黑楊受拉木纖維細胞組分及孔隙分布拉曼光譜成像數(shù)據(jù)研究

金 枝,馬建鋒,付躍進*

1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所，北京 100091 2. 國際竹藤中心，竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，北京 100102

引 言

受拉木是指闊葉木發(fā)生傾斜、彎曲和偏冠時，樹干和枝條上方受拉伸應(yīng)力部位的木質(zhì)部[1]，在天然闊葉林和楊樹(Populussp.)、桉樹(Eucalyptussp.)等人工速生林中均有存在。與正常木相比，受拉木在微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能方面存在一定差異。在微觀結(jié)構(gòu)方面，受拉木中形成的具有特殊形態(tài)和化學(xué)組成的膠質(zhì)層被認為是造成受拉木與正常木之間力學(xué)性能差異的主要原因。受拉木的縱向硬度高達35 GPa，明顯高于正常木(平均為18 GPa)，而弦向和徑向硬度較低，分別為430和1 150 MPa，該數(shù)值在正常木中分別達到530和1 500 MPa[2]。此外，膠質(zhì)層產(chǎn)生的高拉伸應(yīng)力及縱向干縮率[3]會降低木材的加工性能，例如在干燥過程中出現(xiàn)的翹曲和開裂，以及在切削過程中引起的夾鋸和板面起毛等缺陷嚴(yán)重降低了木材的利用效率。

鑒于受拉木膠質(zhì)層獨特的壁層構(gòu)造及其對木材相關(guān)性能的影響，研究者們針對膠質(zhì)層的化學(xué)組成、解剖結(jié)構(gòu)和孔隙結(jié)構(gòu)等開展了一系列研究。膠質(zhì)層形成于纖維細胞次生壁內(nèi)側(cè)，其化學(xué)組分主要包含纖維素[4]，木聚糖[5]，阿拉伯半乳聚糖和RG-I型果膠[6]等。其中，膠質(zhì)層纖維素作為“骨架”物質(zhì)，形成高定向和高結(jié)晶形態(tài)的微纖絲近乎平行于細胞主軸排列[7]，微纖絲之間和微纖絲非結(jié)晶區(qū)存在的納米級孔隙賦予了膠質(zhì)層豐富的孔隙結(jié)構(gòu)[8-10]。然而，現(xiàn)有研究針對膠質(zhì)層與細胞壁其他各層級化學(xué)組分濃度梯度變化、分布相關(guān)性及孔隙分布差異鮮有報道，本研究擬采用高空間分辨率的共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，通過原位成像及圖像疊加對黑楊受拉木與對應(yīng)木各層級區(qū)域化學(xué)及相關(guān)性進行直觀的比較研究，特征峰積分原位成像揭示各層級孔隙分布差異，從而深化對受拉木特殊理化特性及形成機制的理解，為提升應(yīng)力木加工質(zhì)量、實現(xiàn)木材高值高效利用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 原料

十年生傾斜生長的黑楊(Populusnigra)采自西北農(nóng)林科技大學(xué)植物園，樹高16 m、胸徑14.5 cm，枝下高7.3 m。在距基部5 m處莖部傾斜部分的上端及下端分別截取受拉木及對應(yīng)木木塊(15 mm×5 mm×10 mm)。蒸餾水反復(fù)沖洗后，利用滑走切片機(Leica RM2010R,Germany)切取厚度為20 μm的樣品橫切面?zhèn)溆?，切片時所使用的刀片為Leica 810。

1.2 透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)

利用單面刀片將受拉木與對應(yīng)木樣品塊切成火柴棒大小，經(jīng)梯度丙酮逐級脫水，進行低黏度Spur樹脂浸漬、包埋及固化。采用超薄切片機(Leica EM-UC6)連續(xù)切取90 nm的超薄切片，然后置于過濾后的1%(w/v)高錳酸鉀水溶液染色1 min，蒸餾水反復(fù)沖洗，自然晾干后在JEM-1230(JEOL)透射電子顯微鏡下進行顯微成像，成像時加速電壓為80 kV。

