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    外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛和香氣物質(zhì)的影響

    2021-03-09 02:50:40賀凌霄孫聚濤張智強(qiáng)丁永樂楊鐵釗徐世曉程昌合
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:腺毛赤霉素內(nèi)源

    賀凌霄,薛 剛,孫聚濤,張智強(qiáng),丁永樂,楊鐵釗,徐世曉,程昌合

    (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院,河南 鄭州 450002; 2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,浙江 杭州 310024)

    赤霉素與高等植物的生物合成調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理活動(dòng)發(fā)生互作[1-4]。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥腺毛的生長(zhǎng)需要赤霉素進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。煙草中,腺毛不僅能起到保護(hù)作用,還是一種重要的分泌器官,其分泌物與煙葉香氣質(zhì)和香氣量的形成存在密切關(guān)系[7],且在一定程度上反映煙葉的某些品質(zhì)特性,如香氣、吃味等[8-9]。

    赤霉素與煙草葉面腺毛主要分泌物(西柏烷類)同為二萜類化合物,有共同的底物香葉基香葉基焦磷酸(Geranylgeranyl-PP,GGPP)。在赤霉素途徑中,GGPP經(jīng)柯巴基焦磷酸合酶(Ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)、內(nèi)-貝殼杉烯合成酶(Ent-kaurene synthase,KS)的催化作用形成內(nèi)-貝殼杉烯(Ent-kaurene),然后在內(nèi)-貝殼杉烯氧化酶(Ent-kaurene oxidase,KO)、內(nèi)-貝殼杉烯酸氧化酶(Ent-kaurenoic acid oxidase,KAO)氧化作用下轉(zhuǎn)化成GA12,后通過GA20-氧化酶(GA20-oxidase,GA20ox)、GA2-氧化酶 (GA2-oxidase,GA2ox) 等的作用合成具有生物活性的赤霉素[10-13]。而在西柏烷類途徑中,首先,西柏三烯醇環(huán)化酶(Cembratrien-ol synthase,CBTS)經(jīng)CYC-1基因編碼[14]后,使GGPP發(fā)生環(huán)化反應(yīng),形成西柏三烯一醇[15],然后在細(xì)胞色素 P450 羥化酶(Cytochrome P450 hydroxylase,CYP450)的作用下,西柏三烯一醇的第6位碳發(fā)生羥化反應(yīng)形成西柏三烯二醇[16]。

    圍繞外源赤霉素對(duì)煙草生長(zhǎng)和品質(zhì)調(diào)控的影響,前人已開展了一些研究。周繼華等[17]研究表明,對(duì)煙草外施一定濃度的赤霉素,煙株莖尖內(nèi)源赤霉素與生長(zhǎng)素含量提高,煙草株高與節(jié)間距顯著增加。李振華[18]研究發(fā)現(xiàn),煙草種子在100 mg/L GA3溶液引發(fā)24 h后,胚根萌發(fā)更加整齊一致。王林等[19]探究發(fā)現(xiàn),增施赤霉素及生長(zhǎng)素均可改善烤后煙葉的香氣成分、物理特性和化學(xué)成分,且濃度越高效果越優(yōu)。李浩亮等[20]發(fā)現(xiàn),在打頂當(dāng)天噴施20 mg/L赤霉素可明顯提高烤后煙葉的鉀含量,降低上部煙葉煙堿含量,并使上部和中部煙葉的主要化學(xué)成分具有較好的協(xié)調(diào)性。截至目前,外施赤霉素對(duì)煙草的影響研究多集中在對(duì)株高和種子萌發(fā)的調(diào)控方面,且對(duì)烤煙品質(zhì)的影響多集中在理化性質(zhì)方面,對(duì)煙草葉面腺毛及香氣物質(zhì)的研究較少[21-22]。鑒于此,以烤煙品種中煙100、NC71為材料,于苗期噴施赤霉素,研究外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛密度及分泌物的影響,以期增加烤后煙葉中性致香成分萜類降解產(chǎn)物的含量,提高煙葉品質(zhì),同時(shí)為明確赤霉素在西柏烷類物質(zhì)合成代謝途徑中的作用提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)地概況及供試材料

