襄陽兩種土壤類型對花生貯藏期黃曲霉菌 及其毒素污染風(fēng)險(xiǎn)的影響研究

朱夢潔，王 雪，張姝娟，張 倩，褚乾梅，王 盾*，馮 鵬*

(1.襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 襄陽 441057； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，花生種植面積在我國油料作物中居于第三位，但其總產(chǎn)量居于首位，其單產(chǎn)高、含油量高、營養(yǎng)價(jià)值高，一直是我國的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品[1]。然而，由黃曲霉菌(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)等侵染花生后產(chǎn)生的黃曲霉毒素具有劇毒和強(qiáng)致癌性，是威脅花生品質(zhì)安全、限制產(chǎn)業(yè)發(fā)展和出口貿(mào)易的主要危害因子[2]。黃曲霉毒素污染既可發(fā)生在花生結(jié)果、成熟和收獲的過程中，也可發(fā)生在花生干燥、收購、加工、倉儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)冗^程中[3]?；ㄉL過程中發(fā)生的毒素污染稱為收獲前黃曲霉毒素污染(preharvest aflatoxin contamination)，收獲晾曬后發(fā)生的毒素污染稱為收獲后污染(postharvest aflatoxin contamination)，迄今我國主要針對花生收獲后貯藏期間黃曲霉毒素污染展開相關(guān)研究[3-4]。我國幅員遼闊，南北氣候、土壤、環(huán)境等差異較大，花生黃曲霉毒素污染呈現(xiàn)明顯的地域特征[5]，近年來，隨著氣候、環(huán)境和生產(chǎn)方式的變化，花生黃曲霉毒素污染有局部加重趨勢，總體表現(xiàn)為由北至南，黃曲霉毒素污染逐漸加重。華北地區(qū)常年氣候干燥、年均降水量少，花生受黃曲霉污染程度較輕；而長江流域及東南沿海地區(qū)高溫高濕、梅雨季節(jié)持續(xù)時(shí)間長，有利于黃曲霉侵染花生，從而致使黃曲霉毒素污染嚴(yán)重[6]。

襄陽位于漢水中游，地處暖溫帶向亞熱帶過渡地區(qū)，東經(jīng)110°45'～113°47'，北緯31°13'～32°35'，具南北過渡性氣候特點(diǎn)，屬北亞熱帶季風(fēng)氣候雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，區(qū)域熱量好、光照足、積溫多、降水均勻，自然資源條件優(yōu)越，生態(tài)條件適宜花生生產(chǎn)種植，是全省、全國花生主產(chǎn)區(qū)和主要集散地之一?；ㄉ且环N具有地上開花、地下結(jié)果特性的農(nóng)作物，花生生長期間，其莢果直接與土壤接觸，研究表明，土壤是花生黃曲霉菌的主要來源，花生中的黃曲霉與土壤中黃曲霉有直接的聯(lián)系[7-9]。張初署和朱婷婷等對我國南北不同產(chǎn)區(qū)花生黃曲霉毒素污染情況的調(diào)查表明，我國長江中下游地區(qū)土壤中具有較高的黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn)[2,10]。然而，不同土壤類型與花生中黃曲霉毒素污染的聯(lián)系有著不同的報(bào)道：砂壤土有利于黃曲霉孢子的快速傳播與增殖，特別是在生長后期遇到高溫干旱的條件，花生受黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)較高；相反，由于黏度較高的土壤具有較好的持水力，因此受到干旱脅迫的可能性較低，從而可以減少花生黃曲霉毒素的污染水平[11]。然而，張杏在不同土壤類型黃曲霉菌株分布的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，黃黏土中的菌落數(shù)顯著高于砂壤土，可能由于砂土保水性能最差，易干旱，最不利于黃曲霉菌生長；黏土保水性能最好，最利于黃曲霉菌生長[12]。迄今我國主要針對花生收獲后貯藏期間黃曲霉毒素污染展開相關(guān)研究，同一氣候條件下，同一地區(qū)不同土壤類型對收獲后花生黃曲霉毒素污染的影響還鮮有報(bào)道。

