劉 攀,耿興敏*,宦智群,李 暢,蘇家樂
(1.南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院,江蘇 南京 210037;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,江蘇 南京 210014)
杜鵑屬(Rhododendron)植物被譽為“花中西施”,其花期長,花色絢麗多彩,是優(yōu)良的園林觀賞木本植物,被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外的城鄉(xiāng)園林綠化中。杜鵑花喜酸性疏松土壤,不耐鹽堿[1]。鹽堿化已嚴(yán)重威脅環(huán)境,目前全球鹽堿化土地面積約有9.5×108hm2[2],我國鹽堿土地面積達108hm2,主要分布在東北松嫩平原、西北干旱地區(qū)、華北平原以及沿海地區(qū)[3],嚴(yán)重限制了杜鵑花在這些地區(qū)園林綠化中的推廣應(yīng)用。
土壤鹽和堿是限制植物生長的重要因素[2,4],對植物的種子萌發(fā)、生長發(fā)育都會造成不同程度的影響[3],會造成發(fā)芽延遲、幼苗死亡率高和植物生長不良[5]。通常鹽脅迫與高濃度的離子有關(guān),主要以NaCl和NaSO4的形式存在,可破壞植物的離子穩(wěn)態(tài)和平衡,引起滲透脅迫和離子超載,而堿鹽脅迫以NaHCO3和Na2CO3為主,其影響主要與高鹽、高pH值及其相互作用有關(guān)[6]。鹽堿脅迫下由于種子萌發(fā)介質(zhì)的滲透壓較低,改變了種子自吸水分的特性,減少種子儲備的利用[7],影響分裂細胞,降低植物生長率[8],導(dǎo)致植物生長不良或死亡。
目前對于杜鵑屬植物非生物脅迫的研究主要集中在高溫[9-10]、低溫[11-12]、干旱[13-14]等方面,而對于鹽堿脅迫的關(guān)注相對較少。過多的Na+和高pH值是鹽堿地上植物生長的主要限制因子[15]。目前鹽堿脅迫對種子影響的研究主要集中在中性鹽NaCl脅迫[16-17],對于堿脅迫研究也多集中在探討杜鵑適宜的pH值[18-19],而堿性鹽Na2CO3、NaHCO3對杜鵑種子萌發(fā)的研究尚未見報道。明確植物種子萌發(fā)階段及幼苗生長期對逆境脅迫的適應(yīng)性非常重要[7],部分植物早期對鹽堿脅迫逆境適應(yīng)性不良,會嚴(yán)重影響植物的栽培繁殖及推廣應(yīng)用。因此本研究以4種杜鵑屬植物:馬銀花(R.ovatum)、滿山紅(R.mariesii)、映山紅(R.simsii)和云錦杜鵑(R.fortunei)的種子為試驗材料,研究不同濃度鹽堿處理下種子的萌發(fā)和幼苗生長情況,旨在確定4種杜鵑屬植物的耐鹽堿范圍,篩選耐鹽堿種質(zhì),為后期的耐鹽堿杜鵑花新品種選育和應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。
試驗材料為4種杜鵑屬植物的種子,其中馬銀花、滿山紅和映山紅的種子(2017年10月)采自南京市玄武湖情侶園,云錦杜鵑種子(2017年11月)采自浙江九龍山。種子收集后25℃烘箱連續(xù)烘干2 d,烘干后篩出種子,置于4℃ 冰箱保存,直至2018年3月用于播種試驗。
1.2.1 播種期的鹽堿脅迫處理
