白黎蘆醇對(duì)舒尼替尼誘導(dǎo)腎損傷的作用及機(jī)制研究

金冉陽(yáng)，楊永健

舒尼替尼是一種新型的腫瘤靶向治療藥物，自上市以來(lái)明顯延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤患者的生存期[1-2]。但舒尼替尼治療過(guò)程中出現(xiàn)的腎損傷不僅會(huì)導(dǎo)致癌癥治療失敗，還會(huì)嚴(yán)重危及患者的健康和生命。目前，除了減少劑量或停止用藥外，尚無(wú)更好的干預(yù)措施[3]。研究顯示，舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷主要與其本身的毒性作用以及其引起的腎臟炎癥密切相關(guān)[4]。而白黎蘆醇是一種主要存在于葡萄和紅酒中的天然多酚化合物，具有強(qiáng)大的抗炎作用，常被作為多種炎性疾病輔助療法的候選藥物[5]。體內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，白黎蘆醇可以抑制核因子κB（NF-κB）等促炎因子的表達(dá)，減輕腎臟炎癥，對(duì)糖尿病腎病、順鉑引起的腎毒性等多種原因引起的腎損傷產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用[6]。近幾十年累積證據(jù)表明，具有化學(xué)預(yù)防作用的飲食植物化學(xué)物質(zhì)也是有效的表觀遺傳調(diào)節(jié)劑。研究顯示，白黎蘆醇對(duì)體內(nèi)多種組蛋白乙?；图谆揎椌哂袕?qiáng)大的調(diào)控作用[5]。近年來(lái)有關(guān)組蛋白修飾在炎癥中的作用逐漸引起了重視。其中，組蛋白甲基化修飾組蛋白第三亞基四號(hào)賴氨酸的三甲基化（H3K4me3）更是炎癥因子轉(zhuǎn)錄過(guò)程中重要的調(diào)控因素，它通過(guò)激活NF-κB 等多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄影響體內(nèi)多種炎癥反應(yīng)[7]。就此推測(cè)，白黎蘆醇可能通過(guò)調(diào)控H3K4me3 抑制腎臟炎癥緩解舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷。本研究擬探究白黎蘆醇對(duì)舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷的保護(hù)作用及其與表觀遺傳學(xué)相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

舒尼替尼購(gòu)于中國(guó)MedChemExpress（MCE）公司。白黎蘆醇購(gòu)于中國(guó)麥克林公司。NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）兔源性抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司。H3K4me3 兔源性抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司。組蛋白H3，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔源性抗體購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔I R Dye800 CW 二抗購(gòu)于美國(guó)LI-CO R生物科技公司。肌酐、尿素氮生化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技公司。RIPA 裂解液、蛋白質(zhì)BCA 法定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蘇木素伊紅（HE）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。戊巴比妥鈉、磷酸緩沖鹽溶液、多聚甲醛等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 模型分組及建立

清潔級(jí)8 周WKY 大鼠30 只，雄性，體質(zhì)量180～250 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。采用隨機(jī)數(shù)字法將WKY 大鼠分為三組：對(duì)照組（n=10），舒尼替尼組（n=10），舒尼替尼+白藜蘆醇組（n=10）。采用文獻(xiàn)[8]方法構(gòu)建舒尼替尼腎損傷大鼠模型，具體給藥方案見(jiàn)表1。

1.3 血壓測(cè)定

采用大鼠鼠尾無(wú)創(chuàng)測(cè)壓儀測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓。動(dòng)物清醒狀態(tài)下置于35 ℃保溫毯預(yù)熱10 min，放入固定裝置，使其處于安靜環(huán)境中測(cè)量血壓。每隔3 min 測(cè)1 次，連測(cè)5 次，取平均值。每3 d 檢測(cè)一次，記錄舒尼替尼處理后大鼠血壓變化。

表1 各組大鼠具體給藥方案

1.4 腎功能指標(biāo)檢查

按文獻(xiàn)[8]，予以舒尼替尼喂養(yǎng)28 d 后，鼠尾靜脈取血。應(yīng)用肌酐、尿素氮生化試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)反應(yīng)體系，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度光密度（OD）值，計(jì)算血清尿素氮、肌酐水平。

1.5 腎組織學(xué)檢查

按文獻(xiàn)[8]，予以舒尼替尼喂養(yǎng)28 d 后，取大鼠腎臟進(jìn)行制作石蠟切片，HE 染色觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。將腎組織脫水、透明、包埋，制作成4 μm 的切片，切片烘干行HE 染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)的變化。

