• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    天麻病害發(fā)生與其真菌群落結(jié)構(gòu)變化關(guān)系研究

    2021-03-09 02:36:40柏秋月鄧百萬解修超張彩妮劉蘭蘭袁敏謙
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:病株塊莖天麻

    柏秋月,鄧百萬,解修超,張彩妮,劉蘭蘭,袁敏謙

    (陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西 漢中 723001)

    天麻(GastrodiaelataBl.)屬蘭科多年生草本植物,其塊莖具有較高的藥用及保健價值,是主產(chǎn)于中國的名貴中藥材[1]。近年來,市場對天麻的需求量日益增長,天麻產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展。陜西省漢中市是我國天麻最大的適生區(qū)和主產(chǎn)區(qū)之一,天麻種植是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。然而,漢中地處暖溫帶和亞熱帶氣候的過渡帶,降水量大且持續(xù)時間長,導(dǎo)致天麻病害加重[2]。研究表明,天麻病害主要由真菌、細菌、病毒等引起[3],植物內(nèi)微生物群落組成變化也可影響植物的健康。熊城[4]對天麻內(nèi)生真菌進行了初步分離鑒定,柳靖婷[5]對天麻內(nèi)生菌與病原菌之間的相互作用進行了分析,研究均表明,植物內(nèi)微生物群落組成發(fā)生變化可影響天麻的健康,而病原微生物是導(dǎo)致天麻病害發(fā)生的重要原因。迄今為止,尚未有預(yù)防和控制天麻病害發(fā)生的有效方法[6]。馮嘉云[7]對植物內(nèi)的微生物群落進行了分析,結(jié)果表明,當(dāng)植物體內(nèi)的有益真菌數(shù)量減少時,植物更容易受到雜菌的侵染從而發(fā)生病害;當(dāng)有益菌菌群種類和數(shù)量保持穩(wěn)定時,植物能夠健康生長,說明植物體內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)的組成對植物的正常生長和健康狀態(tài)具有重要作用。因此,研究天麻內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)對預(yù)防天麻病害、實現(xiàn)天麻綠色栽培十分必要。

    近年來,主要依靠傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法對引起天麻病害的微生物進行研究,但傳統(tǒng)培養(yǎng)法受培養(yǎng)條件和營養(yǎng)供給等方面的限制[8],存在培育的物種較少[9]等缺點,無法全面揭示病株天麻內(nèi)微生物群落組成。隨著微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,高通量測序在微生物菌群研究方面表現(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢,其可以直接在分子層面進行測序,檢測出植物組織中難以培養(yǎng)的菌屬[10-12],全面揭示植株內(nèi)微生物群落的組成。鑒于此,基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù),對采集于漢中市鎮(zhèn)巴縣的紅稈健株天麻和病株天麻的塊莖進行真菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性研究,旨在揭示天麻病害發(fā)生的原因,為天麻病害防控提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 樣品采集

    天麻樣品于2019年4月采集于陜西省鎮(zhèn)巴縣白河村(108°02′E、32°48′N,海拔1 244 m)。樣品分為2組:①無黑斑、無腐爛、表面光潔的天麻塊莖(健株,如圖1a所示,編號記為JK1、JK2、JK3),②出現(xiàn)黑斑,腐爛的天麻塊莖(病株,如圖1b所示,箭頭指向病害部位,編號記為ZB1、ZB2、ZB3)。

    1.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)分析方法

    1.2.1 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的分離純化 取健株和病株天麻塊莖,超純水沖洗30 min,洗凈泥沙,放入超凈工作臺進行無菌操作。在75%乙醇溶液中浸泡30 s后,無菌水沖洗3~4次,放于無菌濾紙上吸干塊莖表面多余的水分,再于0.1%的氯化汞溶液中浸泡5 min,無菌水沖洗5~6次,置于墊有滅菌濾紙的平皿上。用解剖刀將天麻塊莖切成厚度約2 mm、長寬各約5 mm的薄片,接種于PDA平板,每皿接種1片,置于28 ℃條件下培養(yǎng)[13]。

    1.2.2 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將純化的菌株轉(zhuǎn)接到察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5 d,采用棉蘭染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)和大小,并參考《真菌鑒定手冊》[14]對其進行基本的分類鑒定。