將種子滅菌后,接種到相應(yīng)處理的WPM培養(yǎng)基上。鹽(NaCl)處理濃度設(shè)為0、50、100、150 mmol/L(pH 5.20),堿(NaHCO3,考慮到杜鵑為酸性土植物和Na2CO3的強堿性,試驗選擇弱堿性的堿性鹽NaHCO3)脅迫處理濃度為0、15、30、60 mmol/L(pH值分別為5.20、7.70、8.04、8.25)。每處理接種3個培養(yǎng)皿,每個培養(yǎng)皿接種100粒,重復(fù)3次。培養(yǎng)條件:溫度 25±2℃,光照強度65 μmol·m-2·s-1左右,光照時數(shù)14 h/d。統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù),每24 h觀察記錄種子發(fā)芽情況,連續(xù)3 d種子萌發(fā)率不超過1%視為萌發(fā)結(jié)束。試驗重復(fù)3次。
1.2.2 幼苗期的鹽堿脅迫處理
分2種方法對杜鵑幼苗進行鹽堿處理,第一種為1.2.1中鹽堿發(fā)芽試驗的幼苗,種子萌發(fā)60 d后,每處理選取10株苗,測定出苗率(2片子葉出土)和葉片數(shù),用直尺準(zhǔn)確測量株高(基質(zhì)表面至生長點的長度)和根長(基質(zhì)表面至主根的生長點的長度)。第二種取無鹽堿處理苗齡為4個月的生長一致的組培苗,分別移植于不同鹽堿處理的WPM培養(yǎng)基上。鹽脅迫處理為:0、100、150 mmol/L(pH 5.20)NaCl溶液,堿脅迫處理為:0、7.5、10 mmol/L NaHCO3溶液。每個處理接種8瓶苗,每瓶4棵苗。
鹽脅迫15 d后,堿脅迫10 d,對植株鹽/堿害表型分級。參照劉婉迪等[10]的方法稍作改變計算葉片褐變指數(shù),將葉片的褐變狀態(tài)分為6級,0級:綠色,未褐變;1級:輕度褐變,葉片邊緣褐化;2級:中度褐變,葉片帶有輕微的斑點,1/3部分褐變;3級:中度褐變,葉片1/2部分褐變;4級:重度褐變,葉片2/3部分褐變;5級:枯萎,葉片全部褐變或脫落。
相關(guān)指標(biāo)統(tǒng)計方法:發(fā)芽率=種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù)(100粒)×100%;發(fā)芽勢=達到高峰時發(fā)芽種子數(shù)/參試種子總數(shù)(100粒)×100%;發(fā)芽指數(shù)GI=Σ(Gt/Dt)(Gt為5 d內(nèi)的發(fā)芽數(shù),Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù));鹽/堿害指數(shù)(%)=(對照組萌發(fā)率-鹽/堿處理萌發(fā)率)/對照組萌發(fā)率×100%。出苗率(%)=出苗數(shù)/種子萌發(fā)數(shù)×100%;褐變指數(shù)=[∑(褐變級值×相應(yīng)褐變級值葉片數(shù))/(總?cè)~片數(shù)×褐變最高級值)×100 %]。
用 SPSS19.0軟件計算杜鵑屬種子的鹽堿半致死濃度(LC50)[20],對不同鹽堿脅迫處理間進行單因素方差分析,用Duncan法對平均值進行多重比較,實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2.1.1 不同鹽濃度對種子萌發(fā)的影響
從表1可看出,隨著鹽濃度的升高,4種杜鵑屬植物的種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)呈顯著下降趨勢,當(dāng)鹽濃度達到150 mmol/L時,種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)達到最低。所有鹽處理的種子萌發(fā)率都低于對照組,可見鹽脅迫明顯抑制了種子的萌發(fā)。鹽脅迫對不同種杜鵑的影響存在差異,在輕度(50 mmol/L)鹽脅迫下,云錦杜鵑的種子萌發(fā)率與對照相比無顯著差異(P>0.05),而其它3種發(fā)芽率顯著下降(P<0.05);當(dāng)鹽濃度為100 mmol/L時,云錦杜鵑的發(fā)芽率在4種杜鵑屬植物中最高,映山紅次之,馬銀花發(fā)芽率為26.33%,滿山紅發(fā)芽率最低,僅為15.33%。