施氮和根系分隔對玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根系形態(tài)和固氮能力的影響

王立波，邵澤強，陸文龍

(1.吉林農業(yè)科技學院 生物與制藥工程學院，吉林 吉林 132101；2.吉林化工學院 資源與環(huán)境工程學院，吉林 吉林 132022；3.吉林農業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，吉林 長春 130118)

吉林省地處我國東北農牧交錯區(qū)[1]，是我國重要的商品糧和畜牧業(yè)生產基地，為我國的社會穩(wěn)定發(fā)展提供了有力保障。但是，長期的集約化種植和過量施用化學氮肥對該地區(qū)的糧食產量和土壤生態(tài)環(huán)境產生了負面影響[2]，嚴重制約了當地農業(yè)發(fā)展。因此，如何調整作物種植結構和減量施用化學氮肥是該地區(qū)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展面臨的主要問題。間作種植模式因其在我國具有悠久的歷史和諸多的優(yōu)勢成為當前解決上述問題的主要途徑[3]，尤其是禾豆間作在氮素高效利用方面具有明顯的優(yōu)勢。玉米和紫花苜蓿是該地區(qū)主要的糧食作物和豆科牧草，玉米/紫花苜蓿間作具有廣闊的應用前景。

禾豆間作能夠利用豆科作物的生物固氮特性[4]，將空氣的氮氣固定轉變成生長需要的銨態(tài)氮，更重要的是豆科作物還能將固定的一部分氮素轉移給與之間作的作物吸收利用[5]。這樣在生產中就能達到減少氮肥施用量的目的[6-7]。大量研究發(fā)現，在禾豆間作體系中，豆科作物的結瘤數量、質量和固氮量得到提高[8-11]。LI等[12]發(fā)現，與豌豆單作相比，玉米/豌豆間作體系可以使豌豆的根瘤數量和質量分別增加29.63%和48.21%。采用15N自然豐度法研究玉米/蠶豆間作系統(tǒng)發(fā)現，與蠶豆單作相比，玉米/蠶豆間作體系可以使蠶豆的單株根瘤的質量平均增加22.5%，同時在初花期、盛花期、鼓粒期和成熟期的固氮量分別提高8%～33%、54%～61%、18%～50%和7%～72%，說明間作增強了蠶豆根瘤的固氮能力[11]。發(fā)生上述現象的主要機制可能是在禾豆間作體系中根系接觸產生了一系列的生理生化反應，從而促進了豆科固氮能力的增強[13]。由此可見，間作體系中作物之間的距離是影響豆科作物生物固氮能力的重要因素[4]。SUN等[14]研究發(fā)現，根系形態(tài)的變化是影響玉米/紫花苜蓿間作體系中氮素高效利用的重要因素。由此可見，根系形態(tài)是影響作物氮素吸收和生長的重要因素[15]。然而，在玉米/紫花苜蓿間作體系中，根系形態(tài)的改變是否也同樣影響紫花苜蓿根瘤的固氮能力到目前為止還未見報道。為此，探究施氮和根系分割對玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根系形態(tài)和固氮特征的影響，為充分挖掘豆科作物的生物固氮潛力、降低化學氮肥施用量以及現代農業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供重要理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地點概況及試驗材料

試驗于2016年在吉林農業(yè)大學現代化溫室(43°56′30″N、126°27′55″E，海拔190 m)中進行，該區(qū)屬于溫帶大陸性季風氣候，四季分明，雨熱同期。試驗作物生長季內的平均氣溫19.4 ℃，無霜期130 d，降雨量約498.4 mm，積溫2 600 ℃。供試土壤為黑土，具體理化性質見表1。

供試玉米和紫花苜蓿品種分別為鄭單958(由吉林省四平市神農種業(yè)有限公司提供)和東苜1號(由東北師范大學草地所提供)。供試紫花苜蓿根瘤菌液由吉林農業(yè)大學資源與環(huán)境學院微生物教研室提供，含根瘤菌數3.0×107個/mL。供試肥料由吉林隆源農業(yè)股份有限公司提供，氮肥是尿素(含N 46%)，磷肥為過磷酸鈣(含P2O546%)，鉀肥為氯化鉀(含K2O 60%)。

