吳茱萸堿對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用研究

楊 哲，孫榮蔚，王賽男，楊 杰,2，王志剛,2，蔡雪婷,2*，曹 鵬,2**

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210023； 2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京210028)

吳茱萸(Tetradium ruticarpum(A.Jussieu)T.G.Hartley)是蕓香科、吳茱萸屬植物。吳茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。吳茱萸性熱味苦、辛，有小毒，有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功，用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃脘疼痛等癥[1]。吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是吳茱萸的主要生物堿活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗炎，抗腫瘤作用[2]。作為傳統(tǒng)中藥中的瑰寶，充分探究吳茱萸的有效成分及藥理作用，對(duì)其深度開(kāi)發(fā)及合理使用尤為重要。

前期研究表明，吳茱萸堿對(duì)于氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(Dxtran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的小鼠炎癥性相關(guān)結(jié)直腸癌(Colitis-associated cancer，CAC)具有顯著的預(yù)防作用[3]。CAC的發(fā)生與潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)密切相關(guān)，長(zhǎng)期炎癥刺激致使UC患者出現(xiàn)腸道不典型增生及癌癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于常人[4]。UC發(fā)病多為急性轉(zhuǎn)為慢性結(jié)腸炎，吳茱萸堿是否在結(jié)腸炎急性發(fā)病階段就會(huì)對(duì)腸道產(chǎn)生化學(xué)預(yù)防及保護(hù)作用尚未明確，本研究即通過(guò)DSS誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型探究吳茱萸堿對(duì)其的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

吳茱萸堿購(gòu)自西安凱萌生物技術(shù)股份有限公司，葡聚糖硫酸鈉(36-50 kDa)購(gòu)自MPbio公司(貨號(hào)0216011090，批號(hào)M8667)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(貨號(hào)EK282/3)、IL-10 ELISA試劑盒(貨號(hào)EK210/4)、TGF-β1 ELISA試劑盒(貨號(hào)EK981)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào)EK206/3)、IL-1β ELISA試劑盒(貨號(hào)EK201B/3)均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；髓過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)EK0943)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；總一氧化氮檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0024)、丙二醛檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0131S)、總超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0101S)、Western及IP細(xì)胞裂解液(貨號(hào)P0013)、細(xì)胞與組織裂解液(一氧化氮檢測(cè)用，貨號(hào)S3090)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；H&E染液(貨號(hào)G1005)、糖原染色套裝(貨號(hào)G1008)、蘇木素染液(貨號(hào)G1004)、分化液(貨號(hào)G1005-3)、返藍(lán)液(貨號(hào)G1005-4)均購(gòu)自Servicebio；Anti-Oxoguanine 8 antibody(貨號(hào)ab206461)、Anti-Nitrotyrosine antibody(貨號(hào)ab125106)購(gòu)自Abcam公司。

1.2 儀器

全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)；-80℃冰箱(Haier公司)；渦旋儀(Scientific Industries公司)；脫水機(jī)、包埋機(jī)、凍臺(tái)(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6雄性小鼠40只，6周齡，初始體重20±2 g，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)NO.20201008，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2016-0010。小鼠用SPF級(jí)鼠普通維持顆粒飼料(儀征安立卯生物科技有限公司)飼喂，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2016-0018。動(dòng)物試驗(yàn)方案由江蘇省中醫(yī)藥研究院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.4 DSS誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型制備及動(dòng)物分組給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，即溶劑對(duì)照組，模型組，Evo高劑量組(20 mg·kg-1)，Evo低劑量組(10 mg·kg-1)，每組10只。采用連續(xù)7天自由飲用2.5%的DSS水溶液構(gòu)建急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，Evo高低劑量組在造模前3天開(kāi)始灌胃給予相應(yīng)劑量的Evo(0.5% CMC-Na配制)，直至造模結(jié)束后3天。溶劑對(duì)照組及模型組每日灌胃相應(yīng)體積的0.5% CMC-Na溶液。造模及分組給藥如圖1。

圖1 Evo保護(hù)DSS誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠試驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow chart of Evo protect acute ulcerative colitis mice induced by DSS

