Bmi1和METTL3在膽管癌中的臨床意義及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

趙臣，張江華，王金，賈聿明

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)起源于膽道上皮細(xì)胞，是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤[1]。由于無明顯的癥狀表現(xiàn)，確診時(shí)CCA患者經(jīng)常為晚期，大多數(shù)患者錯(cuò)過了R0切除的機(jī)會(huì)[2]。CCA的早期診斷和預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1，Bmi1)參與多種腫瘤調(diào)節(jié)機(jī)制，具有促癌作用，一項(xiàng)最近的體外研究顯示Bmi1具有促進(jìn)CCA增殖的作用，但是其臨床意義尚不清楚[3]。甲基轉(zhuǎn)移酶3(methyltransferase 3，METTL3)是一種催化信使RNA(message RNA，mRNA)甲基化的蛋白酶，通過這種方式，METTL3可調(diào)控原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，在皮膚癌、胃癌等，METTL3發(fā)揮促癌作用，但是其在CCA中的表達(dá)水平尚不清楚[4-5]。Bmi1和METTL3在CCA中的臨床意義及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床更好的診斷和治療CCA提供思路。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

首先通過生物信息學(xué)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中Bmi1和METTL3在CCA(在TCGA數(shù)據(jù)庫中，CCA表示為CHOL)中的表達(dá)特點(diǎn)，網(wǎng)站為http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php。

1.2 基本資料

隨機(jī)選擇2013年1月至2015年1月間的45例CCA患者作為研究對(duì)象，其中，男22例，女23例；年齡42～81歲，中位年齡62歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡40～85歲；(2)經(jīng)穿刺活檢或術(shù)后病理學(xué)檢測(cè)確診為CCA；(3)知情同意。 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型原發(fā)性惡性腫瘤；(2)入組前3個(gè)月內(nèi)接受化療、放療等治療；(3)合并精神疾病史。

1.3 方法

通過問卷調(diào)查的方式收集每位患者的基本資料和聯(lián)系方式，然后經(jīng)過手術(shù)或全身PET-CT檢測(cè)CCA轉(zhuǎn)移情況。收集腫瘤組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣>2cm)。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)Bim1和METTL3

將樣本經(jīng)過梯度酒精脫水、透明處理后包埋至蠟塊中，冷凍30 min并切成4 μm厚切片。將切片脫蠟、水化和抗原修復(fù)，然后加入3%過氧化氫溶液(雙氧水:純水=1 ∶9)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，使用3%的BSA室溫下封閉30 min。然后分別加入1∶500稀釋的anti-Bmi1(ab126783，Abcam公司，美國(guó))、anti-METTL3(ab195352，Abcam公司，美國(guó))或anti-IMP3(ab179807，Abcam公司，美國(guó))并在37℃下孵育60 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。洗滌后加入100μL增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物覆蓋組織，室溫孵育60 min。滴加DAB顯色5～6 min復(fù)染后使用蘇木紫染色20 min，然后脫水透明，封片后使用顯微鏡觀察染色結(jié)果。

通過半定量法進(jìn)行判定，由2名主治醫(yī)師獨(dú)立采用半定量積分方法對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行判讀，隨機(jī)檢測(cè)5個(gè)視野進(jìn)行觀察。染色顏色分為0～3分：0分，未著色，為陰性；1分，淺黃色；2分，黃色；3分，棕黃色。染色范圍記為0～4分：<5%計(jì)為0分，為陰性；5%～25%計(jì)為1分；26%～50%計(jì)為2分；51%～75%計(jì)為3分；76%～100%計(jì)為4分。將兩者得分相乘，得到最終免疫組化得分。0為陰性，1～6分為低表達(dá)，7～12分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Bmi1和METTL3在CCA中的水平

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，共包括36例CCA組織和9例正常膽管組織，結(jié)果顯示CCA組織中Bmi1和METTL3的水平顯著高于正常組織，見圖1和圖2。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中Bmi1在CCA中的水平

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中METTL3在CCA中的水平

2.2 Bmi1在CCA中的表達(dá)特點(diǎn)

免疫組化研究結(jié)果顯示Bmi1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。Bmi1在CCA組織中的陽性率(80.00%)顯著高于癌旁組織(17.78%)(P<0.05)，見圖3和表1。

圖3 免疫組化染色檢測(cè)Bmi1的表達(dá)(×200) A:癌旁組織；B:CCA組織

表1 Bmi1在CCA組織和癌旁組織中的表達(dá)水平 [n(%)]

2.3 METTL3在CCA中的表達(dá)特點(diǎn)

METTL3主要存在于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也有部分表達(dá)。METTL3在CCA組織中的陽性率(82.22%)顯著高于癌旁組織(22.22%)，見圖4和表2。

圖4 免疫組化染色檢測(cè)METTL3的表達(dá)(×200) A:癌旁組織；B:CCA組織

表2 METTL3在CCA組織和癌旁組織中的表達(dá)水平[n(%)]

2.4 Bim1與CCA患者一般資料、病理特點(diǎn)的關(guān)系

性別、年齡、腫瘤大小、神經(jīng)累犯和分化程度對(duì)CCA組織中Bim1的影響不大(P>0.05)，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移患者的CCA組織中Bim1水平顯著高于未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)，見表3。

