胃癌患者術(shù)后血清中TGFBI與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其機制

肖萍，宋振宇，姚倩

胃癌是臨床上常見的一種惡性腫瘤，具有病死率高和術(shù)后易復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的特點[1]。目前，胃癌的臨床治療多以手術(shù)為主，也有利用替吉奧單藥或與奧沙利鉑聯(lián)合等進行化療的治療方式，其中有效的預(yù)后與分析手段對防止其術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[2]。研究表明，影響胃癌術(shù)后預(yù)后的影響因素較多，主要包括pTNM分期、腫瘤大小及圍手術(shù)期化療等，其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移也涉及多種轉(zhuǎn)錄因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(TGFBI)、COL1A1和TAGLN2等，這些都為其預(yù)后及相關(guān)治療增加了難度[3-4]。

TGFBI是一種由TGF-β1誘導合成的胞外基質(zhì)蛋白，可參與細胞之間以及細胞與基質(zhì)之間的黏附[5]。已有研究證明，在人肝癌、大腸癌細胞中上調(diào)TGFBI的表達能夠顯著提高癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力[6-7]。上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是腫瘤細胞在進展過程中的典型特征，其主要標志是E-cadherin的下調(diào)或缺失[8]。研究表明，一些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2和E12/E47等均表現(xiàn)出對E-cadherin具有轉(zhuǎn)錄抑制的作用，進而使腫瘤細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變[9-10]。目前，關(guān)于TGFBI在卵巢癌[11]、乳腺癌[12]及膀胱癌[13]等細胞進展過程中的功能作用已有較多的研究報道，而其與胃癌細胞術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系及作用機制尚不清晰。

本研究考察了TGFBI在胃癌細胞血清樣本中的表達水平，并利用shRNA結(jié)合慢病毒技術(shù)穩(wěn)定敲低技術(shù)對其表達進行下調(diào)，通過胃癌細胞增殖、侵襲與遷移能力的變化以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達水平的改變，探究TGFBI與胃癌細胞術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系及可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司；Transwell小室購自美國Coming公司；胃癌細胞系SGC-7901購自上海中科院細胞庫；一抗TGFBI、GAPDH和二抗購自Proteintech公司；一抗E-cadherin、Snail和ZEB1購自Cell Signaling Technology公司；人 TGFbI ELISA 試劑盒購自Biorbyt公司。

1.1.2 病例資料 將 2014年6月至2019年12月在四川省涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院進行手術(shù)切除后復(fù)發(fā)的胃癌患者血液標本86例。其中，男50例，女36例；患者年齡27～70歲，平均年齡(46.8±2.5)歲。根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測血液中的TGFBI含量(ng/mL)值，并根據(jù)86例標本所測得的TGFBI含量值大小進行排序，將86例患者分為高TGFBI組(n=43)和低TGFBI組(n=43)。所有患者已知情同意，已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。此外收集20例未觀察到任何疾病的正常健康人(25～35歲)的血液標本作為對照。納入標準：①診斷明確；②患者對本研究知情同意。排除標準： ①心、腦、肝、腎等臟器損害；②凝血障礙；③合并其他惡性腫瘤；④重度感染。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 胃癌SGC-7901細胞的常規(guī)培養(yǎng)使用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的孵育箱中孵育，每1～2天換液一次，3～4天用1%胰酶常規(guī)消化傳代培養(yǎng)備用。

1.2.2 酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測血液中的TGFBI 向反應(yīng)孔中添加0.1 mL的抗體稀釋液(用緩沖液稀釋至1～10 μg/mL)，并于4 ℃孵育過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次。向反應(yīng)孔中加入0.05 mL稀釋至合適濃度的待檢樣品，于37 ℃孵育1 h，然后洗滌(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。各反應(yīng)孔中，分別加入0.05 mL新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)，37 ℃孵育0.5～1.0 h，洗滌。向各反應(yīng)孔中加入0.1 mL臨時配制的TMB底物溶液，37℃反應(yīng)10～30 min。于各反應(yīng)孔中加入0.05 mL的2 mol/L硫酸，于450 nm(若以ABTS顯色，則410 nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

1.2.3 穩(wěn)定沉默TGFBI細胞系的構(gòu)建 胃癌SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染慢病毒載體pLV5-GFP-Luc，3 d后進行克隆篩選；穩(wěn)定表達Luc的SGC-7901-Luc細胞用于細胞系的建立。使用慢病毒載體pLV3-TGFBI shRNA(表達TGFBI shRNA)轉(zhuǎn)染SGC-7901-Luc細胞，5 d后利用2 μg/mL的嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的SGC-7901-Luc-shTGFBI細胞；TGFBI干擾后在重組細胞系中的表達水平通過Western blot進行檢測。本文所使用的shRNA序列: TGFB1 shRNA#1:GAUAAGGUCAUCUCCACCA，TGFB1 shRNA#2:CUUGAAGUCAGCUAUGUGU，NC:UUCUCC-GAACGUGUCACGU。