襄陽地處漢江兩支流交匯處，具有砂壤土和黃黏土兩種典型的土壤類型。因此，本文擬以本地花生主產(chǎn)區(qū)主推品種為研究對象，通過對襄陽特有的兩種土壤類型的差異進(jìn)行研究，掌握襄陽花生遭受黃曲霉毒素污染的分布規(guī)律及特征，分析土壤類型與花生貯藏期黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn)的相互關(guān)系，為襄陽地區(qū)花生黃曲霉毒素污染預(yù)警和精準(zhǔn)防控提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，保障本地花生消費(fèi)安全，促進(jìn)花生產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘油(Aladdin)；甲醇(美國Fisher)；DG-18瓊脂培養(yǎng)基(海博生物)；次氯酸鈉(山東瑞泰奇洗滌消毒有限公司)；曲霉素瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(AFPA)(海博生物)；蒸餾水(UPH-Ⅲ-10型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)制備)；黃曲霉毒素總量免疫親和柱(江蘇省蘇薇薇生物研究有限公司)；乙腈中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2混標(biāo)(北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R型高速低溫離心機(jī)(Eppendorf)；JYL-G12E型高速破壁機(jī)(九陽股份有限公司)；CP4102型電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；MJ-250-1型霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；YXQ-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；HX-G型光化學(xué)柱后衍生儀(武漢恒信試劑科技有限公司)；島津LC-20A液相色譜儀；DQ-101型臺(tái)式方形中藥切片機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；KB5010型試管振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；BSC-1600132型生物安全柜(萊特(南通)科學(xué)儀器有限公司)；THZ-C-L型臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器(太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

根據(jù)花生主產(chǎn)區(qū)土壤類型分布情況分別從湖北省襄陽市的棗陽市、宜城市、谷城縣、襄州區(qū)等4個(gè)花生主產(chǎn)區(qū)共12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)選擇取樣地，其中包括以黃黏土類型為代表的鄉(xiāng)鎮(zhèn)7個(gè)，以砂壤土類型為代表的鄉(xiāng)鎮(zhèn)5個(gè)。每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)挑選3個(gè)取樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)覆蓋主產(chǎn)區(qū)中典型的河岸帶砂壤土和崗地黃黏土兩種最典型的土壤類型。在花生收獲期取樣，每個(gè)采樣點(diǎn)取5 kg當(dāng)?shù)鼗ㄉ魍破贩N小白沙莢果樣品，取后及時(shí)晾曬，樣品曬干后懸掛放置于干燥通風(fēng)的倉庫中[13]，分別貯藏15 d和365 d，用于花生不同貯藏期黃曲霉毒素含量測定試驗(yàn)。

1.3.2 花生貯藏期黃曲霉毒素含量測定

稱取1 kg花生籽粒切片粉碎，混合均勻后縮分至100 g，稱取5.00 g試樣于離心管中，加入20.0 mL的甲醇/水(70∶30)溶液，渦旋混勻，置于試管振蕩器中震蕩20 min，在6000 r/min下離心5 min，取5 mL上清液加入25 mL純水稀釋。使用黃曲霉毒素總量免疫親和柱對樣品進(jìn)行濃縮和純化，最后用甲醇洗脫并定容至1 mL。洗脫液用0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，用于HPLC分析。HPLC檢測條件：反向C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)、柱溫 40 ℃；流動(dòng)相為甲醇/水(45∶55)，流速為1.0 mL/min；激發(fā)波長 360 nm、發(fā)射波長 440 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.3 花生黃曲霉污染率的檢測