杜鵑對鹽脅迫的響應(yīng)具有種間差異,在同一濃度鹽脅迫下,云錦杜鵑的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著高于其它3個杜鵑種。隨著鹽脅迫濃度加大,4種杜鵑的鹽害指數(shù)加大,當(dāng)鹽濃度為50 mmol/L時,云錦杜鵑的相對鹽害率最低,僅為4.91%,馬銀花、滿山紅和映山紅的鹽害指數(shù)較大,三者相差不大;當(dāng)鹽濃度達到100 mmol/L,馬銀花和滿山紅的鹽害指數(shù)急劇增加,分別為64.55%和74.16%,映山紅的鹽害指數(shù)居中,云錦杜鵑的鹽害指數(shù)最小,僅為14.29%;當(dāng)鹽濃度達到150 mmol/L時,馬銀花、滿山紅和映山紅的鹽害指數(shù)達到最大,而云錦杜鵑的鹽害指數(shù)低于其它3個種,為65.63%。結(jié)果表明鹽脅迫抑制了杜鵑種子萌發(fā),4種杜鵑中云錦杜鵑的耐鹽性較好,馬銀花和滿山紅耐鹽性最差。
表1 不同鹽濃度對杜鵑種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different salt concentrations on seed germination of four Rhododendron species
2.1.2 杜鵑萌發(fā)期鹽堿半致死濃度的確定
從表2可看出,4種杜鵑的鹽半致死濃度從高到低依次為:云錦杜鵑>映山紅>馬銀花>滿山紅。4種杜鵑的適宜濃度與鹽半致死濃度稍有差異,范圍在28.95~51.29 mmol/L,從高到低依次為:云錦杜鵑>馬銀花>映山紅>滿山紅。從相關(guān)系數(shù)來看,4種杜鵑相關(guān)系數(shù)絕對值排序為:馬銀花>映山紅>滿山紅>云錦杜鵑,綜上云錦杜鵑的鹽半致死濃度和適宜濃度最高,且相關(guān)系數(shù)絕對值最小,說明鹽脅迫對云錦杜鵑的影響較小,云錦杜鵑的耐鹽性最強。
表2 鹽處理后不同種杜鵑的半致死濃度、適宜濃度及相關(guān)系數(shù)Table 2 Median lethal concentration,suitable concentration and correlation coefficient of different Rhododendron species in different salt concentrations
2.1.3 鹽脅迫對杜鵑幼苗生長的影響
播種60d后,4種杜鵑屬植物的出苗率、平均葉片數(shù)、株高、根長和根/莖比都隨著鹽脅迫濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢,在50 mmol/L 鹽脅迫下,馬銀花出苗率與對照相比顯著下降,在4種杜鵑中出苗率最低,降幅達到44.06%,而滿山紅、映山紅和云錦杜鵑的出苗率雖有下降,但不顯著。馬銀花和滿山紅的根長與對照相比降幅較大。當(dāng)鹽濃度上升至100 mmol/L 時,4種杜鵑的出苗率顯著下降,云錦杜鵑的出苗率最高,降幅最小,滿山紅出苗率的降幅最大,下降至63.18%,而馬銀花的出苗率最低,其在50 mmol/L時出苗率大幅度下降,因此在100 mmol/L時降幅不大,為40.76%;從平均葉片數(shù)來看,云錦杜鵑和映山紅的平均葉片數(shù)高于馬銀花和滿山紅;馬銀花和滿山紅幼苗存在不生根現(xiàn)象。而當(dāng)鹽脅迫上升至150 mmol/L時,云錦杜鵑和映山紅仍保持著較高的出苗率,馬銀花出苗率最低;映山紅出現(xiàn)不生根現(xiàn)象。比較4種杜鵑種間數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),云錦杜鵑在脅迫下的出苗率、平均葉片數(shù)、根、莖生長量顯著高于其它3個種。綜上,四種杜鵑的耐鹽性從高到低依次為:云錦杜鵑>映山紅>馬銀花>滿山紅。