1.6 腎組織腎小管病理?yè)p傷評(píng)分（paller 評(píng)分）

每張切片在400 倍光鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野隨機(jī)選取10 個(gè)腎小管，按100個(gè)腎小管記分。paller 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管明顯擴(kuò)張，細(xì)胞扁平計(jì)1 分；刷狀緣損傷計(jì)1 分，脫落計(jì)2 分；細(xì)胞質(zhì)空泡計(jì)1 分；間質(zhì)水腫計(jì)1 分；腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細(xì)胞，未形成管型或碎片計(jì)1 分，形成管型或碎片計(jì)2 分。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)H3K4me3、NF-κB、TNF-α、MCP-1 蛋白水平

提取腎組織總蛋白，二喹啉甲酸法（BCA 法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[9]。將變性好的蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，H3K4me3、NF-κB、TNF-α、MCP-1 受體抗體（1 ∶400）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液（1×TBS 含0.1%的吐溫-20）洗滌3 次，羊抗兔IgG（1：5 000）室溫孵1 h，TBST 洗 滌，掃 膜 顯 色，Quantity One（1-D Analysis Software Version4.4，Bio-Bad inc，美國(guó)）軟件分析計(jì)算H3K4me3、NF-κB、TNF-α、MCP-1 灰度比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨(dú)立樣本間的比較用t檢驗(yàn)，三組及三組以上樣本的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量結(jié)果（圖1）

大鼠鼠尾測(cè)壓結(jié)果顯示，舒尼替尼處理6 d后，舒尼替尼組大鼠血壓較對(duì)照組明顯升高[（121.53±2.31）mmHg vs.（113.3±2.45）mmHg，1 mmHg=0.133 kPa，P＜0.05];9 d后，舒尼替尼+白藜蘆醇組血壓與舒尼替尼組相比明顯降低[（126.3±1.75）mmHg vs.（133.5±2.12）mmHg，P＜0.05]。提示白黎蘆醇降低舒尼替尼誘導(dǎo)的高血壓。

圖1 各組大鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量結(jié)果（各組n=10）

2.2 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平的變化（圖2）

與對(duì)照組相比，舒尼替尼組大鼠血清肌酐和尿素氮水平均明顯升高[（0.59±0.04）mg/dl vs.（0.47±0.05）mg/dl；（21.10±0.47）mg/dl vs.（17.34±0.59）mg/dl，P均＜0.05]；而 舒 尼 替尼+白藜蘆醇組大鼠血清肌酐和尿素氮水平均較舒尼替尼組大鼠明顯降低[（0.50±0.03）mg/dl vs.（0.59±0.04）；（18.21±0.51）mg/dl vs.（21.10±0.47）mg/dl，P均＜0.05]。提示白黎蘆醇緩解舒尼替尼導(dǎo)致的腎功能損傷。

圖2 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平的變化（各組n=10）

2.3 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化（圖3、表2）

光鏡下觀察腎組織病理結(jié)構(gòu)，舒尼替尼組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)破壞，局部近曲小管上皮細(xì)胞腫脹、固縮死亡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。舒尼替尼+白黎蘆醇組大鼠腎結(jié)構(gòu)損傷及炎性浸潤(rùn)均明顯減輕。腎小管paller 評(píng)分結(jié)果與光鏡下一致，舒尼替尼組paller 評(píng)分較對(duì)照組高[（39.12±1.91）分vs.（10.92±0.86）分，P＜0.05]，舒尼替尼+白藜蘆醇組paller 評(píng)分較舒尼替尼組低[（23.40±1.38）分 vs.（39.12±1.61）分，P＜0.05]。提示白黎蘆醇可以減輕舒尼替尼導(dǎo)致的腎損傷以及炎癥浸潤(rùn)。

圖3 光鏡下觀察各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化（各組n=10）

表2 各組大鼠paller 評(píng)分的變化（n=10）

2.4 各組大鼠腎臟NF-κB，TNF-α，MCP-1 蛋白表達(dá)的變化（圖4）

圖4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠腎臟 NF-κB、TNF-α、MCP-1 表達(dá)的變化（n=10）

舒尼替尼組大鼠腎臟NF-κB、TNF-α、MCP-1 蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高（1.09±0.19 vs.0.49±0.05；0.92±0.02 vs.0.32±0.01；0.85±0.06 vs.0.47±0.04，P均＜0.05）；與舒尼替尼組相比，舒尼替尼+白藜蘆醇 組 大 鼠 腎 臟NF-κB、TNF-α、MCP-1 蛋 白表達(dá)水平均明顯降低（0.81±0.11 vs.1.09±0.19；0.4 2±0.0 4 v s.0.9 2±0.0 2；0.6 3±0.0 3 v s.0.85±0.06，P均＜0.05）。提示白黎蘆醇減輕了舒尼替尼誘導(dǎo)的腎臟炎癥。

