá)水平(1.111±0.095)高(t=3.774，P<0.001)。

2.2 CDKL1蛋白在食管癌組織及與其毗鄰的癌旁組織中的表達(dá)情況在食管癌癌旁組織中，CDKL1陰性表達(dá)35例，弱陽(yáng)性表達(dá)15例；在癌組織中，CDKL1陰性表達(dá)10例，弱陽(yáng)性表達(dá)25例，陽(yáng)性表達(dá)15例 。見(jiàn)圖1。

A為癌旁組織CDKL1陰性表達(dá)；B為癌旁組織CDKL1弱陽(yáng)性表達(dá)；C為癌組織CDKL1陰性表達(dá)；D為癌組織CDKL1弱陽(yáng)性表達(dá)；E為癌組織CDKL1陽(yáng)性表達(dá)。

2.3 CDKL1蛋白在食管癌組織及與其毗鄰的癌旁組織中表達(dá)水平的免疫組化評(píng)分CDKL1蛋白在癌旁組織和癌組織中的免疫組化評(píng)分分別為0.880±0.145、2.360±0.191。CDKL1蛋白在食管癌組織中的免疫組化評(píng)分高于癌旁組織(t=6.174，P<0.001)。

2.4CDKL1mRNA與食管癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期食管癌患者的CDKL1mRNA表達(dá)率高于腫瘤分期0～Ⅱ期者(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者的CDKL1mRNA表達(dá)率高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。CDKL1mRNA表達(dá)水平與食管癌患者的性別、年齡、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。CDKL1mRNA在癌旁組織中低表達(dá)36例，高表達(dá)14例；CDKL1mRNA在食管癌細(xì)胞系中低表達(dá)14例，高表達(dá)36例。CDKL1mRNA在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)率[72.0%(36/50)]高于癌旁組織[28.0%(14/50)](χ2=19.360，P<0.05)。

2.5CDKL1mRNA在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況CDKL1mRNA在食管癌細(xì)胞系TE1、TE7、EC1和EC109的表達(dá)水平分別為2.268±0.139、0.602±0.008、1.014±0.068、1.352±0.171，CDKL1mRNA在食管正常上皮細(xì)胞系Het-1A中的表達(dá)水平為0.327±0.023。CDKL1mRNA在食管癌細(xì)胞系TE1、TE7、EC1和EC109的表達(dá)水平均高于在食管正常上皮細(xì)胞系Het-1A中的表達(dá)水平(t=13.770、11.200、9.574、5.943，P=0.005、0.008、0.011、0.027)。

表1 CDKL1 mRNA與食管癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(n)

2.6 siRNA技術(shù)對(duì)食管癌細(xì)胞系中CDKL1mRNA表達(dá)水平的影響以上結(jié)果表明CDKL1mRNA在細(xì)胞系TE1中表達(dá)水平最高，故選擇TE1來(lái)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組比較，siRNA技術(shù)能夠下調(diào)TE1細(xì)胞上CDKL1mRNA的表達(dá)水平(t=10.250，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

aP<0.05。

2.7 下調(diào)CDKL1mRNA對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響si-CDKL1組食管癌細(xì)胞增殖能力弱于對(duì)照組(P<0.05)。食管癌細(xì)胞增殖能力情況見(jiàn)表2和表3。

表2 第1次采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞增殖能力情況

表3 第2次采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞增殖能力情況

2.8 下調(diào)CDKL1對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成能力的影響鏡下結(jié)果顯示，si-CDKL1組食管癌細(xì)胞克隆形成能力弱于對(duì)照組。見(jiàn)圖3。

A為對(duì)照組食管癌細(xì)胞克隆形成情況；B為si-CDKL1組食管癌細(xì)胞克隆形成情況。

2.9 下調(diào)CDKL1對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成數(shù)量的影響si-CDKL1組食管癌細(xì)胞克隆形成的數(shù)量少于對(duì)照組(t=14.140，P=0.005)。見(jiàn)圖4。對(duì)照組兩次的細(xì)胞克隆形成數(shù)量分別為80、85；si-CDKL1組兩次的細(xì)胞克隆形成數(shù)量分別為35、30。

aP<0.05。

2.10 下調(diào)CDKL1對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響鏡下觀察24 h侵襲結(jié)果顯示，si-CDKL1組食管癌細(xì)胞侵襲能力弱于對(duì)照組。見(jiàn)圖5。

A代表對(duì)照組情況；B代表si-CDKL1組情況。

2.11 下調(diào)CDKL1對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲數(shù)量的影響si-CDKL1組食管癌細(xì)胞侵襲數(shù)量少于對(duì)照組(t=11.310，P=0.008)。見(jiàn)圖6。對(duì)照組兩次的細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為60、55；si-CDKL1組兩次的細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為15、20。

aP<0.05。

3 討論

食管癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，在世界范圍內(nèi)居男性和女性癌癥相關(guān)死亡原因的第5位和第8位，由于確診晚、生長(zhǎng)迅速和轉(zhuǎn)移，其5 a生存率僅為26.2%[11]。食管癌在全球范圍內(nèi)是癌癥相關(guān)死亡的第六大原因，食管鱗癌是世界范圍內(nèi)的主要病理亞型[12-13]。盡管近年來(lái)針對(duì)食管癌的診斷技術(shù)及治療方法不斷改善，但是早期浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)導(dǎo)致食管癌患者的總體生存率仍不理想。

食管癌發(fā)病機(jī)理涉及多種因素，闡明食管癌發(fā)生、進(jìn)展的機(jī)理能夠?yàn)橹委熖峁┡R床依據(jù)。CDKs與特定的細(xì)胞周期蛋白形成活性復(fù)合物，從而控制參與細(xì)胞周期的下游基因的表達(dá)[14]。CDK1又稱CDC2，是參與上述過(guò)程的其中一個(gè)關(guān)鍵分子。CDKL1是CDK1相關(guān)的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族的成員[15]，以對(duì)應(yīng)于CDK1(CDC2)的PSTAIRE基序的氨基酸序列命名[16-17]。

CDKL1基因在多種癌癥中的表達(dá)水平升高，如胃癌[8]、乳腺癌[9]、結(jié)直腸癌[10]、黑色素瘤[6]等，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力密切相關(guān)[18]。Sun等[8]通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)相較于胃癌癌旁組織，CDKL1在胃癌癌組織的陽(yáng)性率較高，MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)表明CDKL1可以加強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力，CDKL1表達(dá)下調(diào)后腫瘤細(xì)胞凋亡增加。Qin等[10]通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)，CDKL1蛋白在結(jié)直腸癌癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)以及小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明CDKL1能夠提升結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，但是凋亡實(shí)驗(yàn)表明CDKL1表達(dá)水平的高低不影響腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

在本研究中，CDKL1基因在食管癌癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這表明CDKL1基因在食管癌患者中是一種促癌基因。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成能力實(shí)驗(yàn)證明，CDKL1基因的表達(dá)會(huì)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。transwell實(shí)驗(yàn)證明CDKL1基因表達(dá)可提高食管癌細(xì)胞的侵襲能力。CDKL1在食管癌中是促癌基因，可能與食管癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，可作為評(píng)估食管癌患者不良預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，CDKL1基因能夠促進(jìn)食管癌的進(jìn)展，在食管癌的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，可能作為治療食管癌患者的一種潛在的分子靶點(diǎn)，為研究食管癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制以及進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療奠定了一定的基礎(chǔ)。