    1.2.3 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的ITS分子鑒定 將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌菌絲體利用CTAB法提取DNA,并采用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行擴增。PCR反應(yīng)體系(50 μL):2×TaqMaster Mix 25 μL,10 μmoL/L上、下游引物各2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O補至50 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,36個循環(huán);72 ℃延伸10 min。4 ℃保存,備用[15]。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序,測序結(jié)果進行BLAST比對,并提交至NCBI,利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

    1.3 天麻樣品內(nèi)真菌的高通量測序分析

    1.3.1 天麻樣品內(nèi)真菌總DNA提取及高通量測序 采用上海生工生物工程有限公司的OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit進行文庫構(gòu)建,構(gòu)建的文庫利用Qubit定量和檢測合格后,利用Illumina Miseq測序平臺對真菌翻譯間隔序列ITS1—ITS2區(qū)進行雙末端測序[17]。

    1.3.2 高通量測序數(shù)據(jù)分析 將得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(Base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù),使用Usearch去除序列中的非擴增區(qū)域序列,而后對序列進行錯誤校正,并調(diào)用Uchime鑒定嵌合體,隨后與數(shù)據(jù)庫進行對比檢測并去除嵌合體序列[18-19],得到有效數(shù)據(jù)(Clean reads)。將得到的有效數(shù)據(jù)按照序列間的距離進行聚類,通常以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational tabxonomic units),最后用Mothur等軟件對OTUs序列進行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 天麻樣品中可培養(yǎng)真菌的分離與鑒定

    通過可培養(yǎng)法共分離55株菌,其中從健株天麻塊莖樣品分離得到19株真菌,病株天麻塊莖樣品分離得到36株真菌,利用分子生物學(xué)方法進行鑒定,以ITS1和ITS4引物進行擴增,得到長度約為800 bp的擴增片段,測序后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中,進行序列分析和相似性比較,取相似性大于99%的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹以確定所分離菌株的系統(tǒng)分類地位[20]。結(jié)果如圖2和圖3所示,健株與病株天麻塊莖內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異,健株分離得到的19株真菌屬于2個門6個目8個屬,病株分離得到的36株真菌屬于3個門7個目10個屬。

    對分離的不同菌屬的菌株結(jié)合形態(tài)學(xué)方法進行觀察,結(jié)果如表1所示,從健株和病株天麻塊莖中分離的真菌歸為3門14屬,其中肉座菌屬(Hypocrea)、毛殼屬(Cheatomium)、木霉屬(Trichoderma)、莖點霉屬(Phoma)只在健株天麻中分離到,且其所有菌屬的菌株數(shù)量相差很小,分布較均勻;而枝孢屬(Cladosporium)、鏈格孢屬(Alternaria)、孢盤菌屬(Botrytis)、多孔菌屬(Pycnoporus)、栓菌屬(Trametes)只在病株天麻中分離得到,且病株的優(yōu)勢菌屬為鐮刀菌屬(Fusarium),占比高達44.4%。根據(jù)國輝[21]、翟鳳艷等[22]研究可知,枝孢屬、鏈格菌屬、鐮刀菌屬均為植物致病菌,說明天麻發(fā)生病害后病株中致病真菌數(shù)量增加,真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

    表1 天麻真菌種類及形態(tài)學(xué)特征Tab.1 Species and morphological characteristics of endophytic fungi in Gastrodia elata

    續(xù)表1 天麻真菌種類及形態(tài)學(xué)特征Tab.1(Continued) Species and morphological characteristics of endophytic fungi in Gastrodia elata

