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    基于Nrf2-Keap1-ARE信號通路探討疏肝健脾方對腸易激綜合征大鼠內臟敏感性的影響

    2021-03-10 07:35:30朱琳馮燕李佳
    現(xiàn)代消化及介入診療 2021年1期
    關鍵詞:疏肝健脾結腸

    朱琳,馮燕,李佳

    腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種腸道功能紊亂性疾病,主要表現(xiàn)為腹痛、腹脹、不正常排便以及大便性狀改變等癥狀[1]。腹瀉型、便秘型和混合型是臨床上IBS的三種主要類型[2]。內臟高敏感性是IBS發(fā)病的主要原因[3]。IBS在中國總患病率高達6.5%,消化內科門診病患中有50%左右是IBS患者,且患病人數(shù)逐年增加,平均每年增長0.2%,目前,IBS已成為全球性的胃腸功能性疾病[4]。IBS是一種身心疾患,雖不威脅患者的生命,但卻給患者的生活造成嚴重的影響,且容易反復發(fā)作,給個人、家庭造成了巨大的經(jīng)濟和精神負擔。目前尚未闡明IBS的病因及發(fā)病機制,IBS的發(fā)生與遺傳、飲食健康、精神負擔、生活習慣、內分泌、免疫等多種因素有關,IBS的病理生理特征主要是內臟敏感性增高和結腸動力學紊亂[5]。IBS患者的腸道會發(fā)生不同程度的應激反應,對患者的康復和預后的影響最嚴重的是氧化應激反應[6]。氧化應激可以通過多種機制參與IBS的發(fā)病,但其具體機制仍不清楚。有關報道稱[7],核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1,Keap1)-抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)信號通路在抗氧化應激中發(fā)揮重要作用,其調控的下游抗氧化蛋白/酶和Ⅱ相代謝酶在細胞防御保護中發(fā)揮重要作用,也是近幾年抗氧化研究領域的熱點。疏肝健脾法對改善IBS的癥狀具有突出的臨床療效[8],其治療作用是否與對內臟敏感性的調節(jié)有關,值得進一步探討其作用機制。本研究旨在從Nrf2-Keap1-ARE信號通路揭示疏肝健脾方對IBS大鼠內臟敏感性的干預作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    SPF級雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物合格證:SYXK(京)2018-0042),體質量為180~220 g,飼養(yǎng)于邯鄲市第一醫(yī)院動物實驗中心,飼養(yǎng)室保持良好通風,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±2)℃,濕度(50±10)%,12 h 循環(huán)光照。正常飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境,第2周開始進行實驗。40只大鼠隨機分為空白組、模型組、疏肝健脾方組和陽性對照組,每組10只。

    1.2 藥品與主要試劑

    疏肝健脾方:土炒白術50 g,茯苓50 g,白芍50 g,黃茂50 g,積殼50 g,陳皮50 g,炙甘草25 g,飲片購自康美藥業(yè)股份有限公司。將上述藥物浸泡于600 mL清水中20 min,煎藥后過濾,獲得200 mL藥液,原藥液濃度為1.625 g/mL,冷卻后4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

    匹維溴銨(廠家:法國蘇威制藥廠,批號:H20120759,規(guī)格:50 mg/片):將1片匹維溴銨研磨成細粉,加入50 mL 0.9%氯化鈉溶液,用潔凈玻璃棒攪拌直至完全溶解。

    GAS、MTL、SP和SS ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物),MDA、SOD、NO檢測試劑盒(美國Abcam),兔抗小鼠p-Nrf2抗體(上海滬崢生物科技有限公司,產(chǎn)品貨號:HZK-11834),兔抗大鼠p-Keap1抗體(北京義翹神州科技股份有限公司,產(chǎn)品貨號:101205-T10),兔抗大鼠p-ARE抗體(Thermo Fisher公司,產(chǎn)品貨號:MA119728),兔抗大鼠ZO-1抗體(武漢菲恩生物科技有限公司,產(chǎn)品貨號:FNab09750),兔抗大鼠Occludin抗體(武漢菲恩生物科技有限公司,產(chǎn)品貨號:FNab05957),兔抗山羊生物素抗體(北京百奧萊博科技有限公司,產(chǎn)品貨號:BL0945-WBX),總蛋白提取試劑盒(上海恒遠生物),BCA蛋白定量試劑盒(北京博凌科為生物)。