    試驗(yàn)于2019年在許昌市襄城縣王洛鎮(zhèn)進(jìn)行,選擇土壤肥力中上等且均勻、地勢(shì)平坦、排灌方便、前茬一致的生茬地塊作為試驗(yàn)地,土壤為褐土。供試烤煙品種為中煙100、NC71,由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。赤霉素(GA3)粉劑(HPLC≥90.0%)由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    試驗(yàn)共4個(gè)處理,分別為未經(jīng)赤霉素噴施的中煙100(ZY100)、NC71和經(jīng)赤霉素噴施的中煙100(ZY100G)、NC71(NC71G)。烤煙于2019年3月1日播種,5月1日移栽,移栽時(shí)對(duì)準(zhǔn)煙草莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)噴施赤霉素,噴施時(shí)間為傍晚17:30—18:30,噴施時(shí)液滴細(xì)小且均勻,用量以噴施部位藥液下滴為度。赤霉素噴施液由100 mg/L赤霉素和20 mL/L表面活性劑吐溫80組成,赤霉素質(zhì)量濃度設(shè)定參照劉超等[23]的方法。7月10日打頂,其他栽培措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范執(zhí)行。

    1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

    1.3.1 煙草腺毛形態(tài)觀察和腺毛密度統(tǒng)計(jì) 在中部葉葉齡50 d時(shí)取樣[24],用2 g/L羅丹明B水溶液染色,葉片上表面朝上置于VHX-600V超景深顯微鏡(日本基恩士公司)下進(jìn)行腺毛形態(tài)觀察和腺毛密度統(tǒng)計(jì)。每個(gè)樣本取3個(gè)葉片,每個(gè)葉片觀察3個(gè)視野計(jì)數(shù)。

    1.3.2 葉面腺毛分泌物含量測(cè)定 在中部葉葉齡60 d時(shí)取樣[24],參照陳偉等[25]的方法,在煙葉主脈兩側(cè)分別截取直徑為9 cm的葉圓片共20片,將各處理葉圓片置于500 mL二氯甲烷中浸提。收集剩余的二氯甲烷加入10 g無(wú)水硫酸鈉,過濾后加入1 mL含正-17-烷醇的內(nèi)標(biāo),并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至50 mL,經(jīng)氮吹和衍生化反應(yīng)后,進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。通過NIST12檢索譜庫(kù)定性,并使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

    1.3.3 中性致香成分含量檢測(cè) 同時(shí)蒸餾萃取裝置一端接入500 mL圓底燒瓶,加入10.000 g烤后煙樣(C3F)、1.0 g檸檬酸和350 mL蒸餾水,恒溫電熱套加熱;另一端接入250 mL圓底燒瓶,加入40 mL二氯甲烷、500 μL含硝基苯的內(nèi)標(biāo),恒溫水浴鍋加熱。2.5 h后收集250 mL圓底燒瓶中的液體,加入10 g無(wú)水硫酸鈉過濾后,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至1 mL左右,采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析。通過NIST12檢索譜庫(kù)定性,并使用內(nèi)標(biāo)法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量,并對(duì)測(cè)得的物質(zhì)按照姜慧娟[26]的方法進(jìn)行分類。

    1.3.4 內(nèi)源激素含量測(cè)定 噴施赤霉素后0、10、20、30、40、50、60、70 d,采集各處理中部葉 0.5 g新鮮煙草樣品,用液氮速凍后,存放于超低溫冰箱中,采用由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心提供的酶免疫試劑盒(ELISA)[27]進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.5 煙草葉片總RNA的提取及基因表達(dá)分析 采用Plant RNA isolation Aid提取供試材料中部葉葉齡60 d時(shí)葉片總RNA,利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme,R223-01)將待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,引物采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)(表1)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