    2.2 基于高通量測序分析的天麻樣品內(nèi)真菌多樣性

    2.2.1 天麻樣品真菌檢測及多樣性分析 在群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性,可以通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)反映微生物群落的豐度和多樣性[23]。本試驗采用稀釋曲線(Rarefaction curve)及多樣性指數(shù)(Diversity index)分析樣本的多樣性。稀釋曲線是采用對測序序列進行隨機抽樣的方法,以抽到的序列數(shù)與它們所能代表的相應(yīng)指數(shù)構(gòu)建曲線。當(dāng)曲線趨于平坦時,說明測序數(shù)據(jù)量合理,更多的數(shù)據(jù)只會產(chǎn)生少量新的OTUs。本試驗對天麻健株(JK)和病株(ZB)樣本所有有效序列計算后的Shannon指數(shù)稀釋曲線如圖4所示,隨著抽樣序列數(shù)的增多,健株天麻(JK)和病株天麻(ZB)的Shannon指數(shù)逐漸增加,最后趨于穩(wěn)定,說明2組樣本中真菌的文庫覆蓋率均較高,本次測序結(jié)果基本能代表樣本的真實情況。且由圖4可知,健株天麻的3個樣品香濃指數(shù)差異較小,病株天麻樣品ZB2和ZB3的香濃指數(shù)遠高于天麻健株的任意一樣品,而樣品ZB1香濃指數(shù)較低可能是由于取樣時未取到病害部位,從而使得其指數(shù)低于JK2。

    利用軟件Usearch在97%相似度下將測序得到的序列進行聚類,6個樣品共產(chǎn)生1 692個OTUs,每個樣品測序得到的序列數(shù)量、OTUs數(shù)量及香濃指數(shù)見表2。Simpson指數(shù)反映天麻病害和健康狀態(tài)下真菌物種的多樣性,數(shù)值越小多樣性越高。Chao1和ACE指數(shù)反映天麻病害和健康狀態(tài)下真菌物種豐度,數(shù)值越大豐度越高[24]。由表2可知,健株天麻與病株天麻中真菌群落多樣性存在一定差異。其中,健株天麻的各樣品多樣性指數(shù)差異較小,病株天麻的各樣品多樣性指數(shù)相差較大。3個病株樣品的Simpson指數(shù)均較低,說明天麻病害狀態(tài)下的真菌物種多樣性均高于健康狀態(tài)下的天麻,病株樣品中ZB2樣品的OTUs數(shù)量最多,Chao1和ACE指數(shù)最高,表明所有樣品中ZB2真菌菌群最豐富,能最全面地代表天麻病株的群落結(jié)構(gòu)。

    表2 天麻樣品的多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity index of each Gastrodia elata sample

    2.2.2 天麻內(nèi)真菌在門和屬水平上的群落組成 將上述聚類得到的1 692個OTUs的代表序列與NCBI數(shù)據(jù)庫代表序列進行BLASTn比對,進行物種注釋,共涵蓋49個屬(圖5),選擇2組天麻豐度差異較大的8門33屬進行對比分析(表3),由表3和圖5可知,從天麻中分離的真菌主要以子囊菌門(Ascomycota)為主,其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota);健株天麻組和病株天麻組的菌屬類別相差較大,其中,除未分類真菌外,土赤殼屬(Ilyonectria)、木霉屬、鐮刀菌屬、被孢霉屬(Mortierella)、unclassifiedCercozoa在2組天麻樣品中均存在,且木霉屬菌株屬于生防菌,其在健株內(nèi)的豐度高于病株。鐮刀菌屬菌株屬于植物病原菌,其在病株中的豐度是健株的4.3倍,病株中的鐮刀菌屬菌株數(shù)量遠多于健株,這與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的結(jié)果一致。而土赤殼屬在2種樣品中均為優(yōu)勢菌屬,豐度高達14%以上,但此菌屬菌株在傳統(tǒng)培養(yǎng)法中未分離出來,這可能是由于培養(yǎng)法所用的培養(yǎng)基無法提供其所需的營養(yǎng),導(dǎo)致土赤殼屬菌株難以生長。而Trichocladium、Tetracladium、喬氏桿菌屬(Gyoerffyella)、未分類傘形霉屬(unclassifiedSordariomycetes)、地絲霉屬(Geomyces)、Macrocystidia等菌屬只在健株中分析到,且其中的優(yōu)勢菌屬有Macrocystidia,豐度高達17.01%,但該菌屬真菌不屬于植物生防菌;未分類柔膜菌屬(unclassifiedHelotiales)、Menispora、Dactylonectria、粉紅螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)等菌屬只在病株中分析到, 其中未分類柔膜菌屬真菌豐度達到了9.81%,且未分類柔膜菌屬真菌為植物致病菌,因此,天麻病株所擁有的某些特有菌群可能具有一定的致病性,這些特有菌群可能是天麻發(fā)生病害的原因。

