巢蛋白陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞與癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)膠質(zhì)瘢痕形成的相關(guān)性研究

潘楠楠,方子妍,鄭乃智,周列民

癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)是指驚厥持續(xù)30 min以上或驚厥反復(fù)發(fā)作,發(fā)作間期意識(shí)不能恢復(fù)[1]。SE可對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞造成持久的損傷[2-3]，SE超過(guò)60 min可繼發(fā)難治性癲癇，甚至造成認(rèn)知功能損傷、記憶及情緒障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)高級(jí)功能損害，給患者及其家庭、社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。因此了解SE后海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷對(duì)該區(qū)域相關(guān)疾病的致病機(jī)制，可為尋求SE后神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方法提供更多的理論基礎(chǔ)。

大量研究發(fā)現(xiàn)，SE后 3～7 d海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著增加，胞體明顯肥大[3-4]，而星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的異?？稍斐缮窠?jīng)元興奮性增高[5]，進(jìn)一步引起星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生，致使海馬硬化、膠質(zhì)瘢痕形成[6]，對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)再生造成嚴(yán)重的持續(xù)的損傷。

目前關(guān)于SE后膠質(zhì)瘢痕形成的具體機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)，大腦缺血缺氧損傷7 d 后大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)出現(xiàn)大量肥大星形膠質(zhì)細(xì)胞樣巢蛋白(nestin)免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，且其表達(dá)在時(shí)間上、形態(tài)上與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖具有相關(guān)性。既往研究發(fā)現(xiàn)，SE后7 d 大鼠海馬區(qū)nestin表達(dá)顯著增加[7]，但其表達(dá)增加與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖是否有關(guān)目前鮮有研究。

在本實(shí)驗(yàn)中我們采用匹羅卡品誘導(dǎo)SE大鼠模型，利用盲法免疫熒光組化檢測(cè)海馬不同區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白單克隆抗體(GFAP)數(shù)目、nestin與GFAP表達(dá)的變化，觀察SE 7 d后nestin表達(dá)變化與星形膠質(zhì)細(xì)胞是否存在相關(guān)性，以探討SE后海馬膠質(zhì)瘢痕形成的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

選取6～8周雄性SPF級(jí)SD大鼠20只(由廣東省動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為SE組(10只)和對(duì)照組(10只)。溴甲阿托品和匹羅卡品購(gòu)于sigma 公司，兔抗大鼠GFAP多克隆抗體、小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor? 488)、驢抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 647)均購(gòu)自abcom公司。

1.2 方法

1.2.1 SE大鼠模型的制備

采用匹羅卡品誘導(dǎo)SE大鼠模型[8]，當(dāng)大鼠出現(xiàn)Racine標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ級(jí)及以上發(fā)作后開始計(jì)時(shí)，如果30 min后癲癇發(fā)作在Ⅳ級(jí)以下，需繼續(xù)追加匹羅卡品(50 mg/kg)腹腔注射一次，如經(jīng)上述操作癇性發(fā)作仍未達(dá)到Ⅳ級(jí)以上，則將其剔除。出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作持續(xù)60 min后予腹腔注射地西泮(10 mg/kg，5 mg/mL)終止發(fā)作。對(duì)照組大鼠給予同等量的生理鹽水腹腔注射代替溴甲阿托品、匹羅卡品和地西泮。

1.2.2 組織切片制備

在模型制備成功7 d后將兩組大鼠麻醉，4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，結(jié)束后快速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛后固定24 h，然后用10%、20%、30%的梯度蔗糖脫水，修剪腦組織后OCT膠包埋，然后再冰凍切片機(jī)冠狀切片，片厚10 μm，將腦片烘干后-4 ℃保存。

1.2.3 盲法免疫熒光組織染色

上述冰凍切片由課題設(shè)計(jì)者獨(dú)立編號(hào)，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者保密。

實(shí)驗(yàn)操作者取出冰凍切片后以正常山羊血清封閉，兔抗大鼠GFAP抗體、小鼠抗大鼠nestin抗體混合稀釋孵育，再以山羊抗小鼠IgG H&L 、驢抗兔IgG H&L二抗混合孵育，每步均以PBS洗片，水溶性防淬滅封片劑封片后立刻熒光顯微鏡觀察拍攝海馬區(qū)GFAP、nestin的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠SE發(fā)作情況

SE組大鼠在給予匹羅卡品后(1.67±0.19)min左右出現(xiàn)流誕等外周膽堿能反應(yīng)；在(6.85±0.72)min左右出現(xiàn)面肌痙攣；在(15.61±0.85)min左右出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作，并呈SE出現(xiàn)，有兩只在發(fā)作時(shí)間未達(dá)到60 min時(shí)即死亡。對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。

2.2 兩組大鼠海馬區(qū)GFAP免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù)結(jié)果

觀察兩組大鼠在造模成功7 d后海馬各區(qū)GFAP免疫熒光染色(紅色)結(jié)果，選取相同部位拍照(圖1見封二)：對(duì)照組大鼠海馬各區(qū)GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞染色均一，突起分布連續(xù)、長(zhǎng)短不一。SE組大鼠海馬各區(qū)GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞胞體及突起肥大，部分呈點(diǎn)、片狀染色，與胞體連接的突起呈斷點(diǎn)狀連接。計(jì)數(shù)兩組大鼠海馬各區(qū)GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞染色示SE組大鼠海馬各區(qū)GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組大鼠顯著增加。結(jié)果評(píng)見表1。