    1.3 動物模型建立

    IBS內臟高敏感性大鼠模型的制備采用4%醋酸灌腸聯(lián)合慢性心理應激法[9]。4%醋酸灌腸:將禁食1 d的大鼠用乙醚麻醉,6 F嬰兒導尿管上涂抹有潤滑劑插入6 cm,空白組和模型組分別注入1 mL 0.9%氯化鈉溶液、4%醋酸溶液,30 s后注入0.9%氯化鈉溶液1 mL將存留液體沖洗掉。慢性心理應激法:氣味刺激、潮濕環(huán)境、晝夜顛倒、聲波刺激、電擊、束縛、強光及閃爍燈照射、禁水、禁食、擁擠、夾尾、噪聲和鼠籠傾斜。應激處理每天上午和下午各隨機安排1種,共處理14 d,同種方法不能連續(xù)出現(xiàn)。以糞便含水率評價模型,糞便含水率較空白組顯著增加為模型建立成功。

    1.4 給藥方法

    IBS內臟高敏感性大鼠模型制備完成后第4天開始灌胃給藥治療,連續(xù)10 d,每天2次??瞻捉M和模型組按5 mL/kg的劑量灌0.9%氯化鈉溶液,疏肝健脾方組按5 mL/kg的劑量給疏肝健脾方,陽性對照組按2 mg/kg的劑量給匹維溴銨。

    1.5 糞便含水率檢測

    藥物治療結束當天檢測大鼠糞便含水率。提尾刺激大鼠排便,收集大鼠糞便。用微量電子天平稱重并記錄數(shù)據(jù)后,烘箱干燥直至糞便重量不再變化,記錄數(shù)據(jù)。糞便含水率=(糞便鮮重-糞便干重)/糞便鮮重×100%。

    1.6 內臟敏感性檢測

    參照文獻[10]的檢測方法,用乙醚麻醉,肛門處用絡合碘消毒,在2 F雙腔導尿管上涂抹石蠟潤滑,插入大鼠肛門,氣囊末端剩余1 cm后固定。將蘇醒后的大鼠放入 20 cm×5 cm×8 cm的透明塑料籠內,向安靜大鼠的氣囊內緩慢注水,觀察大鼠腹部抬起和背部拱起,持續(xù)20 s并分別記錄所需注水量,實驗重復3次,數(shù)據(jù)取3次的平均值。

    1.7 大鼠結腸組織HE染色

    結直腸組織在多聚甲醛中浸泡48 h后,經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋,切成4 μm的切片。然后依次脫蠟、水化,進行HE染色、脫水、二甲苯透明、干燥。中性樹膠封片,用光學顯微鏡觀察結腸組織形態(tài)并拍攝照片。

    1.8 血清胃腸激素水平的檢測

    采用腹腔注射350 mg/kg的10%水合氯醛溶液麻醉大鼠,腹主動脈采血3 mL,加肝素鈉抗凝,離心(3 000 r/min,15 min)后取上清,-80 ℃凍存。采用ELISA法檢測血清胃泌素(gastrin,GAS)、胃動素(motilin,MTL)、P物質(substance P,SP)、生長抑素(somatostatin,SS)水平。

    1.9 大鼠血清中氧化應激指標的含量測定

    大鼠血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定用硫代巴比妥酸酸法,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)采用黃嘌呤氧化酶法測定,一氧化氮(nitric oxide,NO)測定采用硝酸還原酶法,以上三種氧化應激指標測定均按照美國Abcam試劑盒的說明書進行操作。

    1.10 免疫熒光法檢測ZO-1、Occludin蛋白變化

    制備結腸組織石蠟切片,60 ℃烤片2 h,恢復至常溫后脫水,二甲苯脫蠟,PBS洗滌,抗原修復,PBS洗滌,1% BSA封閉20 min,一抗體中孵育1.5 h,PBS洗滌,二抗中孵育30 min,PBS洗滌,熒光顯微鏡觀察蛋白形態(tài)變化。采用免疫熒光的方法觀察各組大鼠結腸黏膜上皮ZO-1、Occludin的表達,并運用圖像分析軟件進行平均光密度測定。

    1.11 Western blotting檢測大鼠結直腸組織Nrf2-Keap1-ARE通路蛋白表達

    從冰箱中取出大鼠結腸組織,裂解后離心留取上清,測定總蛋白濃度后,取50 μg樣品,進行電泳,轉模,封閉,加入一抗(均為1∶1 000),4 ℃孵育過夜,加入二抗,顯色,成像,Image軟件分析各條帶的灰度值,以GAPDH作為內參,獲得蛋白的相對表達水平。