1.5 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

在試驗(yàn)過(guò)程中，每天記錄小鼠體重、飲食狀態(tài)、精神狀態(tài)、糞便特征和死亡率。根據(jù)小鼠的體重變化、糞便性質(zhì)和便血進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index，DAI)評(píng)分[5-6]。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Disease activity index scoring standard

1.6 脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度比值

試驗(yàn)結(jié)束后，眼眶取血收集血清并處死小鼠，取盲腸至肛門(mén)處整段結(jié)直腸，測(cè)量長(zhǎng)度并拍照。對(duì)小鼠脾臟進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度比值。

1.7 腸組織病理學(xué)檢查

1.7.1 結(jié)腸大體損傷評(píng)分

盲法對(duì)結(jié)腸進(jìn)行觀察并進(jìn)行結(jié)腸大體損傷評(píng)分：0，結(jié)腸無(wú)損傷；1，充血水腫，無(wú)潰瘍；2，有潰瘍，但無(wú)明顯炎癥；3，有潰瘍，但只有炎癥；4，有2例以上潰瘍或炎癥，潰瘍大小< 0.5 cm；5，有兩個(gè)以上的潰瘍或炎癥，至少有一個(gè)潰瘍或炎癥部位> 0.5 cm[7]。

1.7.2 組織學(xué)評(píng)分

將新鮮的結(jié)直腸組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，然后依次脫蠟、水化，進(jìn)行PAS及蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，H&E)、脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍攝。盲法觀察并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分：0，正常結(jié)腸組織；1，炎癥或潰瘍病變僅出現(xiàn)在粘膜層；2，炎癥或潰瘍病變僅出現(xiàn)在粘膜下層；3，炎癥或潰瘍深部病變；4，對(duì)固有肌層、炎癥或潰瘍滲透性病變；5，炎癥或壁通透性大的潰瘍并有明顯的穿孔[8]。

1.8 血清一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量測(cè)定

取各組小鼠等量結(jié)腸組織，用細(xì)胞與組織裂解液(NO檢測(cè)用)進(jìn)行裂解，按照總NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，然后通過(guò)Griess reagent檢測(cè)亞硝酸鹽，540 nm處通過(guò)吸光度測(cè)定樣品中總NO含量。

1.9 結(jié)腸組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量測(cè)定

取各組小鼠等量結(jié)腸組織，按照WST8法總SOD活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)樣品對(duì)WST-8產(chǎn)物在450 nm下的吸光度計(jì)算樣品中SOD酶活力。

1.10 結(jié)腸組織丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定

取各組小鼠等量結(jié)腸組織，用Western及IP細(xì)胞裂解液進(jìn)行勻漿，勻漿后10000～12000×g離心10 min取上清，將上清各組樣本按照TBA法試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA含量。通過(guò)單位重量的組織重量來(lái)表示最初樣品中的MDA含量。

1.11 結(jié)腸組織髓過(guò)氧化物酶(Myelopearoxidase,MPO)和炎癥因子含量測(cè)定

精密稱(chēng)取結(jié)腸組織，按照重量體積比依照不同試劑盒要求加入相應(yīng)體積的勻漿介質(zhì)，自動(dòng)勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿(4℃，勻漿5 s停止2 s，共60個(gè)循環(huán))，4℃，12000 r·min-1離心10 min取上清后，按照MPO和炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)在相應(yīng)吸光度下進(jìn)行含量測(cè)定。

1.12 結(jié)腸組織中8-Oxoguanine(8-OHdG)、Nitrotyrosine的表達(dá)檢測(cè)

通過(guò)對(duì)各組小鼠的結(jié)腸組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟至水后，置于盛滿(mǎn)檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水溶液中室溫避光孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清封閉，加入不同的一抗進(jìn)行4℃孵育過(guò)夜，后加入相同屬種的二抗室溫孵育50 min，洗滌后用二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染3 min，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。將切片依次放入75%酒精5 min，85%酒精5 min，無(wú)水乙醇5 min，新的無(wú)水乙醇再次5 min，二甲苯5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察并采集圖像，結(jié)果分析采用Image J 1.37v軟件，每組隨機(jī)抽取相同倍鏡下的六個(gè)視野，通過(guò)陽(yáng)性染色面積/總面積百分比半定量蛋白陽(yáng)性的表達(dá)強(qiáng)度。