表1 供試土壤的理化性質Tab.1 Physical and chemical properties of the tested soil

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，每個盆(45 cm×30 cm×50 cm)中裝51 kg干土，播種2～3粒玉米種子，在玉米二葉期開始間苗，每個盆中只保留1株玉米。紫花苜蓿播種量為18 kg/hm2，在苗期進行定植和間苗。試驗采用完全隨機區(qū)組設計，設2個施氮水平：不施氮(N0)和施氮(N1)，3種根系分隔模式：塑料板分隔(PSS)、尼龍網分隔(NNS)、根系完全不分隔(NS)，每個處理設4次重復。為了確保紫花苜蓿在試驗過程中能夠充分結瘤，紫花苜蓿間苗后在其根部澆灌20 mL/盆的根瘤菌液。為了同時滿足玉米和紫花苜蓿生長的需要，施N 225.0 kg/hm2、P2O5135.0 kg/hm2、K2O 90.0 kg/hm2。根據上述施肥量進行換算，盆栽N1處理的N、P2O5、K2O施用量分別為0.20、0.12、0.08 g/kg，N0處理P2O5、K2O施用量同N1處理。播種時間為6月1日，紫花苜蓿根系挖掘時間為10月18日，紫花苜蓿接種根瘤菌時間為6月18日。適時灌水以滿足供試作物對水分的需求，除草和病蟲害的防治等措施均按當地常規(guī)生產進行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 根系形態(tài)指標 玉米成熟期，采用挖掘法將紫花苜蓿根系整體挖出，抖落根系上附著的大土塊，將根系放到紗網中用水管沖洗干凈，并帶回實驗室，用吸水紙將根系上的水吸干，并用剪子剪成等長度的根段，保存在75%的乙醇中，然后用Epson(V800)掃描儀掃描根系，掃描圖片用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)(Regent公司,Canada,2013)進行分析，獲得紫花苜蓿的根長、根表面積、根體積等指標。本研究將根系直徑設置4個莖級，D1：0<直徑≤0.5 mm，D2：0.5 mm<直徑≤1 mm，D3：1 mm<直徑≤1.5 mm，D4：直徑>1.5 mm。

1.3.2 根瘤數、根瘤干質量及豆血紅蛋白含量 10月18日開始取樣，采用挖掘法用鐵锨挖約50 cm 深，取出整株紫花苜蓿 10 株置于編織袋上，輕輕抖落根上的土，收集掉落的根瘤，并將抖落土中的根瘤挑選干凈。將取回的樣品放在0.15 mm篩中用流水沖洗，摘可見根瘤，計數，風干，測定根瘤干質量；紫花苜蓿根瘤的豆血紅蛋白含量參照WANG等[4]的方法進行測定。

1.3.3 固氮率及固氮量 本研究采用自然豐度法測定紫花苜蓿的固氮率，計算方法參考SHEARER等[16]的公式。

式中，δ15N為植物地上部15N豐度相對于大氣15N豐度的變化，B為紫花苜蓿在沙培試驗中不施氮條件下植株中的15N自然豐度值。在前期研究中獲知B值為-0.92[4]。

固氮量采用下面公式[4]進行計算：

固氮量=固氮率×紫花苜蓿干質量×紫花苜蓿氮含量。

1.4 數據處理

采用Excel 2010對數據進行整理、統(tǒng)計和分析，采用SAS 9.2雙因素ANOVA分析和多重比較法(Tukey’s HSD)檢驗各處理間的差異顯著性，采用GraphPad Prism 6.02繪圖。

2 結果與分析

2.1 施氮和根系分隔對玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿不同莖級根系形態(tài)的影響

由圖1可知，施氮能夠增加紫花苜蓿根系不同莖級根長。與N0處理相比，施氮處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根長分別增加42.4%、14.6%、0.7%、31.8%。其中，D1莖級根長增加幅度最大，D3莖級增加幅度最小。在4個莖級中，D1莖基所占比例最大，D3莖級所占比例最小。