    2.2.3 健株天麻與病株天麻真菌結(jié)構(gòu)的相似性分析 采用R軟件進行PCoA分析簡化數(shù)據(jù),每個圖標(biāo)(圖6)代表1個樣本,兩點之間距離越近,表明2個樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性越高,差異性越小,坐標(biāo)軸括號中的百分比代表對應(yīng)主成分所能解釋的原始數(shù)據(jù)中差異的比例。從圖6可知,第1坐標(biāo)軸(PCoA1)的貢獻值為42.0%,第2坐標(biāo)軸(PCoA2)的貢獻值為29.0%,第3坐標(biāo)軸(PCoA3)的貢獻值為18.0%。病株天麻組3個樣本相似性較高,而與健株天麻組的距離較遠,說明2組的真菌群落相似性較低,這可能是由于天麻產(chǎn)生病害后改變了原有的微生物群落結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致2組樣品的真菌群落相似性較低。

    表3 健株與病株天麻中真菌屬級分類單元的豐度Tab.3 Abundance of fungal genus taxa in healthy and diseased Gastrodia elata

    3 結(jié)論與討論

    本研究綜合傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)2種方法研究發(fā)現(xiàn),健株與病株天麻塊莖中真菌群落組成存在顯著差異,兩者真菌群落結(jié)構(gòu)相似性低。傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果表明,從不同健康狀態(tài)的天麻中共分離得到55株真菌,屬于14個屬,天麻中真菌多樣性表現(xiàn)為病株天麻組>健株天麻組,從健株天麻組中分離的每種真菌數(shù)量相差較小,菌群處于一個較平衡的狀況,而從病株天麻組中分離的各菌屬菌株數(shù)量不均勻,其中鐮刀菌屬、鏈格孢屬、青霉屬、枝孢屬菌株數(shù)量占比較大,鐮刀菌屬數(shù)量占比高達44.4%,為優(yōu)勢菌屬。沈清清等[25]研究表明,鐮刀菌屬是造成多種藥用植物根腐病的主要病原菌;王淑琴等[26]報道,鏈格菌屬能侵染植物,造成黑斑病。因此,推斷天麻內(nèi)各真菌種群豐度發(fā)生變化導(dǎo)致了天麻病害的發(fā)生。

    與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,高通量測序更全面地展現(xiàn)了健株和病株天麻塊莖內(nèi)的真菌群落。結(jié)果顯示,從天麻中共分析得到49個屬,1 692個OTUs,但病株天麻組>健株天麻組,真菌結(jié)構(gòu)相似性較低,菌屬類別存在明顯差異。其中,除未分類真菌外,土赤殼屬、木霉屬等5個屬在2組樣品中均存在,土赤殼屬占比最大且屬于植物致病菌,此菌屬在病株中的豐度高出健株3.6個百分點,進一步證明天麻發(fā)生病害后致病菌豐度升高。柔膜菌屬(Helotiales)和鐮刀菌屬均為植物致病菌,本試驗中天麻病株中鐮刀菌屬真菌豐度是健株的4.3倍,未分類柔膜菌屬真菌只存在于病株中,且豐度達到了9.81%,這3個屬可能會導(dǎo)致天麻發(fā)生病害。因此,患病天麻內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變是天麻發(fā)生病害的重要特征。

    研究天麻不同狀態(tài)下的真菌群落組成,可為探索天麻內(nèi)是否存在拮抗微生物提供新的線索。木霉屬真菌因其在生物防治中的應(yīng)用潛力而備受關(guān)注,在本研究中,木霉屬真菌在病株天麻和健株天麻中的豐度分別為4.63%和6.01%,菌株數(shù)量差異明顯,進一步說明天麻發(fā)生病害與其真菌群落的組成有關(guān),該研究結(jié)果有助于分離天麻內(nèi)的優(yōu)勢益生菌,通過添加益生菌可進一步驗證天麻患病的原因,為綠色防控天麻病害提供新思路。