挑選完整沒有裂縫的花生，用次氯酸鈉溶液浸泡消毒2 min，接著用無菌蒸餾水清洗3遍[14]，在滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中放置滅菌后的濾紙，再在濾紙表面加入無菌水以濕潤整張濾紙，將花生籽粒平鋪在培養(yǎng)皿中，于溫度28 ℃、濕度70%～80%的霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步觀察，挑取能夠產(chǎn)生外觀可見長有黃色孢子的菌落在DG18培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至得到單個(gè)菌落。挑取單個(gè)菌落的菌株于AFPA培養(yǎng)基上進(jìn)行顯色培養(yǎng)，陽性菌株送北京擎科測序公司武漢測序部進(jìn)行ITS序列測序，用于菌株鑒定，并計(jì)算黃曲霉污染率。

1.3.4 花生殼內(nèi)壁和籽粒上黃曲霉菌侵染率的測定

從每份花生樣品中隨機(jī)取100顆沒有裂縫的花生，次氯酸鈉消毒后用無菌蒸餾水沖洗，接著在超凈工作臺(tái)里剝殼、剪碎，每顆花生隨機(jī)取四分之一的花生殼和二分之一的花生仁分別放在裝有無菌蒸餾水的三角瓶中，放入恒溫?fù)u床中28 ℃震蕩提取1 h。分別取100 μL提取液在DG18固體培養(yǎng)基上均勻涂布[15]，28 ℃培養(yǎng)6～7 d后觀察長菌情況。將形態(tài)疑似黃曲霉的菌株再用AFPA培養(yǎng)基顯色篩選培養(yǎng)，陽性菌株送測序，根據(jù)ITS序列信息鑒定黃曲霉菌株。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 WPS Office統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行花生收獲后不同貯藏期黃曲霉菌污染和黃曲霉毒素含量的統(tǒng)計(jì)及處理繪制，并對花生黃曲霉菌污染與土壤類型的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 良好條件下不同貯藏時(shí)間對不同土壤類型所產(chǎn)花生中黃曲霉毒素含量變化的影響

據(jù)調(diào)查，襄陽產(chǎn)區(qū)花生從收獲到抵達(dá)消費(fèi)者手中平均需要15 d左右，若作為自留種或其他用途則可能貯藏1年左右，因此分別測定了收獲后貯藏15 d和貯藏365 d后花生中黃曲霉毒素含量，觀察貯藏時(shí)間對不同土壤類型所產(chǎn)花生中黃曲霉毒素含量的影響見表1，花生貯藏15 d后所有樣品中均未檢測出4種黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)。在儲(chǔ)存1年后的樣品中，所有砂壤土所產(chǎn)花生中4種黃曲霉毒素也均未檢出，黃黏土所產(chǎn)花生中所有樣品均未檢出AFB2、AFG1、AFG2，但閆營和楊檔樣品中檢出AFB1，含量分別為1.56±0.29 μg·kg-1和1.70±0.41 μg·kg-1，其中，檢出樣品黃曲霉毒素含量也是在限量范圍內(nèi)，說明襄陽不同土壤類型所產(chǎn)花生的品質(zhì)安全水平都比較高，其黃曲霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)相對存在于黃黏土所產(chǎn)花生的產(chǎn)后貯藏期。

表1 不同貯藏期花生中黃曲霉毒素含量 /(μg·kg-1) Table 1 Aflatoxins content in peanut after different storage periods

2.2 花生殼內(nèi)壁和籽粒上黃曲霉菌侵染率實(shí)驗(yàn)

為了分析花生貯藏過程中黃曲霉菌侵染程度與土壤類型之間的關(guān)系，我們進(jìn)一步測定了花生不同部位上的黃曲霉菌侵染率，并與土壤類型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：砂壤土中花生殼內(nèi)表面黃曲霉污染發(fā)生率為6.67%，花生籽粒上未檢出黃曲霉；黃黏土中花生殼內(nèi)表面黃曲霉污染發(fā)生率為38.10%，是砂壤土中的5.71倍，差異顯著；花生籽粒上黃曲霉污染發(fā)生率為4.76%，高于砂壤土，差異不顯著 (圖1)。