    1.12 統(tǒng)計學分析

    2 結果

    2.1 疏肝健脾方對糞便含水量的影響

    造模完成后,模型組、疏肝健脾方組、陽性對照組的大鼠糞便含水率較空白組均明顯上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明IBS大鼠模型制備成功;藥物治療后,與模型組相比,陽性對照組和疏肝健脾方組大鼠的糞便含水率顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

    圖1 各組大鼠糞便含水率比較 A:造模完成后大鼠糞便含水率;B:治療后大鼠糞便含水率。與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

    2.2 大鼠內臟敏感性比較

    與空白組相比,模型組大鼠的腹部抬起和背部拱起程度明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比,疏肝健脾組和陽性對照組大鼠的腹部抬起和背部拱起程度明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。

    圖2 治療后各組大鼠內臟敏感性比較 A:腹部抬起比較;B:背部拱起比較。與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

    2.3 疏肝健脾方對結腸組織病理形態(tài)的影響

    空白組大鼠結腸組織結構正常,結腸黏膜完整,黏膜上皮完整、連續(xù),呈單程柱狀,腺體排列規(guī)則,結構清晰,固有層可見黏膜肌層;模型組大部分腺體排列紊亂,邊界不清晰,固有層幾乎無可見黏膜肌層,有明顯的炎細胞浸潤,黏膜下層部分可見血管增生;疏肝健脾組和陽性對照組結腸組織病理形態(tài)有明顯的改善,腺體增生愈合,排列整齊,結構清晰完整,無明顯的炎性細胞浸潤等現(xiàn)象,見圖3。

    圖3 大鼠結腸組織病理HE染色(×200) A:空白組;B:模型組;C:疏肝健脾方組;D:陽性對照組。

    2.4 血清胃腸激素水平比較

    模型組血清GAS和MTL水平均明顯低于空白組,SP和SS水平均明顯高于空白組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);疏肝健脾組和陽性對照組血清GAS、MTL水平均明顯高于模型組(P<0.05),SP和SS水平均明顯低于模型組(P<0.05),見圖4。

    圖4 血清為腸激素水平比較 A:GAS水平;B:MTL水平;C:SP水平;D:SS水平。與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

    2.5 大鼠血清中MDA、SOD、NO的含量測定

    與空白組相比,模型組大鼠血清中SOD、NO的含量明顯降低,MDA的含量增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比,疏肝健脾方組和陽性對照組的SOD和NO的含量增加,MDA含量降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5。

    圖5 大鼠血清中MDA、SOD、NO水平的比較 A:MDA含量;B:SOD含量;C:NO含量。與空白組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05

    2.6 大鼠結腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occludin免疫熒光

    通過對大鼠結腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1和Occludin進行免疫熒光標記,空白組結腸黏膜的ZO-1、Occludin為環(huán)狀結構且排列緊密、連續(xù),而模型組的緊密連接蛋白形狀不規(guī)則,分散在細胞外圍,幾乎被完全破壞,熒光染色暗淡,蛋白表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比較,疏肝健脾方組和陽性對照組的ZO-1、 Occludin損傷程度明顯減輕,蛋白表達水平增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖6。

    圖6 免疫熒光法檢測大鼠結腸黏膜ZO-1、Occludin蛋白的損傷 A:ZO-1、Occludin蛋白免疫熒光結果(×400);B:ZO-1、Occludin蛋白平均吸光度比較。與空白組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05

    2.6 p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白在大鼠結腸組織中的表達變化

    Western blotting檢測小鼠結腸組織中空白組、模型組、疏肝健脾組及陽性對照組中p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白的表達水平變化。與空白組相比,模型組中p-Nrf2和p-Keap1、p-ARE蛋白表達水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,疏肝健脾組和陽性對照組p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白表達水平均下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖7。

    圖7 p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白在大鼠結腸組織中的表達變化 A:Western blotting檢測p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白的表達;B:p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白相對表達量。與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