    本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)結(jié)合的方式,更清楚地了解了健株天麻和病株天麻內(nèi)真菌群落的組成與差異,其中病株天麻塊莖內(nèi)真菌種群的豐度上升和致病菌屬相對豐度的增加,改變了天麻內(nèi)部原有的真菌群落結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致了天麻病害的發(fā)生。因此,患病天麻植株內(nèi)的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變是天麻發(fā)生病害的原因。

    猜你喜歡
    病株塊莖天麻
    神奇的天麻
    大自然探索(2024年1期)2024-02-29 09:10:34
    短期窖藏下馬鈴薯塊莖品質(zhì)指標(biāo)的變化趨勢
    你知道食天麻會引起“藥駕”嗎?
    豌豆抗白粉病資源田間評價試驗
    天麻無根無葉也能活
    中國南北方禽流感病毒蛋白進化差異的探究
    績溪縣水稻紋枯病發(fā)生特點及防治意見
    塊根塊莖類植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用
    基于HPLC-ESI-TOF/MS法分析測定烏天麻和紅天麻中化學(xué)成分的研究
    白及須根與塊莖的多糖成分比較研究
    国产精品亚洲一级av第二区| 精品国产国语对白av| 色老头精品视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 日韩大码丰满熟妇| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 老汉色∧v一级毛片| 久久狼人影院| 两个人视频免费观看高清| 久久这里只有精品19| 一级毛片女人18水好多| 午夜精品国产一区二区电影| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产熟女xx| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av成人av| 亚洲人成电影免费在线| 热re99久久国产66热| 黄色 视频免费看| 国产精品久久久av美女十八| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产亚洲欧美98| 一区二区三区国产精品乱码| 精品电影一区二区在线| 免费高清视频大片| 久99久视频精品免费| 午夜免费鲁丝| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品人人爽人人爽视色| 两人在一起打扑克的视频| 看片在线看免费视频| 国产一区二区三区视频了| 91麻豆精品激情在线观看国产| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜福利成人在线免费观看| 少妇 在线观看| 亚洲国产看品久久| www.www免费av| 黄色丝袜av网址大全| 9热在线视频观看99| 午夜福利欧美成人| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天堂影院成人在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品乱码久久久久久99久播| 99精品久久久久人妻精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 老熟妇仑乱视频hdxx| 天堂√8在线中文| 精品欧美国产一区二区三| 九色国产91popny在线| 精品不卡国产一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 国产成人欧美在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 久久午夜亚洲精品久久| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| 无人区码免费观看不卡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲人成77777在线视频| 一夜夜www| 午夜免费激情av| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 狂野欧美激情性xxxx| 国产成人av激情在线播放| 9191精品国产免费久久| 欧美日韩精品网址| 好男人电影高清在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 两性夫妻黄色片| 十分钟在线观看高清视频www| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 香蕉久久夜色| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一区福利在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 成人亚洲精品av一区二区| 激情在线观看视频在线高清| 岛国视频午夜一区免费看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产在线精品亚洲第一网站| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 色av中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品欧美国产一区二区三| 日日爽夜夜爽网站| 美女免费视频网站| 亚洲五月天丁香| 级片在线观看| 嫩草影视91久久| or卡值多少钱| 国产精品 欧美亚洲| 久久香蕉精品热| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品欧美国产一区二区三| 国产1区2区3区精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 级片在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费 | 久久久久久久久免费视频了| av中文乱码字幕在线| 免费高清在线观看日韩| √禁漫天堂资源中文www| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 在线免费观看的www视频| 后天国语完整版免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 制服人妻中文乱码| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩欧美免费精品| 最近最新中文字幕大全电影3 | 无遮挡黄片免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲五月色婷婷综合| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 看免费av毛片| 久久人人精品亚洲av| av视频在线观看入口| 国产av一区在线观看免费| 精品国产亚洲在线| 欧美日韩乱码在线| 欧美久久黑人一区二区| 男女午夜视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久青草综合色| 国产精品影院久久| 久久久久久久精品吃奶| 一级毛片女人18水好多| 国产三级在线视频| 中国美女看黄片| 中文字幕久久专区| 午夜免费成人在线视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜免费成人在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜久久久在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久影院123| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩欧美免费精品| 久久久国产成人精品二区| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美色视频一区免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美成人午夜精品| 99re在线观看精品视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜成年电影在线免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品,欧美在线| 久久精品成人免费网站| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩大码丰满熟妇| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 