將幼苗進行不同濃度的鹽脅迫處理,4種杜鵑的褐化率隨著鹽脅迫濃度的增加呈顯著上升趨勢。比較50 mmol/L和100 mmol/L下4種杜鵑屬植物的褐化率,從高到低依次為:馬銀花>滿山紅>映山紅>云錦杜鵑,云錦杜鵑褐化率顯著低于其它3個種。當(dāng)鹽脅迫濃度為上升至150 mmol/L時,4種杜鵑屬植物的褐化率均達到最大,其中馬銀花和滿山紅褐化率最高,映山紅的褐化率也達到92.07%,而云錦杜鵑的褐化率較小,達到82.83%,云錦杜鵑的褐化率顯著低于其它3個種。結(jié)果表明鹽處理抑制了杜鵑幼苗的生長,杜鵑的幼苗生長存在種間差異,幼苗期4種杜鵑耐鹽性從高到低依次為:云錦杜鵑>映山紅>滿山紅>馬銀花。
表3 不同鹽濃度對杜鵑幼苗生長的影響Table 3 Influence of different salt concentrations on the seedling growth of Rhododendron
表4 4種杜鵑不同鹽脅迫下的褐化率Table 4 Browning rate of 4 Rhododendron species under different salt concentrations (%)
2.2.1 不同堿濃度對種子萌發(fā)的影響
從表5可看出,隨著NaHCO3濃度的增加,4種杜鵑的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)呈下降趨勢,在低濃度(15 mmol/L)脅迫下,云錦杜鵑的發(fā)芽率、發(fā)芽勢與對照相比無顯著差異,發(fā)芽指數(shù)顯著下降,發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)在4種杜鵑中最高,其它3種杜鵑發(fā)芽率、發(fā)芽勢和萌發(fā)指數(shù)顯著下降,其中映山紅發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)僅次于云錦杜鵑,馬銀花和滿山紅發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)降幅較大,二者萌發(fā)率較低,馬銀花的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最低。堿濃度為30 mmol/L時,云錦杜鵑的發(fā)芽率顯著下降,但仍顯著高于其它3個種,映山紅次之,滿山紅和馬銀花的發(fā)芽率較低。當(dāng)堿濃度為60 mmol/L時,云錦杜鵑萌發(fā)率最高,馬銀花和滿山紅次之,映山紅的發(fā)芽率最低。比較同脅迫下4種杜鵑花發(fā)現(xiàn),云錦杜鵑的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著高于其它3個種。隨著堿脅迫濃度的增大,4種杜鵑的堿害指數(shù)增加,同一堿濃度脅迫下,云錦杜鵑堿害指數(shù)偏低,映山紅和滿山紅居中,馬銀花的堿害指數(shù)最高,在堿濃度為15 mmol/L時堿害指數(shù)已高達60.45%。結(jié)果表明,堿脅迫抑制了杜鵑種子萌發(fā),4種杜鵑中云錦杜鵑的耐堿性較好,馬銀花和滿山紅耐鹽性較差。
表5 不同堿濃度對杜鵑種子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of different alkali concentrations on seed germination of Rhododendron
