水牛卵泡顆粒細胞對卵母細胞體外成熟的影響

張 俊，石德順，陸鳳花

(廣西大學 動物科學技術學院 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530000)

卵母細胞體外成熟是體外胚胎生產的關鍵環(huán)節(jié)，但目前體外成熟的卵母細胞與體內成熟的卵母細胞相比，普遍存在成熟率、受精率低以及后續(xù)胚胎發(fā)育質量差等問題[1-2]，因此，致力于研究卵母細胞體外成熟效率的提高是一項十分有意義的工作，也是近些年科研工作者研究的熱點和難點。卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系是制約卵母細胞體外成熟效率的關鍵因素[3]，與卵母細胞體內成熟的卵泡環(huán)境相比，卵母細胞體外成熟體系遠不能滿足卵母細胞成熟發(fā)育所需，因而，盡可能模擬卵母細胞體內成熟環(huán)境，不斷完善卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系，是研究卵母細胞體外成熟的重點工作。

卵母細胞體內成熟的完成是在卵泡中進行的，因此，卵泡細胞可能對卵母細胞成熟效果產生重大影響[4]。卵泡細胞主要包括顆粒細胞、內膜細胞和卵丘細胞，目前有關顆粒細胞[5-9]、內膜細胞[10]和卵丘細胞[11-19]對卵母細胞體外成熟的影響已有諸多報道。但有關顆粒細胞對卵母細胞體外成熟影響的研究結果說法不一，有研究指出顆粒細胞能提高豬[20]、綿羊[21]和人[22]卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育，也有研究表明顆粒細胞及其條件液能抑制牛卵母細胞體外成熟及早期胚胎的發(fā)育[10]。但顆粒細胞對水牛卵母細胞體外成熟的影響，目前尚未見有報道。本研究通過對卵母細胞體外成熟率和早期孤雌胚胎發(fā)育能力的測定，主要研究顆粒細胞條件液和單層顆粒細胞對水牛卵母細胞體外成熟的影響，以期從顆粒細胞共培養(yǎng)的角度進一步完善水牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)系統。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制TCM199和血清(Gibco公司)， 其他試劑無特別說明均購自Sigma公司。清洗液(CCM)：TCM199+5 mmol/L NaHCO3+5 mmol/L Hepes+2%～3% 發(fā)情牛血清(oestrous cow serum，OCS)；成熟液(M)：TCM199+26.2 mmol/L NaHCO3+5 mmol/L Hepes+5% OCS+0.1 mg/L FSH；胚胎培養(yǎng)液(CM)：TCM199+26.2 mmol/L NaHCO3+5 mmol/L Hepes+5% OCS；離子霉素溶液：CM液+5 μmol/L離子霉素；6-DMAP溶液：CM液+2 mmol/L 6-DMAP。CCM液、M液和CM液均添加60 mg/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素，并用0.22 μm微孔濾膜過濾器除菌。

1.2 材料來源及處理

1.2.1水牛卵母細胞的收集 所用卵巢從南寧市屠宰場收集中國沼澤型水牛卵巢，收集后放置盛有37℃生理鹽水的保溫瓶，確保2～3 h內送達實驗室。用眼科剪刀將卵巢周圍的脂肪組織去除，用一次性12號10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡的卵泡液，將卵泡液置于60 mm玻璃皿；體式顯微鏡下撿出卵丘卵母細胞復合體(COCs)，用CCM液清洗干凈，放入裝有1.5 mL M液的玻璃皿進行成熟，注意只選取卵丘細胞層完整和胞質均勻的卵母細胞進行后續(xù)試驗。

1.2.2水牛顆粒細胞的收集以及顆粒細胞條件液的獲取 用生理鹽水清洗卵巢后，用12號10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡(大卵泡閉鎖比例較高，小卵泡發(fā)育程度較低)的卵泡液，將抽取的卵泡液用孔徑40 μm細胞篩過濾，并收集到離心管，1 200 r/min 離心5 min，棄上清后用PBS重懸清洗細胞，離心再用PBS重懸，如此反復1次，最后將清洗干凈的顆粒細胞接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)(圖1)。