大陆偷拍与自拍| 热99re8久久精品国产| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美成人午夜精品| 一进一出好大好爽视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美性长视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲九九香蕉| 午夜老司机福利片| 国产精品野战在线观看| 欧美成人午夜精品| 久久精品影院6| 无人区码免费观看不卡| 在线观看舔阴道视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 身体一侧抽搐| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产成人精品在线电影| 一级作爱视频免费观看| 亚洲在线自拍视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 成人三级黄色视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 最近最新中文字幕大全电影3 | 韩国av一区二区三区四区| 乱人伦中国视频| 国产精品 国内视频| 可以在线观看毛片的网站| 美女午夜性视频免费| 麻豆国产av国片精品| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 18禁国产床啪视频网站| 午夜福利成人在线免费观看| av中文乱码字幕在线| a在线观看视频网站| 黑人操中国人逼视频| 亚洲激情在线av| av片东京热男人的天堂| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 人人澡人人妻人| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产麻豆成人av免费视频| 九色亚洲精品在线播放| 欧美日韩乱码在线| 成人精品一区二区免费| 深夜精品福利| 婷婷丁香在线五月| 国产精品影院久久| 香蕉国产在线看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 嫩草影院精品99| av天堂久久9| 最好的美女福利视频网| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 99国产精品一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩免费av在线播放| 久久精品91无色码中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 91成年电影在线观看| 级片在线观看| 丁香欧美五月| 国产国语露脸激情在线看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 香蕉丝袜av| 免费在线观看日本一区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产又爽黄色视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 一级黄色大片毛片| cao死你这个sao货| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美久久黑人一区二区| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜福利欧美成人| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲七黄色美女视频| 成人精品一区二区免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 高清在线国产一区| 国产不卡一卡二| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 国产亚洲欧美98| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 午夜视频精品福利| 国产色视频综合| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一级毛片高清免费大全| 日韩三级视频一区二区三区| 级片在线观看| 国产不卡一卡二| 操美女的视频在线观看| 亚洲全国av大片| 大香蕉久久成人网| 欧美不卡视频在线免费观看 | 啦啦啦 在线观看视频| 在线播放国产精品三级| 欧美黑人精品巨大| 国产成人欧美在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 女警被强在线播放| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 97人妻天天添夜夜摸| 性色av乱码一区二区三区2| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品日韩av在线免费观看 | 久久中文字幕人妻熟女| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 亚洲国产精品久久男人天堂| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 极品人妻少妇av视频| 欧美日韩黄片免| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 午夜福利一区二区在线看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产男靠女视频免费网站| 中文字幕人妻熟女乱码| ponron亚洲| 国产av又大| 麻豆成人av在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 免费观看人在逋| 怎么达到女性高潮| 亚洲国产看品久久| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 波多野结衣一区麻豆| 国产亚洲精品av在线| 午夜a级毛片| tocl精华| 亚洲专区字幕在线| 久久天堂一区二区三区四区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 99国产精品一区二区三区| 91精品三级在线观看| 成人国语在线视频| 精品不卡国产一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| www.熟女人妻精品国产| 自线自在国产av| 大型av网站在线播放| 脱女人内裤的视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 91麻豆av在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美黄色淫秽网站| 美女大奶头视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲第一av免费看| 色综合欧美亚洲国产小说| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 午夜福利18| aaaaa片日本免费| 大型黄色视频在线免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 男人舔女人的私密视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 成人国产一区最新在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 乱人伦中国视频| 久久这里只有精品19| 自线自在国产av| 热99re8久久精品国产| 亚洲 国产 在线| 女警被强在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| 中出人妻视频一区二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| www.999成人在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久热在线av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久青草综合色| 国产黄a三级三级三级人| 成人欧美大片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲av成人一区二区三| 免费看美女性在线毛片视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美成人免费av一区二区三区| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 