1.2.4 q-PCR 取對數(shù)生長期構(gòu)建的胃癌SGC-7901細胞，消化接種至6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。用TRIZOL法裂解并提取RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測。引物序列(5′→3′)：TGFBI (forward: AGGAATTTGCTTCGGAACCAC; reverse: GCT-GTTCTCAATGCAAAGGCTA), GAPDH (forward: CCCACTCC-TCCACCTTTGAC; reverse: TCTTCCTCTT-GTGCTCTTGC)。

1.2.5 Western blot檢測 取對數(shù)生長期構(gòu)建的胃癌SGC-7901細胞，消化接種至6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。用三氯乙酸(TCA)法提取培養(yǎng)上清中的蛋白，以及用SDS提取細胞裂解物進行Western blot檢測，GAPDH的表達作為對照。對于SGC-7901細胞的裂解，向每組細胞加入60 μL的RIPA裂解液，冰上放置30 min，130 00×g離心30 min收集上清液；樣品通過BCA法進行定量檢測，使每孔上樣等量(40 μg左右)的目的蛋白，10%SDS PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)于PVDF膜上；使用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃ 孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，3次/10 min，ECL顯色。

1.2.6 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的胃癌細胞SGC-7901，制備單細胞懸液，按每孔細胞密度為4×103個/mL，接種至96孔培養(yǎng)板中，邊緣加入PBS緩沖液，設(shè)置空白調(diào)零組，進行MTT法檢測。使用酶聯(lián)酶標儀，選取490 nm波長處檢測各孔的光吸收值(OD490值)。胃癌SGC-7901細胞存活率SR=(實驗組平均OD490值/對照組平均OD490值)×100%，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.7 細胞侵襲與遷移檢測 胃癌SGC-7901細胞饑餓處理12 h后進行消化，使用無血清培養(yǎng)基進行重懸，調(diào)整細胞濃度為1×105/組，體積為200 μL，接種于上室，下室加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600 μL；實驗分為4組，細胞遷移實驗需在培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后取出小室。細胞侵襲實驗需將 Matrigel 膠用無血清1640培養(yǎng)基按1 ∶4稀釋后，取50 μL加到 Transwell小室底部膜的上室中去，細胞培養(yǎng)箱中放置1 h后再加入2×105/組的細胞，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取出小室。用PBS清洗上室和下室3次，用甲醇固定細胞，結(jié)晶紫染色；倒置顯微鏡下采集數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)發(fā)胃癌臨床病理特征與TGFBI表達的關(guān)系

對比不同年齡、性別、分化程度、轉(zhuǎn)移情況以及臨床分期胃癌患者血液中的TGFBI表達情況，發(fā)現(xiàn)胃癌復(fù)發(fā)病人血液中TGFBI的表達水平與腫瘤低分化、轉(zhuǎn)移以及臨床分期正相關(guān)，且這種差異與患者的年齡和性別無明顯的相關(guān)性(表1)。將收集的所有胃癌患者血液樣本中的TGFBI含量進行ELISA定量分析，發(fā)現(xiàn)血液樣本中TGFBI的平均表達水平顯著高于正常人血液樣本(圖1)。該實驗結(jié)果表明，胃癌細胞中TGFBI的表達可能與其術(shù)后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及臨床分期存在一定的關(guān)系。

表1 復(fù)發(fā)胃癌臨床病理特征與病人血液中TGFBI蛋白表達的相關(guān)性[n(%)]

圖1 ELISA檢測血液樣本中TGFBI的含量檢測

2.2 利用shRNA結(jié)合慢病毒技術(shù)穩(wěn)定敲低技術(shù)抑制TGFBI在SGC-7901細胞中的表達和分泌

為進一步研究胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的高進展性病理特征與TGFBI的關(guān)系，通過shRNA結(jié)合慢病毒技術(shù)穩(wěn)定敲低技術(shù)下調(diào)胃癌SGC-7901細胞中TGFBI的表達，構(gòu)建SGC-7901-shTGFBI穩(wěn)定敲減細胞系(TGFBI sh#1和TGFBI sh#2)。通過q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，兩株SGC-7901-shTGFBI穩(wěn)定干擾細胞系中TGFBI的轉(zhuǎn)錄水平較對照組均顯著降低(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比SGC-7901-shTGFBI細胞以及上清中TGFBI的蛋白表達水平顯著下降(圖2B、C)。該實驗表明，shRNA穩(wěn)定敲減后SGC-7901細胞中TGFBI的表達和分泌均受到了顯著抑制。

圖2 TGFBI的表達水平檢測 A：TGFBI轉(zhuǎn)錄水平檢測(**與NC組比較，P<0.01)；B：TGFBI在SGC-7901細胞中的表達水平檢測；C：TGFBI在培養(yǎng)上清中的表達水平檢測

