原發(fā)性開角型青光眼患者房水中IL-37和IL-6的表達(dá)及意義

于 洋，蔣 沁，曹國(guó)凡

0引言

青光眼是一類以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為特點(diǎn)的不可逆性、致盲性眼病。原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是最常見的一種類型，約占全世界青光眼病例的70%[1]。目前，POAG的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是越來越多的證據(jù)表明，免疫反應(yīng)在青光眼發(fā)病機(jī)制中起重要作用。許多患者盡管眼壓得到控制，但是視神經(jīng)損傷、視野丟失程度仍然不斷加重，因此有研究者認(rèn)為青光眼性病理損傷不僅僅是由高眼壓引起的，炎癥因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能也參與其中[2]。

房水的動(dòng)態(tài)平衡與眼壓密切相關(guān)，房水為眼前節(jié)組織帶來營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也帶走了代謝廢物，因而房水中細(xì)胞因子的變化可以反映眼前節(jié)組織的代謝狀態(tài)和病理改變。由于血-眼屏障的存在，房水比血液更能反映眼內(nèi)環(huán)境情況，房水中細(xì)胞因子的檢測(cè)更有助于青光眼發(fā)病機(jī)制的研究[3]。

IL-6是IL-1家族的一種多效性細(xì)胞因子。IL-6在諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中表達(dá)增加，且與疾病病理生理狀況密切相關(guān)[4]。IL-37是新近發(fā)現(xiàn)IL-1家族成員，是一種具有廣泛免疫抑制活性的炎癥因子，對(duì)包括炎癥性腸病在內(nèi)的多種自身免疫性疾病具有保護(hù)作用[5]。本研究的目的是檢測(cè)POAG患者房水中IL-37和IL-6的含量，并試圖從免疫角度分析POAG的發(fā)病機(jī)制。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象采用前瞻性病例對(duì)照研究，納入2019-06/2020-01在南京醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院連續(xù)就診的25例POAG患者，其中男12例，女13例，平均年齡為54.64±5.73歲，平均眼壓為23.32±4.30mmHg，平均視野缺損為15.46±3.04dB；同時(shí)選取25例無全身及其他眼局部疾病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)患者作為對(duì)照組，其中男13例，女12例，平均年齡為60.38±8.22歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)POAG診斷參照《我國(guó)原發(fā)性青光眼診斷和治療專家共識(shí)》中有關(guān)POAG診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，ARC診斷參照白內(nèi)障診斷指南；(2)選擇小梁切除術(shù)或白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)為治療方式；(3) 自愿加入本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他眼病如葡萄膜炎、虹膜新生血管、外傷、腫瘤、黃斑變性等；(2)患者合并有糖尿病、全身感染、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性病變等其他全身性疾??；(3)既往有眼內(nèi)手術(shù)史；(4)房水量不足50 μL及其他數(shù)據(jù)不完整者。兩組患者性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.08,P>0.05)，平均年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.784，P<0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循《赫爾辛基宣言》原則。

第三，實(shí)現(xiàn)企業(yè)管理會(huì)計(jì)與全面預(yù)算管理整合，可以將管理會(huì)計(jì)與全面預(yù)算管理之間的優(yōu)勢(shì)充分結(jié)合，并進(jìn)一步彌補(bǔ)管理會(huì)計(jì)和全面預(yù)算之間的不足，促進(jìn)企業(yè)管理會(huì)計(jì)工作的順利開展實(shí)施。

1.2方法

1.2.1視野檢查采用Humphrey視野計(jì)，選擇SITA-FAST30-2程序檢測(cè)視野平均缺損。

1.2.2眼壓檢查采用非接觸眼壓計(jì)測(cè)量?；颊呷∈孢m坐位，連續(xù)測(cè)量3次，取平均值。

1.2.3房水收集所有POAG患者在行抗青光眼手術(shù)前抽取房水。具體操作流程如下：結(jié)膜囊內(nèi)清潔消毒后以25G注射器針頭行前房穿刺,5∶00方向進(jìn)針，針尖朝向7∶00方向，緩緩抽取50～100μL房水。收集過程中避免血液和其他液體混入。取出房水后迅速轉(zhuǎn)移至1.5mL無菌Eppendoff管中，放入-80°C超低溫冰箱中避光保存直至檢測(cè)。ARC患者房水收集：手術(shù)醫(yī)師在未破壞血-房水屏障前，抽取房水，具體抽取方法同POAG患者。所有取房水操作均由同一手術(shù)醫(yī)生完成。

1.2.4細(xì)胞因子分析主要試劑：人IL-6 ELISA試劑盒，人IL-37 ELISA試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。主要步驟有：房水常溫解凍，離心后取上清液加入96孔板，將包被好的抗體稀釋后加入96孔板，混勻后編號(hào)，封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱內(nèi)孵育1h。再用稀釋好的PBST洗滌液洗板5次，甩干。在各孔中加入酶標(biāo)試劑50μL，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C溫育30min，再用稀釋好的洗滌液洗板5次，甩干。PBST清洗后加入顯影液，室溫下反應(yīng)10min。采用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定吸光度值，得出IL-37或者IL-6的含量。