1.3 共聚焦顯微拉曼光譜

將獲取的20 μm厚橫切面切片置于載玻片上自然晾干后，采用重水(D2O)(原子百分比99.9%，Sigma-Aldrich)預(yù)浸漬1 h后，蓋薄片封片，采用共聚焦顯微拉曼光譜儀(LabRamXplora,Horiba Jobin Yvon)進行光譜采集。激發(fā)波長532 nm，到達樣品的激光功率為8 mW。測試時光柵為300 mm-1，狹縫寬度為100 μm，掃描步距為0.5 μm，單點光譜采集時間為1.5 s，光譜測定范圍為3 100～300 cm-1，光譜分辨率為2 cm-1。光譜采集時采用100倍油鏡(Plan N 100×，Oil，NA=1.0)，獲得的數(shù)據(jù)利用LabSpec6軟件采用線性偏最小二乘法進行批量矩陣成像數(shù)據(jù)基線校正后歸一化處理，進而實現(xiàn)特征峰峰面積成像疊加。

2 結(jié)果與討論

2.1 受拉木與對應(yīng)木細胞壁分層結(jié)構(gòu)

對比對應(yīng)木[圖1(a)]與受拉木[圖1(b,c)]TEM圖像發(fā)現(xiàn)兩者的纖維細胞壁分層結(jié)構(gòu)存在明顯差異，主要體現(xiàn)在次生壁的亞層組成及厚度差異。與對應(yīng)木次生壁三亞層結(jié)構(gòu)(外層S1(0.5～1.0 μm)，中層S2(3.0～5.0 μm)，內(nèi)層S3(0.05 ～0.12 μm))不同，受拉木的纖維次生壁僅分為S1(0.2～0.5 μm)及S2(2.0～3.5 μm)且厚度較小，在其次生壁S2內(nèi)側(cè)還含有電子密度較低的膠質(zhì)層(gelatinous layer,GL)，該層厚度約為1.2～2.5 μm。以上差異反映出受拉木纖維細胞因抵抗拉伸應(yīng)力而產(chǎn)生的形變。

圖1 對應(yīng)木(a)與受拉木(b，c)纖維細胞分層結(jié)構(gòu)TEM圖像Fig.1 TEM images showing the layering structure of opposite wood (a), tension wood (b)and higher magnification of tension wood (c)

2.2 受拉木細胞壁化學(xué)組分拉曼光譜歸屬

本研究中所使用的顯微拉曼光譜儀的空間分辨率約為0.5 μm，在受拉木細胞角隅胞間層，次生壁以及膠質(zhì)層能夠準(zhǔn)確地抽取相應(yīng)區(qū)域的平均拉曼光譜(圖2)，涉及特征峰主要出現(xiàn)在2 942 cm-1(纖維素、半纖維素及木質(zhì)素—CH非對稱伸縮振動)，2 897 cm-1(碳水化合物—CH，—CH2伸縮振動)，2 476 cm-1(O—D伸縮振動)，1 598 cm-1(木質(zhì)素芳香環(huán)對稱伸縮振動)，1 094 cm-1(纖維素C-O-C非對稱伸縮振動)，904 cm-1(木聚糖)等波數(shù)區(qū)[11-13]。

2.3 受拉木與對應(yīng)木細胞壁拉曼光譜成像

2.3.1 細胞壁形態(tài)及主要組分分布相關(guān)性

通過對2 942 cm-1纖維素、半纖維素及木質(zhì)素—CH非對稱伸縮振動特征峰進行積分，獲得的拉曼光譜成像圖中受拉木[圖3(a)]與對應(yīng)木[圖3(b)]纖維細胞角隅胞間層(CCML)、復(fù)合胞間層(CML)、次生壁(S)及受拉木中特有的膠質(zhì)層(GL)區(qū)域清晰可見，且受拉木部分纖維細胞的細胞腔區(qū)域發(fā)生了明顯的形變[圖3(a)中三角形所示細胞]。

圖2 受拉木纖維細胞不同形態(tài)區(qū)域拉曼光譜比較Fig.2 Average Raman spectra extracted from variousmorphological regions of tension wood