2.3 TGFBI表達下調(diào)可抑制SGC-7901細胞的增殖

對比TGFBI穩(wěn)定敲減細胞(TGFBI sh#1和TGFBI sh#2)與正常SGC-7901細胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)在細胞培養(yǎng)過程中，SGC-7901-shTGFBI細胞的增殖速率較正常細胞顯著降低；培養(yǎng)7 d后，SGC-7901-shTGFBI細胞的存活率較正常細胞下降了40%左右(圖3)。該實驗表明，下調(diào)SGC-7901細胞中TGFBI的表達，可顯著抑制其增殖。

圖3 TGFBI下調(diào)對SGC-7901細胞增殖的影響 ***表示P<0.001

2.4 TGFBI表達下調(diào)可抑制SGC-7901細胞的侵襲與遷移

為進一步考察TGFBI下調(diào)對胃癌細胞SGC-7901的侵襲與遷移影響，transwell法檢測TGFBI穩(wěn)定敲減細胞(TGFBI sh#1和TGFBI sh#2)和正常SGC-7901細胞侵襲與遷移的能力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFBI表達下調(diào)后，SGC-7901細胞的侵襲與遷移能力均受到了顯著抑制(圖4)。

圖4 TGFBI下調(diào)對SGC-7901細胞侵襲與遷移的影響 與NC組比較,**P<0.01

2.5 TGFBI影響胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機制探究

為了探究TGFBI是否通過EMT促進胃癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，通過Western blot檢測EMT的標志物Snail、ZEB1和E-cadherin在SGC-7901-shTGFBI細胞中的表達水平，發(fā)現(xiàn)TGFBI表達下調(diào)后，細胞中Snail和ZEB1的表達受到了一定的抑制，而E-cadherin的表達水平得到了顯著提高(圖5A)。通過對比，Snail和ZEB1的蛋白表達水平較對照組分別下降了60%和30%左右，而E-cadherin的蛋白表達水平與對照組相比提高了4倍左右(圖5B)。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子表達情況檢測 與NC組比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

胃癌是一種臨床高發(fā)性腫瘤疾病，術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，目前尚無有效的預(yù)后手段。以癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移通路中的關(guān)鍵基因為靶點的靶向藥物研究，一直以來都是癌癥臨床治療研究過程中所關(guān)注的重點。如在有關(guān)乳腺癌的靶向藥物研究中，赫賽汀被發(fā)現(xiàn)能夠通過特異性的抑制HER-2編碼基因的表達，而用于乳腺癌晚期的解救治療及其早期的輔助治療[14]。目前，有關(guān)胃癌細胞轉(zhuǎn)移的信號通路及作用機制已有一定的研究報道，其中在以表皮生長因子受體EGFR[15]、血管內(nèi)皮生長因子VEGF[16]和膜受體酪氨酸激酶C-MET[17]等為靶點的靶向藥物研究方面均取得了一定的進展。近年來，有研究表明上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與胃癌細胞的轉(zhuǎn)移及進展有密切的關(guān)系[5]。

TGFBI作為一種由TGF-β1誘導合成的胞外基質(zhì)蛋白，在多種癌細胞的轉(zhuǎn)移機制中均具有重要的作用，然而該蛋白與胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系尚不明確。本研究首先對比了不同性別、年齡和臨床病理特征胃癌患者血液樣本中TGFBI的表達情況，發(fā)現(xiàn)胃癌復(fù)發(fā)病人血液中TGFBI的表達水平與腫瘤低分化、轉(zhuǎn)移以及臨床分期正相關(guān)，表明TGFBI與胃癌的復(fù)發(fā)和進展有密切相關(guān)。研究表明，敲除口腔鱗癌細胞的TGFBI可顯著抑制其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。為了考察TGFBI的表達與胃癌細胞行為特性的關(guān)系，本研究利用RNA干擾技術(shù)將SGC-7901細胞中TGFBI的表達進行了下調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFBI表達下調(diào)后SGC-7901細胞的增殖、侵襲與遷移能力均受到了顯著的抑制。

以往研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Snail高表達及黏附分子E-cadherin低表達可作為胃黏膜惡性轉(zhuǎn)變和胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的重要生物學標志，并對其預(yù)后有重要的意義[19]。為進一步探究TGFBI表達對胃癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的作用機制，本研究對胃癌細胞中Snail、ZEB1和E-cadherin的表達水平進行了檢測。發(fā)現(xiàn)TGFBI表達下調(diào)后，SGC-7901細胞中E-cadherin的表達水平顯著提高，而Snail和ZEB1的表達水平顯著下降。由E-cadherin表達下調(diào)引起的EMT轉(zhuǎn)變，是癌細胞侵襲和遷移抑制過程中的常見作用機制，且在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制研究中已得到證實[6, 20]。因此，SGC-7901細胞中TGFBI表達下調(diào)后可能也是通過該機制對胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移進行抑制。

綜上所述，胃癌細胞中TGFBI下調(diào)可能通過上調(diào)E-cadherin的表達抑制胃癌細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變，進而抑制其侵襲和遷移。因此，TGFBI可能作為一個候選的靶點用于胃癌相關(guān)靶向藥物的研究開發(fā)，并為胃癌的有效預(yù)后提供一定的指導。