圖1 顯微鏡下水牛顆粒細胞(GC)圖(第0代至第3代)

選取第1代到第3代生長狀態(tài)良好水牛顆粒細胞，傳至12孔板5個孔中，確保每孔細胞匯合度至少70%，從傳代接種開始計時，每24 h收集1個孔的培養(yǎng)基，如此連續(xù)收集5 d，其收集液體為顆粒細胞傳代接種后1～5 d的顆粒細胞條件液(GCCM)。在進行顆粒細胞條件液收集期間，每孔細胞均不更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 水牛卵母細胞的體外成熟以及孤雌激活收集的水牛COCs經清洗干凈后，置于放有1.5 mL M液玻璃皿中，在5% CO2、38.5℃培養(yǎng)箱中成熟24 h。卵母細胞成熟后，用吸管反復抽打，盡可能吹掉卵母細胞周圍擴展的卵丘細胞，然后對成熟好的卵母細胞進行孤雌激活。

卵母細胞體外成熟22～24 h，吹掉卵母細胞周圍卵丘細胞，用CM液清洗3遍，用5 μmol/L離子霉素溶液(ionomycin)激活5 min；在含有2 mmol/L 6-DMAP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h，再用CM液清洗3次，移至含有黃牛卵丘細胞單層的微滴培養(yǎng)盤中進行培養(yǎng)，觀察記錄卵裂數和囊胚發(fā)育數。

1.4 水牛卵母細胞體外成熟率和早期胚胎發(fā)育潛力的評定卵母細胞體外成熟24 h后，吹掉卵母細胞周圍卵丘細胞，在體式顯微鏡下觀察統計卵母細胞的第一極體排出情況。卵母細胞孤雌激活后，移至有黃牛卵丘單層細胞的微滴培養(yǎng)盤后，24 h記錄統計分裂數，5～8 d記錄統計囊胚數，以孤雌激活后發(fā)育的卵裂率和囊胚率來評定早期胚胎的發(fā)育潛力。孤雌激活后所使用胚胎培養(yǎng)盤為底部鋪有黃牛卵丘單層細胞的微滴培養(yǎng)盤，該培養(yǎng)盤需使用前2 d制備，培養(yǎng)胚胎時，注意每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.5 水牛卵母細胞體外成熟過程動態(tài)變化實時追蹤卵母細胞從卵泡液中撿出清洗干凈后，從放入成熟液起開始計時，使用Bio Tec Cytation 5(CytationTM5)細胞成像多功能檢測系統每隔2 h對卵母細胞卵丘擴展和成熟情況進行實時追蹤拍照，以記錄卵母細胞體外成熟過程的動態(tài)變化情況。

1.6 試驗設計

1.6.1試驗1 主要探討成熟培養(yǎng)液中添加不同收集時間顆粒細胞條件液(GCCM)對水牛卵母細胞體外成熟以及早期孤雌胚胎發(fā)育的影響。將同一批次水牛COCs分別在添加不同收集時間(0，1，2，3，4，5 d)的GCCM(各組GCCM添加比例均為10%)成熟液中進行體外成熟24 h，觀察卵母細胞的成熟率(第一極體排出率)，然后將卵母細胞進行孤雌激活，觀察早期胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎卵裂率和囊胚率。

1.6.2試驗2 主要探討成熟培養(yǎng)液中不同添加比例GCCM對水牛卵母細胞體外成熟以及早期孤雌胚胎發(fā)育的影響。將同一批次水牛COCs分別在添加不同比例GCCM(0%，5%，10%，20%，40%)(各組GCCM收集時間均為2 d)的成熟液中進行體外成熟24 h，觀察卵母細胞的成熟率(第一極體排出率)，然后將卵母細胞進行孤雌激活，觀察早期胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎卵裂率和囊胚率。

1.6.3試驗3 主要探討顆粒細胞在不同狀態(tài)下對水牛卵母細胞體外成熟以及早期孤雌胚胎發(fā)育的影響。試驗分3組：(1)M液(對照)；(2)M液+GC單層細胞；(3)M液+GCCM。將同一批次水牛COCs分別在上述3組中進行體外成熟24 h，觀察卵母細胞的成熟率(第一極體排出率)，然后將卵母細胞進行孤雌激活，觀察早期胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎卵裂率和囊胚率。