    表1 熒光定量引物序列Tab.1 Sequences of fluorescence quantitative primers

    利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q311-03,Vazyme)在LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche,Swiss)上進(jìn)行反應(yīng)。以NtL25為內(nèi)參基因,依據(jù)Ct值,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并作圖。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖,使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛形態(tài)和密度的影響

    根據(jù)圖1可知,NC71G的腺毛長(zhǎng)度顯著高于其他處理,較未噴施的NC71顯著增加了118.95 μm;NC71、NC71G的腺毛直徑顯著大于ZY100、ZY100G;

    腺毛密度表現(xiàn)為NC71G>NC71>ZY100G>ZY100,其中NC71G處理顯著高于NC71處理,ZY100G處理顯著高于ZY100,噴施赤霉素后烤煙葉面腺毛密度平均提高30.97%??梢姡瑖娛┏嗝顾赜兄谔岣呖緹熑~面腺毛密度。

    2.2 外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛分泌物的影響

    根據(jù)圖2可知,西柏烷類在烤煙葉面腺毛分泌物中含量最高。中部葉葉齡60 d時(shí),NC71的西柏烷類含量明顯高于ZY100。噴施赤霉素后,2個(gè)烤煙品種西柏烷類含量占比均有明顯增加,烷烴類含量占比明顯減少。ZY100G、NC71G的西柏烷類含量均高于未噴施赤霉素處理,分別提高40.91%、37.92%;葉面腺毛分泌物總含量分別提高了39.23%、35.64%,表明莖尖噴施赤霉素對(duì)烤煙葉面分泌物含量影響較大,特別是西柏烷類含量,有助于提高煙葉的香味特征。

    2.3 外源赤霉素對(duì)烤后煙葉中性致香成分的影響

    根據(jù)圖3可知,新植二烯在中性致香成分中占比最大。葉面噴施赤霉素后,烤后煙葉類西柏烷降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、其他類中性致香成分含量均顯著增高,其中NC71G各類中性致香成分含量顯著高于其他處理。噴施赤霉素后,2個(gè)烤煙品種類西柏烷降解產(chǎn)物含量平均提高了70.35%,類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量平均提高了85.89%,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量平均提高了70.52%,芳香族氨基酸降解產(chǎn)物含量平均提高了86.76%,表明葉面噴施赤霉素對(duì)中性致香成分的影響較大,有助于提高烤煙的香味特征。

    2.4 外源赤霉素對(duì)烤煙內(nèi)源赤霉素含量的影響

    根據(jù)圖4可知,噴施赤霉素20~70 d,NC71G、ZY100G內(nèi)源赤霉素含量較未噴施赤霉素的NC71、ZY100顯著增加。噴施赤霉素后40 d,4個(gè)處理內(nèi)源赤霉素含量均達(dá)到高峰,之后逐漸下降。ZY100G在噴施赤霉素10 d后內(nèi)源赤霉素含量顯著高于其他處理,NC71G在噴施赤霉素20 d后內(nèi)源赤霉素含量顯著高于NC71,且與ZY100差異不顯著。可見,苗期噴施赤霉素有助于增加烤煙植株內(nèi)源赤霉素含量,但不同品種間對(duì)外源赤霉素的響應(yīng)快慢存在差異。

    2.5 外源赤霉素對(duì)烤煙赤霉素和西柏烷類物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

    根據(jù)圖5可知,噴施外源赤霉素后,2個(gè)烤煙品種CYC-1、CPS和GA20ox基因的表達(dá)量均上調(diào),GA2ox基因的表達(dá)量下調(diào)。ZY100G除CPS表達(dá)量與ZY100差異不顯著外,CYC-1、GA20ox、GA2ox基因的表達(dá)量均與ZY100有顯著差異;NC71G 以上4個(gè)基因的表達(dá)量與NC71均有極顯著差異。