2.2.2 杜鵑萌發(fā)期堿半致死濃度的確定
從表6可知,4種杜鵑屬植物的堿半致死濃度從高到低依次為:云錦杜鵑>映山紅>滿山紅>馬銀花,4種杜鵑的堿適宜濃度與半致死濃度排序一致,濃度范圍為3.32~17.30 mmol/L。從相關(guān)系數(shù)來看,4種杜鵑相關(guān)系數(shù)絕對值排序為:滿山紅>映山紅>云錦杜鵑>馬銀花。綜上,云錦杜鵑的堿半致死濃度和適宜濃度最高,說明堿脅迫對云錦杜鵑的影響較小,云錦杜鵑的耐堿性最強。
表6 堿處理后不同種杜鵑的半致死濃度、適宜濃度及相關(guān)系數(shù)Table 6 Median lethal concentration,suitable concentration and correlation coefficient of different Rhododendron species in different alkali concentrations
2.2.3 堿脅迫對杜鵑幼苗生長的影響
在15 mmol/L堿處理濃度下,馬銀花和滿山紅幼苗已全部死亡;云錦杜鵑出苗率仍高達90.36%,株高與對照相比有所下降,但不顯著;映山紅出苗率和平均葉片數(shù)降幅較大,出苗率僅為35.09%,根長、株高和根/莖比顯著下降,映山紅未生根。當(dāng)堿濃度上升至30 mmol/L時,云錦杜鵑和映山紅出苗率、根長、株高和根/莖比顯著下降;映山紅出苗率僅為21.64%,遠低于云錦杜鵑的出苗率(56.43%),映山紅的平均葉片數(shù)也低于云錦杜鵑,在脅迫下未生根。在60 mmol/L堿處理濃度下,映山紅和云錦杜鵑幼苗也全部死亡。這說明堿處理抑制了4種杜鵑屬植物幼苗的生長,幼苗生長存在顯著種間差異,4種杜鵑幼苗耐堿性從高到低依次為:云錦杜鵑>映山紅>馬銀花和滿山紅,云錦杜鵑在堿脅迫下的出苗率、葉片數(shù)根長、株高以及根/莖比顯著高于其它3個種。
從表8可看出,幼苗隨著堿脅迫濃度的增加,褐化率顯著提高,在7.5 mmol/L堿脅迫下,馬銀花和滿山紅的褐化率分別達到94.11%和93.68%,顯著高于云錦杜鵑和映山紅,映山紅褐化率居中,也達到85.78%,顯著高于云錦杜鵑,而云錦杜鵑的褐化率最低,僅達到48.49%。當(dāng)堿濃度達到10 mmol/L時,馬銀花、滿山紅和映山紅幼苗全部褐化,而云錦杜鵑褐化率為85.44%,未全部褐化。
表7 不同堿濃度對杜鵑幼苗生長的影響Table 7 Effects of different alkali concentrations on the growth of Rhododendron seedlings
表8 4種杜鵑不同堿脅迫下的褐化率Table 8 Browning rate of 4 Rhododendron species in different alkali concentrations (%)
種子萌發(fā)能力和幼苗長勢是植物耐鹽堿性早期鑒定及耐鹽堿個體、品種早期選擇的基礎(chǔ)[21]。在本試驗中,鹽、堿脅迫與杜鵑種子萌發(fā)和活力呈負(fù)相關(guān),高鹽、高堿對種子萌發(fā)的抑制作用更顯著,主要表現(xiàn)在發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)顯著下降且降幅大,可能與離子失衡、滲透調(diào)節(jié)紊亂和種子吸水率下降有關(guān)[5]。在白榆[21]、蒙古扁桃[22]中發(fā)現(xiàn)低鹽堿脅迫對種子萌發(fā)幾乎沒有抑制作用,可能是由于低濃度鹽堿溶液促進了細胞膜的滲透調(diào)節(jié),或是微量無機離子(Na+)對呼吸酶有刺激作用[21],而高鹽堿處理對種子萌發(fā)的抑制效果顯著,推測可能是與鹽堿離子的滲透效應(yīng)和毒性效應(yīng)有關(guān),且鹽堿脅迫程度越深,效應(yīng)越顯著[21]。Neamatollahi等[23]研究表明NaCl的濃度增加降低了茴香種子發(fā)芽率,與滲透壓增加有關(guān)。杜鵑為酸性土指示植物,NaCl脅迫抑制了鹿角杜鵑[16]、馬銀花和映山紅[19]的種子萌發(fā),繁華杜鵑[17]種子萌發(fā)表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象,說明杜鵑屬植物在鹽堿脅迫下的萌發(fā)也存在種間差異。