根系分隔增加紫花苜蓿4個莖級的根長(圖1)。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根長分別降低19.0%、22.4%、22.7%、40.2%和9.2%、19.5%、16.2%、9.5%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根長分別降低10.7%、3.6%、7.8%、33.9%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根長分別降低17.5%、32.3%、26.7%、19.1%和12.0%、21.8%、13.9%、2.6%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根長分別降低6.3%、13.5%、14.8%、16.9%。

施氮能夠增加紫花苜蓿根系不同莖級根表面積(圖1)。與N0處理相比，施氮處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根表面積分別增加17.9%、7.9%、19.3%、28.6%。其中，D4莖級根表面積增加幅度最大，D2莖級增加幅度最小。4個莖級中，根表面積以D4莖級所占比例最大，D3莖級所占比例最小。

根系分隔方式增加紫花苜蓿4個莖級根表面積(圖1)。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根表面積分別降低19.5%、18.0%、36.4%、42.6%和5.6%、5.1%、10.3%、30.4%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根表面積分別降低14.7%、13.6%、29.1%、17.6%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根表面積分別降低24.1%、12.8%、41.1%、35.2%和16.7%、6.1%、28.2%、10.2%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根表面積分別降低8.8%、7.1%、17.9%、27.9%。

施氮能夠增加紫花苜蓿根系不同莖級根體積(圖1)。與N0處理相比，施氮處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根體積分別增加8.1%、32.3%、4.7%、22.3%。其中，D2莖級根體積增加幅度最大，D3莖級增加幅度最小。4個莖級中，根體積以D4莖級所占比例最大，D1莖級所占比例最低(圖1)。

根系分隔增加紫花苜蓿4個莖級根體積(圖1)。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根體積分別降低48.1%、21.6%、14.7%、63.0%和30.4%、12.4%、7.5%、43.8%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根體積分別降低25.4%、10.4%、7.8%、34.2%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根體積分別降低32.7%、28.1%、18.0%、50.4%和42.2%、8.2%、12.2%、31.5%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個莖級根體積分別降低16.5%、21.7%、6.6% 27.5%。

總之，在玉米/紫花苜蓿間作體系中，施氮能促進紫花苜蓿不同莖級根長、根表面積、根體積增加，根長以D1增幅最大，根表面積以D4莖級增幅最大，根體積以D2莖級增幅最大；根系分隔能促進紫花苜蓿根長、根表面積、根體積增加，對D4莖級影響最大，相反的，根系不分割會抑制紫花苜蓿根系生長。

2.2 施氮和根系分隔對玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根瘤數、根瘤干質量的影響

施氮水平、根系分隔方式以及二者的交互作用對紫花苜蓿根瘤數、根瘤干質量的影響均達到顯著、極顯著水平(表2)。由表2可知，與N0處理相比，N1處理紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量分別降低33.8%、64.5%。N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量分別增加69.5%、76.4%和49.3%、61.4%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量分別增加13.5%、9.3%。N1條件下，與PSS處理相比， NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量分別增加45.5%、97.6%和42.8%、45.5%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量分別增加1.9%、35.8%。

2.3 施氮和根系分隔對玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿固氮量和固氮率的影響

施氮水平、根系分隔方式以及二者的交互作用對紫花苜蓿的固氮率和固氮量影響極顯著(表3)。由表3可知，與N0處理相比， N1處理紫花苜蓿的固氮率和固氮量分別降低29.4%和17.0%。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加148.2%、52.9%和66.0%、41.9%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加49.5%和7.8%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加105.5%、30.0%和58.6%、26.2%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加29.6%、2.9%。

2.4 施氮和根系分隔對玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根瘤豆血紅蛋白含量的影響

由圖2可知，與N0處理相比， N1處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量降低55.4%。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量分別增加73.3%和43.3%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量增加20.9%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量分別增加42.6%和18.2%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量增加20.7%。

表2 施氮和根系分隔對紫花苜蓿根瘤數量和干質量的影響Tab.2 Effects of nitrogen application levels and root separation patterns on the number and dry weight of alfalfa nodules

表3 施氮和根系分隔對紫花苜蓿固氮率和固氮量的影響Tab.3 Effects of nitrogen application levels and root separation patterns on the nitrogen fixation rate and nitrogen fixation amount of alfalfa nodules

