響應(yīng)面法優(yōu)化花生紅衣綠原酸微波超聲提取工藝

王 娜，李小云，余秋穎，寧燦燦，李正邦，李軍偉，任紅濤*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州市營養(yǎng)與健康食品重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.正陽新地花生集團(tuán)有限公司，河南 駐馬店 463600)

花生紅衣為豆科植物花生的種皮，又名花生種衣、花生皮等，為花生加工副產(chǎn)物，占花生果質(zhì)量的3%。截止2018年我國花生年產(chǎn)量約1733萬t，每年產(chǎn)生的花生紅衣除少量用于制藥外，其余隨花生粕用作飼料或丟棄，經(jīng)濟(jì)利用價值低，并造成資源浪費?；ㄉt衣是一味傳統(tǒng)中藥，被記錄在《全國中草藥匯編》，研究表明花生紅衣富含原花青素、維生素K、花生紅衣色素等活性成分，具有良好的抗氧化、抑菌等功能[1-5]。目前花生紅衣不但已被用于中藥制劑治療慢性出血和支氣管炎等疾病，且還可用于食品、膳食補充劑、保健品、化妝品等[6-9]。

綠原酸是植物在有氧呼吸過程中形成的一種苯丙素類物質(zhì)，由咖啡酸與奎尼酸形成的縮酚酸。綠原酸類物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降血脂等多種生物活性[10-16]。目前關(guān)于花生紅衣中綠原酸組分在國外有研究報道[3]，但國內(nèi)鮮有報道。綠原酸提取方法主要有水提法[17]、醇提法[18-20]、微波提取法[21-22]、超聲提取法[18-20]，前兩種提取工藝操作簡單，但提取率較低。近年來，超聲波和微波技術(shù)在植物有效成分提取方面得到了廣泛應(yīng)用，但提取過程中將超聲—微波聯(lián)合應(yīng)用研究，并將提取率和抗氧化活性作為綜合指標(biāo)鮮有報道。

本試驗利用微波光波超聲波萃取一體儀提取花生紅衣綠原酸，以提取率和DPPH自由基清除率作為綜合考察指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期為花生紅衣中綠原酸提取與應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣：供試品種正陽小白沙，由正陽新地食品工業(yè)有限公司提供；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 DPPH：福州飛揚生物科技有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸(分析純)：煙臺市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-200T高速多功能粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司；FA1204電子分析天平：力辰科技(寧波市鄞州華豐電子儀器廠)；FX101-3型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；pHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SCIENTZ-IIDM 微波光波超聲波萃取一體儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 花生紅衣綠原酸提取工藝流程

花生紅衣→烘干(45 ℃，24 h)→粉碎→過篩(40目)→花生紅衣粉末→加入乙醇溶液→微波超聲提取→離心(5000 r/min，10 min)→上清液→稀釋適宜倍數(shù)，測定綠原酸含量→計算綠原酸提取率。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照李次力等[23]的方法進(jìn)行，用60%的乙醇溶液溶解綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.0505X+0.0038，R2=0.9997。

1.3.3 綠原酸提取率計算

式中：c為提取液綠原酸質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)；V為提取液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為花生紅衣粉末的質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)試驗，花生紅衣綠原酸提取影響因素有液料比、乙醇濃度、pH、超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間等[18-22, 24-26]。稱取花生紅衣粉末1.600 g，按照液料比(V/m)60∶1(mL/g)加入60%乙醇溶液，在超聲功率350 W，超聲10 min，微波功率500 W，微波40 s條件下，測定綠原酸提取率和花生紅衣綠原酸粗提液DPPH自由基清除率。固定其他條件，分別考察液料比(3∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1 mL/g)、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、pH(4、5、6、7、8)、超聲功率(200、250、300、350、400 W)、超聲時間(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 min)、微波功率(200、300、400、500、600 W)、微波時間(10、20、30、40、50 s)對綠原酸提取率和DPPH自由基清除率的影響。

1.3.5 Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計

根據(jù)PB試驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，采用Minitab 17.0進(jìn)行試驗設(shè)計，因素與水平編碼見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素與水平編碼Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平編碼Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在PB試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行設(shè)計中心組合(Box-Behnken)試驗設(shè)計，各因素水平見表2。

1.3.7 花生紅衣綠原酸粗提液抗氧化活性測定

采用DPPH自由基清除法測定綠原酸粗提液抗氧化活性，方法依據(jù)參考文獻(xiàn)[27]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 花生紅衣綠原酸提取單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對提取率和DPPH自由基清除率的影響

從圖1可見，隨著液料比的增大，花生紅衣綠原酸提取率不斷增大，粗提液的DPPH自由基清除率不斷減小，當(dāng)液料比大于60∶1(mL/g)后，綠原酸提取率上升趨勢平緩，粗提液DPPH自由基清除率下降趨勢平緩，再增大液料比提取率提高有限，且乙醇用量大，增加成本。以提取率和DPPH自由基清除率為主要參考指標(biāo)(下同)，故液料比以60∶1(mL/g)為宜。