欧美一级a爱片免费观看看 | 88av欧美| 啦啦啦韩国在线观看视频| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 香蕉久久夜色| 99国产精品一区二区蜜桃av| 激情在线观看视频在线高清| 高清毛片免费观看视频网站| 老汉色∧v一级毛片| 操出白浆在线播放| 男女午夜视频在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 国产激情欧美一区二区| 成在线人永久免费视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 99riav亚洲国产免费| 999久久久精品免费观看国产| 后天国语完整版免费观看| 少妇粗大呻吟视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成人欧美在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久精品成人免费网站| 激情视频va一区二区三区| 两性夫妻黄色片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 99久久国产精品久久久| 美女大奶头视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 男女床上黄色一级片免费看| 色播在线永久视频| 国产成人精品久久二区二区91| 一二三四在线观看免费中文在| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲全国av大片| 最新在线观看一区二区三区| 一区福利在线观看| 我的亚洲天堂| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 91在线观看av| av网站免费在线观看视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美色视频一区免费| 此物有八面人人有两片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲激情在线av| 久久青草综合色| 成在线人永久免费视频| 精品福利观看| 欧美色视频一区免费| 亚洲精品在线观看二区| 午夜久久久在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美成人性av电影在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 操出白浆在线播放| 美女免费视频网站| 欧美久久黑人一区二区| 成人免费观看视频高清| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久久久国内视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久草成人影院| 国产精品久久久人人做人人爽| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜福利免费观看在线| 国产亚洲精品一区二区www| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产99白浆流出| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 免费av毛片视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 免费看美女性在线毛片视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 波多野结衣av一区二区av| 成人18禁在线播放| 亚洲中文av在线| 国产免费男女视频| 18禁美女被吸乳视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲一区二区三区不卡视频| 午夜福利,免费看| 99久久综合精品五月天人人| 18禁观看日本| 男人操女人黄网站| 亚洲中文字幕日韩| 色播亚洲综合网| 手机成人av网站| 亚洲黑人精品在线| 成人国产综合亚洲| 一夜夜www| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 极品教师在线免费播放| 91在线观看av| 黑丝袜美女国产一区| 波多野结衣巨乳人妻| av有码第一页| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久久国产a免费观看| 波多野结衣巨乳人妻| 露出奶头的视频| 国产亚洲精品av在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品久久久精品久久久| 久久中文字幕人妻熟女| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 91av网站免费观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 69av精品久久久久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 中国美女看黄片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 制服诱惑二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 两性夫妻黄色片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 九色国产91popny在线| 丝袜美腿诱惑在线| 激情视频va一区二区三区| 国产区一区二久久| 88av欧美| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜福利欧美成人| 久久 成人 亚洲| 电影成人av| 日韩精品青青久久久久久| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲无线在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 日本vs欧美在线观看视频| 丰满的人妻完整版| 亚洲国产欧美网| 日韩大码丰满熟妇| 无遮挡黄片免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 狂野欧美激情性xxxx| 老汉色av国产亚洲站长工具| 激情在线观看视频在线高清| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 长腿黑丝高跟| 美女国产高潮福利片在线看| 国产麻豆成人av免费视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 91九色精品人成在线观看| 亚洲人成电影观看| 村上凉子中文字幕在线| 日韩大尺度精品在线看网址 | 悠悠久久av| 色av中文字幕| 久久久久久大精品| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲欧美激情综合另类| 深夜精品福利| 曰老女人黄片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美色视频一区免费| 亚洲片人在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 91国产中文字幕| 午夜福利欧美成人| 久久久久久久久中文| 大香蕉久久成人网| 午夜福利欧美成人| 亚洲av片天天在线观看| 青草久久国产| 国产真人三级小视频在线观看| 久久 成人 亚洲| www.www免费av| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品野战在线观看| 在线观看午夜福利视频| 成人三级黄色视频| 国产成人免费无遮挡视频| 最近最新免费中文字幕在线| 最好的美女福利视频网| 免费观看精品视频网站| 中亚洲国语对白在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 一级毛片精品| 午夜免费激情av| 午夜福利欧美成人| 精品国产国语对白av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本 av在线| 一本综合久久免费| av福利片在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩精品中文字幕看吧| 精品国产一区二区久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品福利观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| av有码第一页| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久中文字幕人妻熟女|