    3 結(jié)論與討論

    研究表明,細(xì)胞外赤霉素濃度高時(shí),赤霉素受體GA IN-SENSITIVE DWARF1(GID1)通過其C端結(jié)構(gòu)域與赤霉素結(jié)合并引發(fā)相關(guān)應(yīng)答反應(yīng),從而提高內(nèi)源赤霉素含量[28]。本研究在噴施赤霉素后每隔10 d測(cè)定1次各處理內(nèi)源赤霉素的含量,發(fā)現(xiàn)苗期噴施赤霉素有助于增加植株內(nèi)源赤霉素的含量,同時(shí)赤霉素合成正調(diào)控基因CPS、GA20ox表達(dá)量上調(diào),負(fù)調(diào)控基因GA2ox表達(dá)量下調(diào)。

    腺毛是存在于大多數(shù)維管植物表面的表皮細(xì)胞突起,保護(hù)植物免受昆蟲、食草動(dòng)物、紫外線和水分流失的侵害[29-30]。此前,有研究已確定,赤霉素在擬南芥腺毛生長(zhǎng)過程中起著重要作用[5-6,31]。MATIAS-HERNANDEZ等[32]對(duì)轉(zhuǎn)錄因子TEMs功能的發(fā)現(xiàn),強(qiáng)調(diào)了赤霉素的運(yùn)輸和分布對(duì)擬南芥腺毛形成調(diào)控的重要性。本研究結(jié)果表明,外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛密度有正向調(diào)節(jié)作用,與前人研究結(jié)果[5-6]相近。有研究表明,赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)影響腺毛生長(zhǎng)關(guān)鍵基因的啟動(dòng)。在影響腺毛生長(zhǎng)的基因中,GLABRA1(GL1)和TRANSPARENT TESTA GLABRA(TTG)基因的作用是啟動(dòng)腺毛的生長(zhǎng)[33-34],其中GL1蛋白序列與被赤霉素上調(diào)的Myb家族轉(zhuǎn)錄因子同源[35-36],而TTG基因在腺毛形成中的功能可被與GA信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)R基因所替代[37]。

    煙草葉面腺毛除保護(hù)葉片外,還會(huì)特異性合成并分泌二萜化合物等香味物質(zhì)[38]。本研究發(fā)現(xiàn),外源赤霉素提高了腺毛分泌物含量,其中,二萜化合物的主要組分類西柏烷及其降解產(chǎn)物含量均有顯著增加,四萜類物質(zhì)類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量顯著增加。有研究表明,腺毛密度是腺毛分泌物積累的基礎(chǔ)條件[39]。在青蒿的研究中發(fā)現(xiàn),內(nèi)源赤霉素含量提高有利于其萜類物質(zhì)含量的增加[40]。赤霉素是二萜化合物的一種,與西柏烷類、類胡蘿卜素的直接前體物質(zhì)脫落酸有著共同的前體物質(zhì)GGPP[10-12,41-42]。通過施加外源赤霉素可以增加內(nèi)源赤霉素的產(chǎn)生,節(jié)省了前體物質(zhì)GGPP在此合成途徑中的消耗,進(jìn)而增加了其他萜類合成途徑前體物質(zhì)的可用量,提高了西柏三烯醇環(huán)化酶[43]、八氫番茄紅素合成酶(Phytoene synthase,PSY)[44]的活性,并促進(jìn)了西柏三烯醇環(huán)化酶的編碼基因CYC-1表達(dá)量的上調(diào),從而增加了西柏烷類、類胡蘿卜素的合成與積累。

    本研究發(fā)現(xiàn),在苗期對(duì)煙草莖尖噴施外源赤霉素后,不僅有效增加了煙草葉面腺毛密度,并且通過增加煙草內(nèi)源赤霉素含量,提高了葉面腺毛分泌物萜類物質(zhì)的含量,進(jìn)而增加了萜類化合物西柏烷降解產(chǎn)物和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量,表明外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛生長(zhǎng)具有正向調(diào)節(jié)作用,而且增加了葉面腺毛分泌物的含量,提高了煙葉質(zhì)量,為研究赤霉素在萜類代謝中的作用提供了借鑒意義。

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