表3 Bim1與CCA患者一般資料、病理特點(diǎn)的關(guān)系[n(%)]

2.5 METTL3與CCA患者一般資料、病理特點(diǎn)的關(guān)系

性別、年齡、腫瘤大小對(duì)CCA組織中METTL3的影響不大(P>0.05)，神經(jīng)累犯、低分化程度和出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者的CCA組織中METTL3水平顯著升高(P<0.05)，見表4。

表4 METTL3與CCA患者一般資料、病理特點(diǎn)的關(guān)系 [n(%)]

3 討論

CCA是一種預(yù)后較差的罕見癌癥。據(jù)報(bào)道，日本CCA的發(fā)生率為每10萬人口中出現(xiàn)18.4例患者[6]。在一項(xiàng)回顧性研究中，242例CCA患者的中位生存期為15.8個(gè)月，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期的中位生存期分別為23、25、14和4.5個(gè)月[7]。手術(shù)切除是主要的治療CCA的方法，但是在晚期CCA的情況下很難進(jìn)行手術(shù)[8]；盡管化學(xué)療法是有效的，但是接受化學(xué)療法的患者的預(yù)后仍然很差；放射療法用于治療無法切除的CCA，但是放療經(jīng)常會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，如膽管炎、膽管出血和十二指腸潰瘍等[9]。在早期接受治療是提高CCA預(yù)后的重要方式，因此，尋找診斷與判斷預(yù)后的生物標(biāo)志因子對(duì)于診斷和治療CCA具有重要意義。

Bmi1是PcG轉(zhuǎn)錄因子的成員，最初在B細(xì)胞淋巴瘤中被鑒定為轉(zhuǎn)錄阻遏物。臨床研究已經(jīng)顯示Bmi1在多種腫瘤中具有促癌作用。如在結(jié)腸癌組織中，Bmi1的水平顯著高于癌旁組織，并可作為診斷結(jié)腸癌的靶標(biāo)[10]；在肝細(xì)胞癌中Bmi1也高表達(dá)，高水平的Bmi1水平與TNM分期和血管侵犯有關(guān)，并且高水平的Bmi1與患者的不良預(yù)后有關(guān)[11]。最近也有體外研究表明在乳腺癌、膀胱癌等中，Bmi1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用[12-13]。但是關(guān)于Bmi1在CCA中的臨床意義尚不清楚，為初步分析Bmi1與CCA的關(guān)系，借助生物信息學(xué)分析了Bmi1在CCA中的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果顯示，在36例CCA組織中，Bmi1的水平顯著上調(diào)。然后在臨床上收集了45例CCA組織和癌旁組織，免疫組化染色結(jié)果顯示Bmi1在CCA組織中的陽性率(80.00%)顯著高于癌旁組織(17.78%)，并且出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者的CCA組織中Bim1水平顯著高于未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者。此外，雖然統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示是否有神經(jīng)累犯與Bmi1關(guān)系不顯著，但其數(shù)值具有較大差異，可擴(kuò)大樣本進(jìn)行分析。Zhang等[14]臨床研究結(jié)果顯示，高水平的Bmi1與膽管腫瘤血栓的發(fā)生有關(guān)。本次研究結(jié)果顯示Bmi1的高表達(dá)與CCA的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可作為CCA的生物標(biāo)志因子。

mRNA的翻譯過程也受到甲基化的調(diào)控。研究顯示N6-甲基腺苷可以修飾mRNA的富含終止密碼子區(qū)域以及3 ′非翻譯末端區(qū)域，從而調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，而METTL3具有調(diào)控mRNA甲基化的作用[15]。METTL3在消化道腫瘤中具有重要作用，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示METTL3沉默可抑制消化道腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力、集落形成和運(yùn)動(dòng)能力，這提示表明METTL3在這些癌癥中發(fā)揮致癌作用，如胰腺癌、胃癌等[16-17]。并且在肝癌中，高水平的METTL3與不良預(yù)后有關(guān)[18]。但是關(guān)于METTL3在CCA中的表達(dá)水平尚不清楚。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在CCA組織中，METTL3水平顯著高于正常組織。然后通過免疫組化染色對(duì)臨床樣本中的METTL3水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示ETTL3在CCA組織中的陽性率(82.22%)顯著高于癌旁組織(22.22%)，性別、年齡、腫瘤大小對(duì)CCA組織中METTL3的影響不大，最大直徑≥3 cm、神經(jīng)累犯、低分化程度和出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者的CCA組織中METTL3水平顯著升高。并且過往有研究顯示METTL3有調(diào)控骨髓和白血病細(xì)胞分化的作用[19-20]。本次研究結(jié)果提示METTL3具有促進(jìn)CCA發(fā)生和進(jìn)展的作用，并且于CCA分期、轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，可作為判斷預(yù)后的標(biāo)志蛋白。

綜上所述，Bmi1和METTL3在CCA中過表達(dá)，METTL3可能參與CCA的分期、分化和神經(jīng)累犯有關(guān)，并且高水平的Bmi1和METTL3均與CCA的轉(zhuǎn)移有關(guān)。這提示Bmi1和METTL3可能成為診斷CCA和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志因子，并且關(guān)于Bmi1和METTL3在CCA中的臨床意義和促癌機(jī)制需要深入研究。