1.6.4試驗4 主要探討顆粒細胞在不同狀態(tài)下對水牛卵母細胞體外成熟過程動態(tài)變化的影響。試驗分3組：(1)M液(對照)；(2)M液+GC單層細胞；(3)M液+GCCM。從放入成熟液開始計時，每隔2 h對卵母細胞動態(tài)變化進行跟蹤拍照記錄。

1.7 數據分析利用SPSS 22.0軟件對統計數據進行處理并分析差異顯著性，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，每個試驗至少5次生物學重復(n=5)，即同一試驗處理中用相互獨立的水牛卵母細胞進行至少5次重復。

2 結果

2.1 成熟培養(yǎng)液添加不同收集時間GCCM對水牛卵母細胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響水牛COCs分別在添加不同收集時間GCCM(0，1，2，3，4，5 d)的成熟液中培養(yǎng)24 h后，觀察卵母細胞成熟情況。結果表明(表1)：相對于0 d GCCM對照組，1，2，3 d GCCM處理組水牛卵母細胞體外成熟率沒有顯著性差異(P>0.05)，但4 d和5 d GCCM處理組的成熟率顯著降低(P<0.05)；由此說明，GCCM的適宜收集時間點為顆粒細胞接種后1～3 d。

表1 不同收集時間GCCM對水牛卵母細胞體外成熟率的影響

水牛COCs分別在添加不同收集時間GCCM(0，1，2，3，4，5 d)的成熟液中培養(yǎng)24 h后進行孤雌激活，觀察胚胎發(fā)育情況。結果發(fā)現(表2)：2 d GCCM處理組的水牛卵母細胞卵裂率與囊胚率均顯著高于0 d GCCM對照組(P<0.05)，由此說明，收集2 d GCCM添加到成熟液中最有利于水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育。

表2 不同收集時間GCCM對水牛卵母細胞體外成熟后早期胚胎發(fā)育的影響

2.2 成熟培養(yǎng)液中不同添加比例GCCM對水牛卵母細胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響水牛COCs分別在添加不同比例GCCM(0%，5%，10%，20%，40%)的成熟液中培養(yǎng)24 h后，觀察卵母細胞成熟情況。結果顯示(表3)：相對0% GCCM對照組，5%，10% GCCM處理組水牛卵母細胞體外成熟率沒有顯著性差異(P>0.05)，但20%，40% GCCM處理組的成熟率顯著降低(P<0.05);由此說明，GCCM添加比例以不超過20%為宜。

表3 不同添加比例GCCM對水牛卵母細胞體外成熟率的影響

水牛COCs分別在不同添加比例GCCM(0%，5%，10%，20%，40%)的成熟液中培養(yǎng)24 h后進行孤雌激活，觀察胚胎發(fā)育情況。結果發(fā)現(表4)：20% GCCM處理組的水牛卵母細胞卵裂率與囊胚率均顯著高于0% GCCM對照組(P<0.05)，由此說明，收集2 d GCCM添加到成熟液中最有利于水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育。

綜合上述試驗結果考慮，添加收集時間點2 d、添加比例20% GCCM到水牛卵母細胞成熟液中最為合適，最有利于水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育。

表4 不同添加比例GCCM對水牛卵母細胞體外成熟后早期胚胎發(fā)育的影響

2.3 顆粒細胞(GC)在不同狀態(tài)下對水牛卵母細胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響水牛COCs分別在GC不同狀態(tài)(M液即對照，GC單層細胞，2 d+20% GCCM)的成熟液中培養(yǎng)24 h后，觀察卵母細胞成熟情況。結果表明(表5)：相對于M液對照組，GCCM處理組水牛卵母細胞體外成熟率沒有顯著性差異(P>0.05)，但底部鋪有GC單層細胞處理組水牛卵母細胞的成熟率顯著低于對照組(P<0.05)。