表1 SE組與對(duì)照組大鼠海馬各區(qū)GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè))

2.3 兩組大鼠海馬區(qū)nestin免疫熒光染色及與GFAP共標(biāo)結(jié)果

觀察兩組大鼠在造模成功7 d后海馬不同分區(qū)nestin免疫熒光染色(綠色)結(jié)果，選取相同部位拍照(圖2見封二)：對(duì)照組大鼠海馬nestin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞只少量出現(xiàn)在齒狀回顆粒層，胞體呈較小的橢圓形；而SE組大鼠海馬nestin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞大量、廣泛分布在海馬各區(qū)，細(xì)胞形態(tài)與星形膠質(zhì)細(xì)胞相似；與GFAP免疫熒光染色(紅色)共標(biāo)結(jié)果顯示(圖3見封二)：對(duì)照組大鼠nestin免疫熒光染色(綠色)陽(yáng)性細(xì)胞與GFAP免疫熒光染色(紅色)陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)共標(biāo)重疊(黃色)；而SE組大鼠nestin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞與GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞大量重疊(黃色)(白色箭頭所示)。

3 討論

SE是臨床常見的醫(yī)學(xué)危急癥之一，有較高的死亡率和致殘率[9-11]。SE啟動(dòng)了一系列病理生理?yè)p害機(jī)制，致使神經(jīng)組織缺血缺氧，引起膠質(zhì)增生、突觸重建等[12-13]。既往研究證實(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目及功能改變?cè)赟E對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[14]。本研究采用匹羅卡品誘導(dǎo)SE大鼠模型，利用盲法免疫熒光組化檢測(cè)海馬各區(qū)nestin表達(dá)與GFAP的相關(guān)性，探討SE后海馬區(qū)膠質(zhì)增生、膠質(zhì)瘢痕形成的機(jī)制。本研究結(jié)果表明，SE 7 d 后海馬各區(qū)GFAP 免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著增加，且胞體及突起明顯肥大，染色呈團(tuán)塊狀；nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著增加，廣泛分布于海馬各區(qū)，與增生肥大的GFAP 免疫陽(yáng)性細(xì)胞大量共標(biāo)重疊；而在對(duì)照組，僅在海馬齒狀回顆粒層存在少量nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞，與GFAP 免疫陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)共標(biāo)重疊。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)目最多、分布最廣的膠質(zhì)細(xì)胞[15]。既往大量研究證實(shí)癲癇發(fā)作可引起海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體肥大、數(shù)目增加[16-18]。這與本研究結(jié)果是一致的。星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的異常，會(huì)對(duì)海馬區(qū)離子和神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡造成破壞，從而導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增高，進(jìn)一步引起星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，造成海馬硬化、膠質(zhì)瘢痕形成，對(duì)海馬區(qū)功能造成不良的影響[5]。

nestin是一種中間絲蛋白，特異性地表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)，既往被用作NSC的標(biāo)記蛋白[19]，具有維持正常神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的功能。nestin具有胚胎細(xì)胞特異性，出生后其表達(dá)會(huì)很快降低甚至消失[20]，其后僅少量表達(dá)于海馬齒狀回顆粒下區(qū)和側(cè)腦室下區(qū)[21]。既往研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時(shí)(癲癇發(fā)作、腦缺血缺氧、腦損傷)會(huì)出現(xiàn)nestin的重新大量表達(dá)[22-24]，且nestin表達(dá)的高峰出現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后第7天[25]，但引起nestin重新表達(dá)的病理機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者猜測(cè)其表達(dá)增加是NSC增殖及NSC遷移的結(jié)果。但Tsyba等[26]發(fā)現(xiàn)腦卒中后創(chuàng)傷相關(guān)區(qū)域nestin表達(dá)增加與肥大增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度表達(dá)具有密切聯(lián)系。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠SE 7 d后出現(xiàn)nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著增加，并廣泛分布于海馬各區(qū)，與肥大增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞存在大量共標(biāo)重疊； 而對(duì)照組nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞體較小，呈橢圓形，僅在海馬齒狀回顆粒層邊緣少量表達(dá)，與星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)共標(biāo)重疊。

筆者認(rèn)為這種SE后海馬區(qū)大量廣泛表達(dá)的nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞可能不僅是NSC增殖分化及海馬區(qū)NSC遷徙的結(jié)果，而更多是與SE致腦損傷引起星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化有關(guān)，具有胚胎細(xì)胞的特性，可能與癲癇發(fā)作后海馬區(qū)神經(jīng)元丟失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及膠質(zhì)瘢痕形成有一定的聯(lián)系。但本研究中只采用盲法免疫熒光共標(biāo)觀察nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞增殖與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系，提出SE后nestin表達(dá)增加與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖密切相關(guān)，沒有對(duì)nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能進(jìn)行相關(guān)研究，這是我們下一步的研究方向。

總之，SE后7 d小鼠海馬各區(qū)出現(xiàn)nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞大量廣泛表達(dá)，可能與SE后膠質(zhì)瘢痕的形成和神經(jīng)可塑性的改變有關(guān)。進(jìn)一步了解nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞大量出現(xiàn)的機(jī)制，尋求可靠的干預(yù)手段對(duì)治療SE有重要的意義。