鹽堿脅迫容易造成植物明顯的發(fā)育遲緩,文獻表明,植物在苗期和營養(yǎng)生長早期特別容易受鹽堿度的影響[6,16]。在我們的研究中,鹽堿脅迫降低了杜鵑屬植物的出苗率、株高、根長、平均葉片數(shù),幼苗在短期鹽堿脅迫下的褐化率與鹽堿脅迫呈正相關(guān),在高濃度鹽堿脅迫下,其幼苗無法存活,說明鹽堿脅迫降低植物的生長速率,甚至造成脅迫死亡。鹽度對植物生長有多種影響,土壤中鹽的存在會導(dǎo)致根區(qū)水勢降低,植物的吸水能力下降,這種生長反應(yīng)與土壤溶液中所含鹽分引起的滲透壓作用[8]、Na+和Cl-、CO32+、HCO3-等離子的植物毒性、養(yǎng)分的不平衡抑制養(yǎng)分的吸收和運輸[7]有關(guān)。大量研究表明,植物在鹽堿脅迫下表現(xiàn)出根莖葉生長量的下降,高濃度脅迫甚至導(dǎo)致植株死亡[24-25]。也有研究表明,低濃度鹽堿脅迫對幼苗生長具有促進作用[26-28],較低濃度的鹽堿脅迫會刺激同化物向根系分布[27]。
目前對于杜鵑耐鹽堿性多限于“喜酸不耐鹽堿”的籠統(tǒng)描述,但對于具體的耐鹽堿能力報道較少,鹿角杜鵑的種子在NaCl 脅迫下的耐鹽適宜濃度、耐鹽半致死濃度、耐鹽極限濃度分別為25.62、55.60、95.57 mmol/L[16],繁花杜鵑在低濃度(50 mmol/L)鹽脅迫下種子萌發(fā)率提高,400 mmol/L鹽處理種子幾乎不發(fā)芽[17]。在本試驗中,馬銀花、滿山紅、映山紅、云錦杜鵑的鹽適宜濃度分別為40.07、28.95、36.89、51.29 mmol/L,鹽半致死濃度分別為61.84、47.35、67.16、100.24 mmol/L;堿適宜濃度分別為3.32、6.27、8.49、17.30 mmol/L,堿半致死濃度分別為8.21、12.81、15.84、29.23 mmol/L,杜鵑屬植物的耐鹽性存在種間差異。從適宜濃度、半致死濃度及杜鵑屬植物幼苗生長來看,堿處理對杜鵑的脅迫程度高于鹽脅迫。事實上,由Na2CO3、NaHCO3等堿性鹽所造成的土壤堿化除了自由基、離子毒害,還存在高pH值危害,比由NaCl、Na2SO4等中性鹽所造成的土壤鹽化問題更加嚴(yán)重。宋慶云等[21]的研究也表明高堿(60 mmol/L)對白榆種子萌發(fā)的抑制效果要顯著高于高鹽的處理,在李志萍等[27]的研究中也有相似的結(jié)論。
植物對鹽堿脅迫的敏感程度存在種間明顯差異[7],在本試驗中,4種杜鵑屬植物的耐鹽堿能力不同,根據(jù)鹽堿半致死劑量,4種杜鵑耐鹽性從高到低排序為:云錦杜鵑>映山紅>馬銀花>滿山紅,耐堿性從高到低依次為:云錦杜鵑>映山紅>滿山紅>馬銀花,耐鹽堿性排序略有差異,云錦杜鵑的耐鹽堿性最好,其次是映山紅,馬銀花和滿山紅的耐鹽堿性最差。郁書君等[29]的研究表明,云錦杜鵑具有一定的耐堿性??剐暂^強的云錦杜鵑在鹽堿脅迫下萌發(fā)率、出苗率、褐化率的降幅相較于抗性弱的種要低。在Hasanuzzaman等[30]的研究中也發(fā)現(xiàn),鹽敏感的水稻品種在鹽脅迫下萌發(fā)率更容易降低。鹽堿脅迫抑制了杜鵑屬植物種子萌發(fā)和幼苗生長。綜合種子萌發(fā)和幼苗生長情況,云錦杜鵑是耐鹽堿杜鵑培育的優(yōu)良親本。