2.3 人工模擬惡劣條件下花生的黃曲霉菌污染率情況實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步評判不同土壤類型所產(chǎn)花生遭受黃曲霉污染的風(fēng)險(xiǎn)情況，根據(jù)襄陽產(chǎn)區(qū)花生收獲后較易出現(xiàn)的夏末秋初的高溫髙濕氣候，將花生籽粒置于溫度28 ℃、相對濕度70%～80%的條件下貯藏7 d進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：砂壤土所產(chǎn)花生中的黃曲霉污染發(fā)生率在1.25%～9.78%之間，平均值為4.11%，且全部在10%以下；黃黏土所產(chǎn)花生中的黃曲霉污染率在3.47%～20.57%之間，平均值為13.61%，且絕大部分都在10%以上。由此可見，在高溫高濕條件下，黃黏土所產(chǎn)花生中的黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn)顯著高于砂壤土中所產(chǎn)花生中的黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn) (圖2)。

3 討論與結(jié)論

氣候條件和干旱脅迫是影響花生生長過程中莢果防御黃曲霉菌和抑制產(chǎn)毒的重要因素[16-18]。本研究表明，襄陽地區(qū)所產(chǎn)花生在收獲期均未檢出黃曲霉毒素，主要因?yàn)樵诨ㄉL當(dāng)年，襄陽產(chǎn)區(qū)降水量適中，既沒遇到明顯的高溫干旱脅迫，也沒有遭遇收獲期連陰雨的氣候?yàn)?zāi)害，花生莢果發(fā)育良好，且成熟后的花生具備充分晾曬干燥的天氣條件；在相對良好的條件下儲(chǔ)存1年后，不同土壤類型產(chǎn)出的花生污染風(fēng)險(xiǎn)就表現(xiàn)出明顯差異：黃黏土所產(chǎn)花生黃曲霉毒素檢出率顯著高于砂壤土中所產(chǎn)花生(表1)。該結(jié)果表明，在氣候條件良好或灌溉條件良好的情況下，襄陽產(chǎn)區(qū)花生中的黃曲霉毒素風(fēng)險(xiǎn)主要存在于貯藏期，且黃黏土產(chǎn)區(qū)風(fēng)險(xiǎn)高于砂壤土產(chǎn)區(qū)，這可能是因?yàn)橄噍^于砂壤土，黃黏土更易吸附黃曲霉毒素且毒素分解速度更慢[19-20]。

花生收獲前所感染的黃曲霉菌主要來自于土壤，莢果在發(fā)育過程中可能發(fā)生不同程度的黃曲霉菌侵染[21]，土壤類型能夠影響花生收獲后貯藏和加工過程中的毒素污染水平。本研究從不同角度設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分析比較了兩種不同典型土壤類型與花生的黃曲霉菌侵染率之間的關(guān)系。果殼是花生防御土壤中有害真菌侵染的第一道防線。從花生殼內(nèi)表面和籽粒上黃曲霉菌侵染率實(shí)驗(yàn)可看出，無論在花生殼還是花生仁中，黃黏土中產(chǎn)出的花生黃曲霉菌侵染率都顯著高于砂壤土中產(chǎn)出的花生黃曲霉菌侵染率(圖1)，表明黃曲霉菌對花生莢果的侵染程度在黃黏土的土壤環(huán)境下比砂壤土環(huán)境下更高。李新國、熊路等研究認(rèn)為，砂壤土保水性差，易受高溫干旱脅迫，黃曲霉侵染率較高[22-23]。而我們的試驗(yàn)中由于降水或灌溉條件較好(砂壤土為典型的漢江沿岸或夾河套地形)，砂壤土產(chǎn)區(qū)中很少存在干旱脅迫，反而砂壤土中所產(chǎn)花生的黃曲霉菌侵染率低于黏土中所產(chǎn)花生的黃曲霉菌侵染率。一般認(rèn)為，當(dāng)土壤中水分條件良好時(shí)，土壤中黃曲霉菌的種群密度越高，花生受黃曲霉侵染的風(fēng)險(xiǎn)也越高[24]。國內(nèi)張杏等調(diào)查的結(jié)果中顯示，黏土中黃曲霉菌的種群數(shù)量普遍高于砂壤土[12]，本研究組張姝娟等前期對襄陽不同花生產(chǎn)區(qū)土壤中黃曲霉菌的污染分布和產(chǎn)毒力研究結(jié)果也顯示，黃黏土中的黃曲霉菌分布密度明顯高于砂壤土(待刊)，可較好地解釋襄陽黃黏土產(chǎn)區(qū)花生中黃曲霉菌侵染率高的原因，從而增加了該產(chǎn)區(qū)花生莢果在貯藏期遇到高溫髙濕環(huán)境后產(chǎn)毒的風(fēng)險(xiǎn)。