2.5 玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿固氮率與其根瘤數、根瘤干質量、豆血紅蛋白含量、根系形態(tài)的相關分析

由圖3可知，無論施氮與否，玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿固氮率與根瘤數(N0：R2=0.747 9,P<0.01；N1:R2=0.581 5,P<0.01)、根瘤干質量(N0：R2=0.642 6,P<0.01；N1:R2=0.555 4,P<0.01)、根瘤豆血紅蛋白含量(N0：R2=0.916 2,P<0.01；N1:R2=0.745 0,P<0.01)均呈極顯著正相關，與紫花苜蓿根長(N0：R2=0.834 2,P<0.01；N1:R2=0.655 8,P<0.01)、根表面積(N0：R2=0.830 0,P<0.01；N1:R2=0.773 3,P<0.01)、根體積(N0：R2=0.892 3,P<0.01；N1:R2=0.923 8,P<0.01)均呈極顯著負相關。

3 結論與討論

施氮能夠促進植物的生長[17]，在本試驗中也取得了類似的結果。但是，在本研究中，施氮降低了紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量，說明施氮會抑制玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿的固氮能力，存在“氮阻遏”現象[8]。因此，在實際生產中應該調控好氮肥的施用量，以使紫花苜蓿的生物固氮能力達到最大化。

本研究還發(fā)現，無論施氮與否，3種根系分隔條件下紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量都存在顯著的差異。紫花苜蓿的根瘤量、根瘤干質量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量均表現為NS>NNS>PSS。說明玉米/紫花苜蓿間作體系中存在明顯的種間交互作用，這在蠶豆/玉米間作體系中也得到了驗證[8]，同時也說明在NS條件下存在明顯的種間競爭作用[18]，而前人的研究表明，在禾豆間作體系中禾本科作物的競爭能力一般大于豆科作物[19-20]，種間的競爭促進了紫花苜蓿的生物固氮能力。3種根系分隔方式在施氮條件下都存在明顯的“氮阻遏”現象，3種根系分隔方式下紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量均是在PSS條件下最低，在NS條件下最高。這說明，玉米/紫花苜蓿間作具有明顯的減緩“氮阻遏”效應，這與玉米/蠶豆間作系統(tǒng)中獲得的試驗結果是一致的[8]。另外，NS和NNS條件下，紫花苜蓿的根瘤數、根瘤干質量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量也都有不同程度的差異，這說明，在玉米/紫花苜蓿間作體系中除了水分和養(yǎng)分的流動能夠影響紫花苜蓿的生長和生物固氮能力之外，根系接觸也是影響紫花苜蓿生長和生物固氮能力的一個重要因素?？赡艿脑蚴窃谟衩?紫花苜蓿間作體系中根系接觸縮短了水分和養(yǎng)分的運輸距離[21]。相關性分析表明，玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿的固氮率與根瘤數、根瘤干質量和豆血紅蛋白含量在N0和N1條件下均呈極顯著的正相關關系，這與REDIET等[22]在玉米/大豆間作體系的研究結果是一致的。因此，在研究中可以采用豆科作物的根瘤數、根瘤干質量和豆血紅蛋白含量指標來評價豆科作物的固氮能力[22-23]。同時，通過分析紫花苜蓿4個莖級根系的形態(tài)發(fā)現，無論施氮與否，在NS和NNS條件下紫花苜蓿4個莖級根系的根長、根表面積和根體積都受到明顯的抑制，顯著低于PSS處理。但在莖級為0～0.5 mm時根長、根表面積和根體積明顯大于其他莖級。相關性分析表明，在玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿的根長、根表面積和根體積與固氮率均呈極顯著負相關，由此可見，在玉米/紫花苜蓿間作體系中，玉米和紫花苜蓿之間存在明顯的種間競爭作用[5]。

綜上所述，施氮和根系分隔都能促進玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根系生長，但會抑制紫花苜蓿的固氮能力。在實際生產中，玉米/紫花苜蓿間作體系可以降低化學氮肥的施用量，這對于減肥增效和農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的應用價值。