2.5 各組大鼠腎臟 H3K4me3 表達(dá)的變化（圖5）

與對(duì)照組相比，舒尼替尼組大鼠腎臟H3K4me3水平明顯升高（1.04±0.10 vs.0.55±0.04，P＜0.05）；舒尼替尼+白藜蘆醇組大鼠腎臟H3K4me3 水平較舒尼替尼組顯著降低（0.70±0.04 vs.1.04±0.10，P＜0.05）。提示白黎蘆醇預(yù)處理，可以抑制舒尼替尼損傷大鼠腎臟H3K4me3，減輕腎臟炎癥，緩解腎損傷。

圖5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠腎臟 H3K4me3 表達(dá)的變化（各組n=10）

3 討論

為了探究白黎蘆醇是否對(duì)舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有保護(hù)作用，我們參照文獻(xiàn)[8]中相關(guān)指標(biāo)，檢測(cè)了舒尼替尼處理后大鼠血清肌酐和血尿素氮水平以及腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果顯示，大鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯升高，腎臟腎小管結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，局部近曲小管上皮細(xì)胞腫脹、固縮死亡，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。而白黎蘆醇干預(yù)后，大鼠血清肌酐和尿素氮水平較舒尼替尼組明顯下降，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，局部近曲小管上皮細(xì)胞腫脹、固縮死亡，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。這表明白黎蘆醇對(duì)舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有明顯的保護(hù)作用。NF-κB，TNF-α，MCP-1 是炎癥損傷的標(biāo)志性蛋白[10]。本研究表明，與舒尼替尼組相比，舒尼替尼+白藜蘆醇組大鼠腎臟NF-κB，TNF-α，MCP-1 等促炎因子的表達(dá)降低，提示白黎蘆醇通過(guò)減輕腎臟炎癥緩解舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷。腎臟是維持水鈉平衡的主要器管[11]，腎臟損傷是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因，腎臟炎癥會(huì)導(dǎo)致壓力尿鈉變鈍從而促進(jìn)高血壓發(fā)展[12]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)舒尼替尼干預(yù)后大鼠血壓明顯上升，與文獻(xiàn)結(jié)果一致；而白黎蘆醇干預(yù)后，大鼠血壓明顯下降，這可能與其減輕腎臟炎癥緩解腎臟損傷有關(guān)。

H3K4me3 是真核生物中活性基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的普遍的組蛋白修飾，在炎癥轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要作用[7，13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB，TNF-α，MCP-1 等促炎基因的啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3 積累對(duì)其轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[14-15]。白藜蘆醇是一種天然的二苯乙烯結(jié)構(gòu)多酚，具有較強(qiáng)的抗炎和抗氧化活性，被作為多種炎性疾病的輔助療法的候選藥物[16-17]。白藜蘆醇干預(yù)可明顯減輕舒尼替尼誘導(dǎo)的腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制腎臟促炎因子NF-κB，TNF-α，MCP-1 蛋白表達(dá)。近幾十年累積證據(jù)表明，具有化學(xué)預(yù)防作用的飲食植物化學(xué)物質(zhì)也是有效的表觀遺傳調(diào)節(jié)劑。而白藜蘆醇是一種強(qiáng)有效的表觀遺傳修飾劑[5]，對(duì)多種組蛋白甲基化均具有較強(qiáng)的調(diào)控作用[18]。研究報(bào)道，在去氧皮質(zhì)酮（DOCA）鹽誘導(dǎo)的高血壓模型中，白藜蘆醇可以抑制DOCA 介導(dǎo)的主動(dòng)脈組蛋白H3K27 三甲基化（H3K27me3）[5]。本研究顯示，舒尼替尼喂養(yǎng)可明顯增加大鼠腎臟H3K4me3 水平，而白藜蘆醇干預(yù)后腎臟H3K4me3水平較舒尼替尼組明顯降低。提示白黎蘆醇對(duì)舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有良好的保護(hù)作用；且其保護(hù)作用可能與抑制H3K4me3，減輕腎臟炎癥有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)白黎蘆醇對(duì)舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有明顯的保護(hù)作用，且其保護(hù)作用可能與抑制腎臟H3K4me3 水平減輕腎臟炎癥有關(guān)。這提示白黎蘆醇可能是一種治療舒尼替尼導(dǎo)致腎損傷的新方法。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突