1.13 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸堿對(duì)急性結(jié)腸炎小鼠一般活動(dòng)狀況及DAI評(píng)分的影響

模型組小鼠在第5 d出現(xiàn)明顯的精神不振，食欲及飲水量下降，聳背毛發(fā)豎立，第7 d出現(xiàn)明顯的體重減輕并伴隨著大便不成形，稀便，呆滯，不好動(dòng)。隨著DSS的持續(xù)攝入，體重仍持續(xù)下降，第8 d出現(xiàn)明顯的血便，伴隨死亡。試驗(yàn)結(jié)束后模型組死亡率高達(dá)40.0%，Evo低劑量組死亡率25.0%，Evo高劑量組死亡率只有16.7%。DSS組的DAI評(píng)分從開(kāi)始DSS飲水2 d后即比溶劑對(duì)照組顯著升高，體重顯著下降，并持續(xù)整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程(P<0.05)。Evo組可顯著改善上述癥狀，DAI評(píng)分從第7 d開(kāi)始較模型組顯著下降(P<0.05)。

圖2 DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中各組小鼠的DAI評(píng)分和體重變化Fig.2 Initial weight change and DAI score of each group in DSS-induced mice model of acute colitis.注A：各組小鼠體重變化；B：各組小鼠DAI評(píng)分變化。與溶劑對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，下同。

2.2 吳茱萸堿對(duì)急性結(jié)腸炎小鼠腸組織學(xué)的影響

2.2.1 脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度比值及結(jié)腸大體損傷評(píng)分

脾臟腫大的臨床意義為機(jī)體遭受炎癥侵襲，急性潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸縮短也是重要的臨床表現(xiàn)之一。因此，評(píng)價(jià)脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度值可以直觀的表現(xiàn)出機(jī)體的炎癥程度及Evo對(duì)急性潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用[9]。圖3A展示了各組小鼠典型結(jié)腸和脾臟形態(tài)，溶劑對(duì)照組小鼠結(jié)腸腸壁完整，紋理清晰，黏膜完整且光滑富有彈性；模型組小鼠結(jié)腸通體充血水腫，腸壁明顯增厚，質(zhì)地硬且彈性變差，具有明顯的潰瘍，盲腸明顯縮小，與溶劑對(duì)照組和Evo組相比長(zhǎng)度明顯縮短。Evo治療后可明顯降低DSS所造成的結(jié)腸長(zhǎng)度縮短及潰瘍水腫現(xiàn)象的出現(xiàn)，通過(guò)結(jié)腸大體損傷評(píng)分(圖3C)可以看出Evo對(duì)于急性潰瘍性結(jié)腸炎有顯著改善作用。與模型組相比，Evo給藥組脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度值明顯降低(Evo 10 mg·kg-1vs 模型組，P<0.05；Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.001)，其中Evo 20 mg·kg-1組對(duì)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸保護(hù)作用尤為突出(圖3B)。

2.2.2 PAS、H&E染色及結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分

通過(guò)對(duì)結(jié)腸進(jìn)行H&E染色(圖4A)和組織學(xué)評(píng)分可知(圖4B)，溶劑對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，腺體排列整齊，有明顯的正常隱窩結(jié)構(gòu)，杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整數(shù)量豐富，黏膜各層無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，黏膜各層均有潰破及壞死，大量的中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，累積至肌層及漿膜，隱窩結(jié)構(gòu)缺失，出現(xiàn)空泡狀，腺體破損，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少。而經(jīng)Evo干預(yù)后，可以明顯減輕炎癥所造成的結(jié)腸組織的損傷，Evo 20 mg·kg-1組表現(xiàn)出顯著的炎癥抑制及結(jié)腸保護(hù)作用，結(jié)腸組織可見(jiàn)完整的上皮細(xì)胞排列，隱窩結(jié)構(gòu)及杯狀細(xì)胞較模型組相比明顯增多，且結(jié)構(gòu)完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。