    3 討論

    近年來IBS的患病率逐年上升,流行病學調查結果顯示,我國IBS患病率高達6.5%。IBS降低患者的生活質量,增加經(jīng)濟負擔和精神壓力。目前西醫(yī)針對IBS的治療措施主要是對癥治療,不能從根本上達到治療的目的[11]。研究表明[12],中醫(yī)藥治療可以有效改善患者的腸道功能紊亂癥狀,提高患者的生活質量,降低復發(fā)率,具有獨特的優(yōu)勢。許多研究顯示[13],中醫(yī)藥疏肝健脾方應用于臨床上對于治療IBS具有良好的療效。本研究首先成功構建大鼠IBS模型,并于一段時間后給予疏肝健脾方治療,發(fā)現(xiàn)與未獲得治療的大鼠相比,疏肝健脾方治療后的大鼠精神狀態(tài)、活動、飲食等情況均明顯好轉。觀察期內糞便含水量在治療后也逐步減少,大鼠內臟敏感性降低,血清胃腸激素水平趨于正常,氧化應激水平降低,證明疏肝健脾方對IBS大鼠具有較好的治療作用。徐浩東等[14]研究通過將疏肝健脾理腸方與雙歧桿菌四聯(lián)活菌片治療進行比較,發(fā)現(xiàn)疏肝健脾理腸方治療IBS的臨床療效更顯著(P<0.05),且治療后IBS癥狀和軀體化癥狀均有明顯好轉,但尚未闡明其作用機制。因此本研究進一步探究疏肝健脾方對IBS的療效及其相關的分子機制。

    內源性抗氧化信號通路中最重要的是Nrf2-Keap1-ARE信號通路,是近幾年抗氧化領域的研究熱點,可抵抗內外界各種因素刺激引起的氧化應激反應,防御外來損傷[15]。Nrf2廣泛存在于機體的各個器官中,是CNC調節(jié)蛋白家族的成員,主要調節(jié)細胞的氧化還原反應[16]。Keap1是Nrf2的抑制劑,正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1結合,以非活性狀態(tài)存在于胞漿中[17]。當細胞受到刺激后,例如活性氧(ROS)刺激,Keap1與Nrf2解離,Nrf2以活性狀態(tài)存在于細胞中并進入細胞核,依次與Maf、ARE結合,啟動下游抗氧化蛋白/酶和Ⅱ相代謝酶表達,調控其轉錄活性,調節(jié)機體內氧化還原水平使其達到平衡狀態(tài),從而發(fā)揮抗氧化損傷的作用[18]。SOD是體內酶抗氧化系統(tǒng)中的重要成員,能清除體內自由基從而保護細胞免于損害;MDA是體內過氧化脂質代謝產(chǎn)物,其含量間接反映機體氧自由基含量和細胞損傷程度;NO起到對血管內皮細胞的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn),模型組較空白組的MDA含量增加,SOD、NO的含量降低,Nrf2-Keap1-ARE通路蛋白的表達水平上升,表明IBS的發(fā)生與氧化應激及Nrf2-Keap1-ARE信號通路有關,用疏肝健脾方治療后,MDA的含量較模型組明顯降低,SOD、NO含量明顯增加,通路蛋白的表達水平下降,表明疏肝健脾方能夠作用于Nrf2-Keap1-ARE信號通路,調節(jié)大鼠體內氧化應激水平并起到治療的作用。

    大鼠結腸黏膜上皮細胞間的緊密連接(Tight junction,TJ)是結腸黏膜屏障的重要組成部分,它位于相鄰細胞間隙的頂端側面,主要由Occludin、ZOs等蛋白組成,其主要功能是調節(jié)滲透性和維持細胞極性[19]。研究表明[20],緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的減少會導致PI-IBS小鼠糞便含水率升高和內臟敏感性增加。研究發(fā)現(xiàn)[21],氧化應激導致豬小腸上皮細胞生長抑制及TJ 蛋白 Occludin、ZO- 1的基因表達水平下調,造成豬小腸上皮細胞通透性降低。本研究發(fā)現(xiàn),疏肝健脾方治療前大鼠結腸黏膜ZO-1、Occuldin 蛋白幾乎完全被破壞,表達水平降低,治療后與模型組比較,ZO-1、Occludin蛋白的損傷程度明顯減輕,僅局部被破壞,蛋白表達水平上升。表明疏肝健脾方可通過修復ZO-1、Occludin蛋白損傷,增加小腸上皮細胞通透性,降低內臟敏感性,發(fā)揮對結腸黏膜的保護作用。

    綜上所述,疏肝健脾方能夠有效改善大鼠IBS情況,降低氧化應激水平及結腸黏膜緊密連接蛋白的損傷程度,其機制可能與Nrf2-Keap1-ARE信號通路的調控有關。

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