2結(jié)果

2.1兩組患者房水中IL-6和IL-37含量比較POAG組IL-37含量為25.80±2.87pg/mL,ARC組IL-37含量為23.75±3.88pg/mL,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.087,P<0.05)。POAG組IL-6含量為43.87±7.75pg/mL,ARC組IL-6含量為36.53±7.60pg/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.311,P<0.05)。

2.2 POAG組眼壓水平與房水中IL-6和IL-37相關(guān)性Pearson分析顯示POAG患者眼壓水平與房水中IL-6含量呈正相關(guān)(r=0.5817,P<0.05)，與房水中IL-37含量無相關(guān)性(r=-0.2313,P>0.05)。

2.3 POAG組視野平均缺損與房水中IL-6和IL-37相關(guān)性Pearson分析顯示POAG患者視野平均缺損與房水中IL-37含量呈正相關(guān)(r=0.4520,P<0.05)，與房水中IL-6含量無相關(guān)性(r=-0.2652,P>0.05)。

3討論

由于血-眼屏障的存在，睫狀體上皮細(xì)胞分泌的房水較血清更能反應(yīng)眼部微環(huán)境的變化。目前，房水中細(xì)胞因子檢測(cè)已經(jīng)成為眼科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容。多項(xiàng)研究表明房水中的細(xì)胞因子不僅與青光眼病理改變密切相關(guān)，甚至可能影響青光眼患者預(yù)后[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，POAG組患者房水中IL-37和IL-6含量較ARC組明顯增加，POAG患者房水中IL-6含量與眼壓具有正相關(guān)性，IL-37含量與視野平均缺損具有正相關(guān)性。

IL-6是一種具有多種生物功能的細(xì)胞因子，主要通過與IL-6受體和gp130結(jié)合，激活JAK-STAT、ERK-MAPK等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，廣泛參與免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、炎癥、腫瘤生成等病理生理過程[9]。目前有關(guān)房水中IL-6的來源尚不清楚。Taurone等[10]認(rèn)為在POAG患者房水中，IL-6來源于小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明，IL-6在包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，多個(gè)國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)使用IL-6R特異性單克隆抗體tocilizumab中和IL-6活性治療自身免疫性疾病[11]。因此，我們研究房水中IL-6表達(dá)水平對(duì)于理解免疫反應(yīng)在青光眼發(fā)病機(jī)制中的作用有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)IL-1a可以降低人眼小梁細(xì)胞吞噬功能，IL-6可以激活STAT3信號(hào)通路，影響成纖維細(xì)胞的增殖,介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[12]。先前已有研究報(bào)道IL-6在炎癥性青光眼和新生血管性青光眼中存在明顯高表達(dá)[13-14]，但是IL-6在POAG患者房水中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)POAG組患者房水中IL-6含量明顯高于ARC組，并且IL-6與眼壓具有顯著正相關(guān)關(guān)系，說明IL-6很有可能以某種機(jī)制介導(dǎo)眼壓的增高，參與POAG發(fā)病機(jī)制。

IL-37是新近發(fā)現(xiàn)的具有廣泛抑制活性的炎癥因子，主要由單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌。在炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展過程中，IL-37可以被激活，被激活的IL-37通過抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)[15]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，IL-37在多種慢性炎癥及自身免疫性疾病中表達(dá)上調(diào)，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、動(dòng)脈粥樣硬化，IL-37表達(dá)水平與這些疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)[16]。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)慢性閉角型青光眼患者房水中IL-36、IL-37、IL-38等細(xì)胞因子含量較白內(nèi)障對(duì)照組明顯升高，并且三種細(xì)胞因子含量與視野平均缺損均具有顯著相關(guān)性。這與本研究結(jié)果是相一致的，表明IL-37可能不僅僅參與青光眼的發(fā)病過程，甚至可能影響疾病預(yù)后。

總之，本研究結(jié)果顯示POAG患者房水中IL-37和IL-6水平明顯高于ARC組， IL-6與眼壓具有正相關(guān)性，IL-37與視野缺損具有正相關(guān)性。本研究結(jié)果說明免疫反應(yīng)在POAG發(fā)病機(jī)制中有重要作用，IL-6與IL-37可能以某種機(jī)制參與POAG的發(fā)生、發(fā)展。然而，我們的研究仍存在一些局限性：(1)由于傳統(tǒng)的ELISA實(shí)驗(yàn)本身的限制，再加房水樣本量有限，我們只測(cè)了總的IL-37的含量，未對(duì)其各亞型含量做進(jìn)一步的檢測(cè)。(2)樣本量偏小、以ARC患者作為健康對(duì)照的缺陷也影響了本研究的外部真實(shí)性。未來，我們會(huì)通過細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明IL-6和IL-37在POAG發(fā)病過程中的生物學(xué)作用。