圖3 Evo對(duì)急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of Evo on colon of mice with acute colitis.注A：各組小鼠典型結(jié)腸和脾臟形態(tài)；B：各組小鼠脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度值 (n=6)；C：盲法對(duì)各組結(jié)腸組織進(jìn)行肉眼觀察并根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸大體損傷評(píng)分(n=6)。

圖4 不同倍鏡下各組小鼠結(jié)腸組織H&E染色及組織學(xué)評(píng)分Fig.4 H&E staining of colon tissues of mice in each group under different magnification and histological score by blinded.注:A：各組小鼠結(jié)腸組織H&E染色；B：組織學(xué)評(píng)分(n=6)。

采用PAS染色法對(duì)中性粘蛋白進(jìn)行染色，可以間接反映出腸道組織杯狀細(xì)胞的數(shù)量。如圖5所示，紫紅色顆粒為杯狀細(xì)胞所分泌的中性粘多糖，溶劑對(duì)照組及Evo各組呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，而模型組近乎沒(méi)有陽(yáng)性染色，直觀的說(shuō)明了各組結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞的數(shù)量，證實(shí)了Evo對(duì)于DSS所誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的腸道保護(hù)作用。

圖 5 各組小鼠結(jié)腸組織PAS染色(×50)Fig.5 PAS staining of colon tissues of mice in each group

2.3 吳茱萸堿對(duì)急性結(jié)腸炎小鼠氧化水平的影響

2.3.1 吳茱萸堿對(duì)血清NO含量的影響

臨床研究表明，NO在結(jié)腸炎患者體內(nèi)合成異常，NO合成增加，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性增高，iNOS活性增加與結(jié)腸炎患者炎性程度呈平行關(guān)系。同時(shí)，iNOS活性增高，導(dǎo)致致癌物質(zhì)亞硝酸鹽合成增多，是結(jié)腸炎患者誘發(fā)結(jié)腸癌的重要原因之一[10]。過(guò)量的NO合成，釋放至組織，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。因此，通過(guò)評(píng)價(jià)各組小鼠血清中NO含量，可全面評(píng)估Evo對(duì)于結(jié)腸炎的改善作用。如圖6A所示，與溶劑對(duì)照組相比，模型組血清中NO含量增加(P<0.05)，經(jīng)Evo干預(yù)后，Evo 20 mg·kg-1組小鼠NO含量顯著降低(P<0.01)。

2.3.2 吳茱萸堿對(duì)結(jié)腸組織MDA、MPO和SOD含量的影響

通過(guò)對(duì)結(jié)腸組織中MDA、SOD、MPO進(jìn)行含量測(cè)定(圖6B-D)，模型組與溶劑對(duì)照組相比，MDA、MPO含量明顯增加，SOD含量顯著降低(P<0.001)。Evo給藥組與模型組相比，MDA和MPO含量降低，SOD含量顯著增加(MDA：Evo 10 mg·kg-1vs 模型組，P<0.05；Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.01；MPO：Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.05；SOD：Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.05)。

圖6 Evo對(duì)DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激及血清中NO含量的影響Fig.6 Effects of Evo on oxidative stress in colon tissue and NO content in serum of DSS-induced acute colitis mice

2.3.3 吳茱萸堿對(duì)結(jié)腸組織中氧化損傷產(chǎn)物Nitrotyrosine和8-OHdG的影響

通過(guò)對(duì)各組小鼠結(jié)腸組織中Nitrotyrosine、8-OHdG進(jìn)行免疫組化分析，評(píng)估機(jī)體氧化應(yīng)激水平。通過(guò)圖7可以看出，模型組小鼠與溶劑對(duì)照組相比，Nitrotyrosine、8-OHdG陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(P<0.001)，經(jīng)Evo各劑量組干預(yù)后，陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，其中高劑量組保護(hù)治療效果較低劑量組明顯。