圖3 受拉木(a)與對應(yīng)木(b)纖維細胞形態(tài)拉曼光譜成像Fig.3 Raman images showing the cell wall morphology of tension wood (a) and opposite wood (b)

作為闊葉木細胞壁中的主要組成成分，纖維素構(gòu)建了細胞壁的“骨架”，半纖維素及木質(zhì)素分別構(gòu)成了細胞壁的基體物質(zhì)和結(jié)殼物質(zhì)，并填充于纖維素“骨架”之中。本研究分別對三大主要組分進行特征峰1 094 cm-1(纖維素)、1 598 cm-1(木質(zhì)素)、904 cm-1(半纖維素木聚糖)峰面積積分成像，并進行兩兩相互疊加探索其空間分布相關(guān)性。疊加的木質(zhì)素與纖維素，木質(zhì)素與木聚糖的顯微拉曼光譜成像圖表明三大組分在受拉木和對應(yīng)木細胞壁不同形態(tài)區(qū)域中均有分布，但各組分之間的分布相關(guān)性存在一定差異。受拉木膠質(zhì)層沉積了高濃度的纖維素(紅)并存在一定濃度分布較均一的木聚糖(綠)。在次生壁區(qū)域，纖維素在受拉木每對應(yīng)木中呈現(xiàn)均一分布但濃度明顯低于膠質(zhì)層； 木聚糖在受拉木次生壁中分布濃度普遍高于對應(yīng)木，且在次生壁臨近胞間層一側(cè)及胞間層中更為集中； 木質(zhì)素僅在受拉木緊鄰胞間層的次生壁區(qū)域呈現(xiàn)一定濃度分布，這可能是細胞壁通過木質(zhì)素的沉積從而增加剛度以抵抗外界拉伸應(yīng)力而導(dǎo)致的。在胞間層區(qū)域，受拉木和對應(yīng)木的主要成分均為木聚糖和木質(zhì)素，其中，木聚糖在受拉木中的分布濃度普遍高于對應(yīng)木，而木質(zhì)素在兩者細胞角隅胞間層濃度最高。受拉木和對應(yīng)木不同形態(tài)區(qū)域三大組分濃度差異詳見表1?？梢钥闯觯芾驹谛纬蛇^程中對纖維素與木聚糖的分布濃度產(chǎn)生了較大的影響，在整個細胞壁形態(tài)區(qū)域中，兩者較對應(yīng)木均呈現(xiàn)增強的趨勢，這可能與拉伸應(yīng)力作用下纖維細胞壁中纖維素和半纖維素等鏈狀分子的形變與分子間距的縮小而導(dǎo)致的單位面積內(nèi)分子濃度增加有關(guān)。

表1 受拉木和對應(yīng)木不同形態(tài)區(qū)域三大組分濃度差異

圖4 受拉木(a,b)和對應(yīng)木(c,d)纖維細胞壁中木聚糖(綠)、木質(zhì)素(藍)及纖維素(紅)空間分布相關(guān)性拉曼光譜疊加圖

2.3.2 相鄰細胞壁線掃描分析

為了揭示受拉木與對應(yīng)木纖維細胞壁主要組分沿各自相鄰細胞壁的濃度梯度變化規(guī)律，本研究針對木質(zhì)素芳香環(huán)伸縮振動(1 598 cm-1)、纖維素C—O—C非對稱振動(1 094 cm-1)和木聚糖C—O—C(904 cm-1)進行相鄰細胞壁線掃描(圖5)，所提取的線掃描區(qū)域如圖4(a)和(c)中所示虛線區(qū)域。從圖中可以看出沿著細胞腔向復(fù)合胞間層區(qū)域過渡時，受拉木與對應(yīng)木木質(zhì)素、纖維素和木聚糖濃度均呈現(xiàn)明顯的區(qū)域選擇性及梯度變化規(guī)律，與表1結(jié)果一致。在細胞壁沿膠質(zhì)層向復(fù)合胞間層方向，受拉木纖維素濃度呈下降趨勢，木質(zhì)素和木聚糖濃度呈上升趨勢； 在細胞壁沿次生壁向復(fù)合胞間層方向，對應(yīng)木纖維素濃度呈下降趨勢，木質(zhì)素濃度呈上升趨勢，木聚糖濃度變化趨勢不明顯。