水牛COCs分別在GC不同狀態(tài)(M液，GC單層細胞，2 d+20% GCCM)的成熟液中培養(yǎng)24 h后進行孤雌激活，觀察胚胎發(fā)育情況。結果發(fā)現(表6)：GCCM處理組的水牛卵母細胞卵裂率與囊胚率均顯著高于對照組(P<0.05)，但底部鋪有GC單層細胞的處理組卵裂率和囊胚率顯著低于對照組(P<0.05)；由此說明，成熟液中底部鋪有GC單層細胞對水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育具有抑制作用，而GCCM添加到成熟液對水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育具有促進作用。

表5 顆粒細胞(GC)在不同狀態(tài)下對水牛卵母細胞體外成熟率的影響

表6 顆粒細胞(GC)在不同狀態(tài)下對水牛卵母細胞體外成熟后早期胚胎發(fā)育的影響

2.4 顆粒細胞(GC)在不同狀態(tài)下對水牛卵母細胞體外成熟過程動態(tài)變化的影響水牛COCs分別在GC不同狀態(tài)(M液，GC單層細胞，2 d+20% GCCM)的成熟液培養(yǎng)24 h過程中，使用CytationTM5細胞成像多功能檢測系統實時追蹤水牛卵母細胞體外成熟過程中細胞動態(tài)變化情況，特別是卵母細胞卵丘擴展和細胞體積變大情況等。從追蹤水牛卵母細胞動態(tài)變化圖可知(圖2)：從0～24 h，對照組水牛卵母細胞基本從4 h起卵母細胞體積開始變大，周圍卵丘開始擴展，從8 h起卵母細胞體積迅速增大，卵丘細胞擴展速度加快，至16 h時，卵母細胞體積基本達到最大，卵丘細胞基本擴展完成，從16～24 h卵母細胞基本不發(fā)生變化。相對M液對照組，GCCM處理組水牛卵母細胞體積變大和卵丘擴展情況基本和對照組相符，但GCCM處理組卵母細胞卵丘擴展更開，卵母細胞體積也變得更大。但GC單層細胞處理組卵母細胞體積變大和卵丘擴展情況與對照組不同，動態(tài)變化圖片顯示，GC單層細胞組卵母細胞基本從6 h起卵母細胞體積開始變大，周圍卵丘開始擴展，從10 h時卵母細胞體積迅速變大，卵丘細胞擴展快速變大，至16 h時卵母細胞體積變大和卵丘擴展基本完成。從水牛卵母細胞體外成熟過程動態(tài)變化，GCCM、GC單層細胞處理組與對照組的區(qū)別推測，GCCM促進水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育以及GC單層細胞抑制水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育，可能是因為GC細胞不同狀態(tài)影響了水牛卵母細胞體外成熟過程中卵丘擴展和卵母細胞體積變化，進而引起卵母細胞內部的生理代謝發(fā)生改變，最終影響了卵母細胞的體外成熟。

圖2 顆粒細胞在不同狀態(tài)下對水牛卵母細胞體外成熟動態(tài)變化的影響

3 討論

卵母細胞的體外成熟是卵母細胞逐步獲得恢復減數分裂能力和為早期胚胎發(fā)育做好準備的過程，卵母細胞的體外成熟會直接影響到卵母細胞后續(xù)的受精和胚胎發(fā)育能力[23]。卵母細胞獲得好的成熟能力，不僅細胞核要成熟，細胞質亦要同步成熟。卵母細胞細胞核成熟通常以第一極體排出率為直接評定指標，細胞質成熟一般比較難以界定，通常以卵母細胞后續(xù)早期胚胎發(fā)育的卵裂率和囊胚率為間接評定指標[24]。目前，卵母細胞體外成熟存在的主要問題是細胞核和細胞質成熟不同步問題，與卵母細胞成熟體內相比，體外卵母細胞成熟容易出現細胞核先成熟，細胞質成熟滯后現象[25]，這直接導致體外成熟卵母細胞質量差、受精率低和胚胎發(fā)育質量差等問題。