圖7 Evo對(duì)結(jié)腸組織中8-OHdG、Nitrotyrosine陽(yáng)性表達(dá)的影響Fig.7 The effect of Evo on 8-OHdG and Nitrotyrosine positive expression in colon tissue注A：結(jié)腸組織8-OHdG免疫組化分析代表性切片(×200)，棕黃色為陽(yáng)性染色(紅色指示為典型陽(yáng)性表達(dá))；B：8-OHdG 陽(yáng)性表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=6)。C：結(jié)腸組織Nitrotyrosine免疫組化分析代表性切片(x200)，棕黃色為陽(yáng)性染色(紅色指示為典型陽(yáng)性表達(dá))；D：Nitrotyrosine陽(yáng)性表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=6)。

2.4 吳茱萸堿對(duì)急性結(jié)腸炎小鼠炎癥水平的影響

通過(guò)對(duì)結(jié)腸組織中抗炎因子TGF-β1、IL-10以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)Evo對(duì)于急性潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥調(diào)節(jié)作用。模型組與溶劑對(duì)照組相比，抗炎因子TGF-β1、IL-10含量明顯降低(P<0.01)。促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯增高(TNF-α：P<0.01；IL-1β：P<0.001；IL-6：P<0.001)。而經(jīng)過(guò)Evo干預(yù)后的小鼠結(jié)腸組織中，促炎因子含量明顯下降，同時(shí)抗炎因子含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖8)。

圖8 Evo對(duì)小鼠結(jié)腸組織中炎性因子表達(dá)的影響Fig.8 Effects of Evo on the expression of inflammatory factors in the colon tissue of mice

3 討論

以往研究炎癥性相關(guān)結(jié)直腸癌多通過(guò)慢性結(jié)腸炎模型進(jìn)行驗(yàn)證，相較于慢性結(jié)腸炎，急性結(jié)腸炎發(fā)病程度重，發(fā)病率高，是慢性結(jié)腸炎的必經(jīng)階段。本研究通過(guò)急性結(jié)腸炎模型組小鼠相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)腸道上皮完整性破壞，氧化應(yīng)激及損傷嚴(yán)重，這些都與炎癥引起的結(jié)直腸癌變密切相關(guān)。因此，對(duì)于炎癥性相關(guān)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防，不能僅針對(duì)于慢性炎癥階段，在結(jié)腸炎急性階段，有效的去預(yù)防及干預(yù)治療尤為重要。

本次試驗(yàn)首次證明吳茱萸堿在潰瘍性結(jié)腸炎急性階段就可以起到顯著的保護(hù)治療作用，降低氧化應(yīng)激，抑制炎癥及炎癥所造成的細(xì)胞癌變。我們通過(guò)在DSS造模過(guò)程中及造模前3 d和后3 d給予Evo干預(yù)，通過(guò)對(duì)小鼠體重的變化、糞便性狀及便血情況進(jìn)行DAI評(píng)分，用以衡量急性結(jié)腸炎疾病的進(jìn)程。脾臟腫大的臨床意義為機(jī)體遭受炎癥侵襲，急性潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸縮短也是重要的臨床表現(xiàn)之一。因此，評(píng)價(jià)脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度值可以直觀地表現(xiàn)出機(jī)體的炎癥程度及Evo對(duì)急性潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防治療作用[5]。我們通過(guò)評(píng)估各組小鼠脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度值之間的差異，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，脾臟變大且呈現(xiàn)暗紅色；而溶劑對(duì)照組及Evo各組小鼠脾臟重量/結(jié)腸長(zhǎng)度值均小于模型組，脾臟大小正常，顏色鮮艷。

杯狀細(xì)胞是粘蛋白的主要來(lái)源，在腸道的保護(hù)因素中起到?jīng)Q定性的作用。正常情況下，杯狀細(xì)胞呈現(xiàn)錐狀體結(jié)構(gòu)，向胞外分泌富含粘蛋白的粘液顆粒，與水混合后形成粘液，附著于腸粘膜的表面，構(gòu)成一層膜狀保護(hù)結(jié)構(gòu)。因此，杯狀細(xì)胞的數(shù)量多少和形態(tài)可以反映出腸粘膜的健康狀況[11]。通過(guò)PAS染色法對(duì)杯狀細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)Evo對(duì)于腸道的有效保護(hù)及炎癥預(yù)防作用。