收獲前發(fā)生黃曲霉菌侵染的少數(shù)花生種子在濕熱條件下，其攜帶的黃曲霉菌能夠快速增殖從而造成花生大范圍的感染[25]。丁寧等[26]分析了中國四大花生主產(chǎn)區(qū)不同貯藏條件下花生受黃曲霉侵染及黃曲霉毒素污染程度及其在貯藏過程中的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)貯藏環(huán)境溫度越高、濕度越大，花生越易被黃曲霉侵染，且花生 AFB1污染水平越高。襄陽產(chǎn)區(qū)花生收獲后，正值夏末高溫多雨季節(jié)，產(chǎn)后花生貯藏過程中經(jīng)常暴露于高溫高濕環(huán)境，易造成產(chǎn)后黃曲霉毒素污染。本研究模擬了襄陽產(chǎn)區(qū)花生籽粒貯藏期遭遇高溫髙濕等惡劣條件下的黃曲霉菌污染率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在高溫髙濕條件下貯藏7 d后，襄陽產(chǎn)區(qū)花生整體上均具有較大的黃曲霉菌污染風(fēng)險(xiǎn)，其中黃黏土產(chǎn)區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)比砂壤土產(chǎn)區(qū)更高。高溫(28 ℃或以上)、高濕(相對濕度70%～80%)的條件非常適合花生莢果上黃曲霉菌的繁殖和生長，同時(shí)也是襄陽地區(qū)夏末秋初花生貯藏期間經(jīng)常出現(xiàn)的氣候條件，襄陽花生收獲后如遇到此類溫室天氣，將面臨極大的貯藏期霉菌污染風(fēng)險(xiǎn)，影響花生消費(fèi)安全，不利于花生產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

本研究首次對襄陽產(chǎn)區(qū)兩種典型土壤類型生產(chǎn)的花生進(jìn)行黃曲霉毒素含量、黃曲霉菌侵染率測定分析，并探討了黃曲霉菌及其毒素污染與土壤類型之間的關(guān)系。通過研究可得出以下結(jié)論：第一，在襄陽特有的氣候條件和土壤條件下，襄陽產(chǎn)區(qū)花生中的黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn)主要存在于貯藏期，如遇收獲期連續(xù)陰雨或貯藏期高溫髙濕氣候條件，黃曲霉菌的污染率則有所提高，容易造成潛在的黃曲霉毒素污染；第二，從襄陽兩種典型的土壤類型來看，黃黏土產(chǎn)區(qū)比砂壤土產(chǎn)區(qū)的花生具有更高的污染風(fēng)險(xiǎn)，表明在襄陽獨(dú)特的氣候條件下，兩河沿岸的砂質(zhì)壤土是非常理想的花生高品質(zhì)產(chǎn)區(qū)。因此建議襄陽產(chǎn)區(qū)在花生黃曲霉污染防控策略上可結(jié)合當(dāng)?shù)鼗ㄉ魍破贩N，應(yīng)盡可能采取砂壤土種植，或在黃黏土產(chǎn)區(qū)加強(qiáng)土壤中黃曲霉的防治措施，從而經(jīng)濟(jì)有效地控制花生貯藏期黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn)。