由于卵母細胞在體內成熟是處于卵泡液環(huán)境，并被周圍顆粒細胞所包裹，因此顆粒細胞對卵母細胞的成熟起到重要作用，但卵母細胞體外成熟時，顆粒細胞是否對卵母細胞成熟起作用，是否有助于解決卵母細胞體外成熟存在核質不同步問題，這些研究目前已有諸多報道，但研究結果不盡一致。ADELDUST等[21]研究發(fā)現，顆粒細胞共培養(yǎng)能提高綿羊卵母細胞體外成熟率和胚胎發(fā)育卵裂率，說明顆粒細胞可提高綿羊卵母細胞的細胞核成熟和細胞質成熟。對豬的研究表明，顆粒細胞能提高冷凍復蘇后未成熟卵母細胞的細胞核成熟和細胞質成熟[20]。在人上同樣也有研究指出，顆粒細胞可提高人卵母細胞體外成熟率和后續(xù)胚胎發(fā)育囊胚率[22]。石德順等[10]研究表明，顆粒細胞單層細胞對牛卵母細胞體外成熟后的卵裂率和囊胚率沒有顯著性影響，但顆粒細胞的條件液能明顯抑制牛卵母細胞體外成熟后早期胚胎發(fā)育的卵裂率。本研究對水牛的試驗結果表明，顆粒細胞條件液和單層細胞對水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響結果不同，顆粒細胞條件液能顯著提高水牛卵母細胞體外成熟的細胞核成熟和細胞質成熟，但顆粒細胞單層細胞可顯著抑制水牛卵母細胞體外成熟的細胞核成熟和細胞質成熟，因此，本研究結果與其他研究結果有異同。

對豬、綿羊和人的試驗結果均顯示，顆粒細胞單層細胞能提高卵母細胞體外成熟，但本研究在水牛上未能證實顆粒細胞的這一作用效果。分析原因可能是，顆粒細胞的不同狀態(tài)對水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響有很大差異。由于本研究表明顆粒細胞條件液能提高水牛卵母細胞體外成熟，但單層顆粒細胞則抑制成熟，推測顆粒細胞不同狀態(tài)對水牛卵母細胞體外成熟的動態(tài)變化有巨大影響。本研究使用CytationTM5細胞成像多功能檢測系統實時追蹤水牛卵母細胞體外成熟過程中細胞動態(tài)變化也證實了這一點，顆粒細胞單層細胞能明顯抑制水牛卵母細胞體外成熟過程中卵母細胞周圍卵丘擴展和卵母細胞體積變大速度，與對照組相比，使水牛卵母細胞周圍卵丘開始擴展延遲約2 h，且卵母細胞體積變大速度減慢，這表明，從卵母細胞成熟過程的動態(tài)變化可知，顆粒細胞單層細胞不利于水牛卵母細胞體外成熟以及后續(xù)胚胎發(fā)育潛力的獲得。至于顆粒細胞在不同狀態(tài)下，具體影響了卵母細胞體外成熟過程中內部哪些生理過程或者代謝活動，有待進一步研究。

有研究也指出，顆粒細胞能分泌多種生長因子到卵泡液中[26-29]，如卵母細胞成熟抑制因子(OMI)等，精密和系統調控卵母細胞成熟的整個過程。張美佳等[30]研究提出，顆粒細胞分泌的卵母細胞成熟抑制因子就是C型鈉肽(CNP)，該因子是由顆粒細胞分泌，作用于卵母細胞周圍卵丘細胞上的受體，進而維持卵母細胞減數分裂的阻滯，提高卵母細胞成熟效果。本研究所使用顆粒細胞條件液能顯著提高水牛卵母細胞體外成熟，那么收集使用的顆粒細胞條件液中究竟有哪些生長因子和代謝產物，有哪些生長因子和代謝產物在起作用，又是通過哪些途徑在起作用，這是我們所感興趣和下一步重點研究的內容。

目前，高通量測序技術正蓬勃發(fā)展，使用代謝組學和蛋白組學新技術解決卵母細胞成熟的問題是未來發(fā)展趨勢，特別是研究清楚卵母細胞成熟中顆粒細胞究竟能分泌哪種細胞因子，在卵母細胞體外成熟過程中如何具體起作用，這對于解析清楚卵母細胞成熟過程的具體調控機理具有重要的指導意義。