多數(shù)研究認(rèn)為，結(jié)腸炎的發(fā)生及惡化與氧化應(yīng)激及NO代謝異常密切相關(guān)。在正常情況下，腸道活性氧(Reactive oxygen species，ROS)具有殺菌作用，參與腸道防御功能。然而，過(guò)度ROS產(chǎn)生，超過(guò)在宿主抗氧化防御的緩沖能力所衍生的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，腸黏膜屏障損傷，細(xì)菌移位和炎癥反應(yīng)[12]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激下的有害產(chǎn)物，導(dǎo)致組織和器官損傷；MPO是一種在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)中性粒細(xì)胞和低血小板的酶，MPO活性增強(qiáng)是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥的一個(gè)重要指標(biāo)；在氫離子與超氧化物發(fā)生反應(yīng)生成過(guò)氧化氫和氧的過(guò)程中，SOD充當(dāng)催化酶作用，減少過(guò)渡金屬通過(guò)產(chǎn)生自由基引發(fā)及氧化應(yīng)激損傷[13]；臨床研究表明，NO在結(jié)腸炎患者體內(nèi)合成異常，NO合成增加，iNOS活性增高，iNOS活性增加與結(jié)腸炎患者炎性程度呈平行關(guān)系。同時(shí)，iNOS活性增高，導(dǎo)致致癌物質(zhì)亞硝酸鹽合成增多，是結(jié)腸炎患者誘發(fā)結(jié)腸癌的重要原因之一[14]。8-OHdG作為ROS引起DNA氧化損傷的修飾產(chǎn)物之一，外界炎癥刺激導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS直接攻擊DNA中鳥(niǎo)嘌呤，使得脫氧鳥(niǎo)苷氧化為8-OhdG。因此，機(jī)體8-OHdG的含量可以間接反應(yīng)機(jī)體的氧化損傷程度，是目前公認(rèn)的衡量機(jī)體氧化應(yīng)激及DNA氧化損傷的高效指標(biāo)[14-15]。氧化應(yīng)激對(duì)蛋白質(zhì)損傷的一個(gè)重要標(biāo)志物是硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)。Nitrotyrosine是自由基與蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基相互作用的產(chǎn)物，當(dāng)炎癥侵襲時(shí)，炎性介質(zhì)與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或酪氨酸發(fā)生硝化反應(yīng)，酪氨酸硝基化一方面可以反應(yīng)機(jī)體炎癥及氧化應(yīng)激水平，同時(shí)會(huì)使體內(nèi)多種有重要功能的酶和蛋白功能受損[15]。因此，我們驗(yàn)證了經(jīng)Evo給藥后血清中NO及結(jié)腸組織中MDA、MPO、SOD的含量，免疫組化法測(cè)定了結(jié)腸組織中8-OHdG及Nitrotyrosine的表達(dá)，明確表明Evo可以降低機(jī)體氧化應(yīng)激程度，減少NO的產(chǎn)生，從而減少結(jié)腸損傷及誘發(fā)結(jié)腸癌變。

炎癥因子及抗炎因子在結(jié)腸組織中的含量可以最為直觀的體現(xiàn)機(jī)體遭受炎癥反應(yīng)的程度。同時(shí)，炎癥刺激導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生主要與各種炎癥因子及其炎癥因子所參與的相關(guān)通路有關(guān)，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子對(duì)腫瘤基因、表觀遺傳學(xué)、各種信號(hào)通路均有影響[16-17]。本試驗(yàn)通過(guò)ELISA檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抗炎因子TGF-β1、IL-10含量，結(jié)果表明Evo可以明顯的降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)并升高抗炎因子的水平。

綜上所述，吳茱萸堿具有改善急性潰瘍性結(jié)腸炎的作用，并可顯著抑制急性腸炎模型小鼠腸道高氧化應(yīng)激和高炎癥狀態(tài)。本研究可為進(jìn)一步探討吳茱萸堿預(yù)防或治療UC、CAC的機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。