圖5 受拉木(a—c)與對應(yīng)木(d—f)中相鄰纖維細胞壁中木質(zhì)素(a和d)， 纖維素(b和e)和木聚糖(c和f)濃度變化拉曼線掃描圖

2.3.3 受拉木與對應(yīng)木細胞壁孔隙分布

木材細胞壁孔隙測定的傳統(tǒng)方法主要借助氣體的吸附脫附法，其獲得的研究結(jié)果通常為樣品孔隙的平均信息[3,9,14]，未能在更為微觀的細胞壁乃至細胞壁亞層角度揭示受拉木與對應(yīng)木的孔隙分布差異性。針對傳統(tǒng)研究的不足，本研究采用D2O預(yù)浸漬的組織切片結(jié)合原位高空間分辨顯微拉曼成像對受拉木細胞壁各層中的D2O濃度分布規(guī)律進行研究，分別對受拉木與對應(yīng)木中D2O特征峰2 476 cm-1峰面積積分成像(圖6)。圖中黃色區(qū)域為細胞腔空腔區(qū)域，其高濃度的D2O分布在一定程度上證實了該方法用于表征纖維細胞孔隙結(jié)構(gòu)的適用性。同時可以看出，沿細胞腔經(jīng)過膠質(zhì)層向復(fù)合胞間層區(qū)域過渡時，受拉木和對應(yīng)木中D2O的濃度均呈現(xiàn)逐漸降低的梯度變化規(guī)律，且前者更為明顯。在受拉木中，膠質(zhì)層D2O濃度明顯高于次生壁及胞間層，表明了膠質(zhì)層的孔隙結(jié)構(gòu)分布密集，而對應(yīng)木中的D2O在次生壁及胞間層均有較高濃度的分布且明顯高于受拉木相應(yīng)區(qū)域。以上發(fā)現(xiàn)證實了受拉木孔隙主要來源于膠質(zhì)層[9]。同時可以推斷，由于拉伸應(yīng)力的作用受拉木次生壁及胞間層孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的壓縮，而膠質(zhì)層由于一側(cè)緊鄰細胞腔而大大減弱所受的外力作用從而利于多孔結(jié)構(gòu)的生成。

圖6 受拉木(a)與對應(yīng)木(b)中相鄰纖維細胞壁中D2O分布拉曼成像圖Fig.6 Raman image showing the concentration distribution of D2O along the adjacent fiber wallin tension wood (a) and opposite wood (b)

3 結(jié) 論

采用高空間分辨顯微拉曼光譜成像與疊加技術(shù)對比研究了黑楊受拉木與對應(yīng)木中纖維細胞壁主要組分微區(qū)分布差異性及相關(guān)性，通過引入D2O成功探索了受拉木與對應(yīng)木纖維細胞壁不同形態(tài)區(qū)域中的孔隙分布差異。纖維素、木質(zhì)素和木聚糖在受拉木與對應(yīng)木的細胞壁形態(tài)區(qū)域中均存在不同程度的分布，且沿著細胞腔向復(fù)合胞間層區(qū)域過渡時三者濃度均呈現(xiàn)明顯的區(qū)域選擇性及梯度變化規(guī)律。與對應(yīng)木相比，膠質(zhì)層主要成分纖維素呈現(xiàn)高濃度分布，受拉木纖維素和木聚糖分布濃度在整個細胞壁形態(tài)區(qū)域呈增強趨勢，木質(zhì)素分布濃度在次生壁區(qū)域有所增強； 受拉木膠質(zhì)層孔隙分布密集但其次生壁及胞間層孔隙分布程度較低。盡管D2O拉曼光譜成像圖中的濃度梯度變化能夠間接地反映出細胞壁各層孔隙分布的差異，但該方法在細胞壁水平可視化、定量研究孔隙分布及結(jié)構(gòu)特點方面仍需進行更深入更完善的研究。