2.1.2 乙醇濃度對提取率和DPPH自由基清除率的影響

由圖2可見，隨著乙醇濃度的增大，綠原酸提取率和綠原酸粗提液的DPPH自由基清除率均先增加后降低。當(dāng)乙醇濃度60%時綠原酸提取率和DPPH自由基清除率最高，故乙醇濃度選取60%為宜。

2.1.3 pH對提取率和DPPH自由基清除率的影響

由圖3可見，在pH 3.0～8.0范圍內(nèi)，綠原酸提取率和綠原酸粗提液的DPPH自由基清除率呈先增大后降低的趨勢。pH為7時綠原酸提取率和DPPH自由基清除率綜合效果最佳，故選擇pH值為7。

2.1.4 微波功率對提取率和DPPH自由基清除率的影響

由圖4可見，綠原酸提取率隨著微波功率增加呈先增大后降低的趨勢；綠原酸粗提液的DPPH自由基清除率呈降低趨勢。在微波500 W時綠原酸提取率最高，粗提液DPPH自由基清除率此時處于降低的拐點，綜合考慮，最佳微波功率選取500 W。

2.1.5 微波時間對提取率和DPPH自由基清除率的影響

圖5可見，當(dāng)微波時間在10～50 s時，綠原酸提取率和綠原酸粗提液的DPPH自由基清除率先上升后下降，微波40 s時綠原酸提取率和DPPH自由基清除率最高，因此最佳微波時間為40 s。

2.1.6 超聲功率對提取率和DPPH自由基清除率的影響

圖6可見，當(dāng)綠原酸提取率和綠原酸粗提液的DPPH自由基清除率隨著微波功率增加先上升后下降，超聲波功率為350 W時綠原酸提取率和DPPH自由基清除率最高，故350 W為最佳超聲功率。

2.1.7 超聲時間對提取率的影響

由圖7可見，綠原酸提取率和綠原酸粗提液的DPPH自由基清除率隨著超聲時間增加呈先上升后下降的趨勢，超聲時間10 min綠原酸提取率最高，超聲時間5 min時粗提液DPPH自由基清除率最高，因超聲時間2.5～12.5 min粗提液DPPH自由基清除率變化趨勢平緩，故最佳超聲時間為10 min。

2.2 PB試驗結(jié)果與分析

PB試驗設(shè)計及響應(yīng)值見表3，經(jīng)逐步回歸分析，各因素效應(yīng)評價見表4。

以綠原酸提取率Y為響應(yīng)值的最優(yōu)方程為Y=5.2983-0.2150A+0.0950B+0.0250C-0.0250D-0.0067E-0.0117F+0.0467G，由表4可知，A、B、G對提取率影響顯著，故選取A、B、G進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。結(jié)合單因素試驗結(jié)果，并考慮提高效率及節(jié)約成本，C、D、E和F四個因素分別固定為7、500 W、40 s、350 W。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值 Table 3 Experimental design and response values of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計各因素效應(yīng)評價 Table 4 Effect evaluation on each factor under Plackett-Burman test design

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

2.3.2 模型的建立與顯著性分析

表6可知，分析模型P<0.0001，失擬項P=0.1496>0.05，說明模型擬合度較高。R2=0.98，經(jīng)分析得最佳二次多項回歸方程(P<0.05)Y= -2.58075+0.054025A+0.041112B+0.06435G-1.2×10-6AB+7.0×10-5AG+ 9.74216×10-19BG-4.55×10-4A2-3.3700×10-4B2-0.0034G2。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果 Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

表6 二次響應(yīng)模型方差分析Table 6 ANOVA results of the fitted quadratic regression model

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

圖8可知，響應(yīng)面為平滑的曲面，且開口向下，說明存在最大響應(yīng)值，AB、AG、BG交互項影響不顯著，根據(jù)響應(yīng)面試驗回歸方程和結(jié)果，得到最佳綠原酸提取條件為：乙醇濃度59.33%、液料比59.81∶1(mL/g)、超聲時間10.07 min?？紤]操作的可行性，最優(yōu)條件調(diào)整為乙醇濃度59%、液料比60∶1(mL/g)、超聲時間10 min。進(jìn)行驗證試驗(n=6)，得綠原酸提取率0.573±0.002%，與理論預(yù)測值0.575%接近。

2.4 花生紅衣綠原酸粗提液抗氧化活性分析

最佳工藝條件得到花生紅衣綠原酸粗提液，測定紅衣綠原酸粗提液和抗壞血酸對DPPH自由基的清除率，試驗結(jié)果見圖9。

由圖9可知，花生紅衣綠原酸粗提液和抗壞血酸都有良好的DPPH自由基清除效果，隨著濃度的增大，清除能力增強(qiáng)。當(dāng)紅衣綠原酸粗提液濃度小于0.02 mg/mL時，清除能力明顯優(yōu)于抗壞血酸，濃度在0.02 mg/mL時清除率達(dá)92%；濃度大于0.02 mg/mL時，清除能力增長平緩，與抗壞血酸清除能力逐漸接近。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面試驗確定花生紅衣綠原酸最佳提取工藝條件為：乙醇濃度59%、液料比60∶1(mL/g)、pH 7、微波功率500 W、微波40 s、超聲功率350 W、超聲時間10 min，此時綠原酸提取率0.573%。乙醇濃度對綠原酸提取率影響顯著。綠原酸粗提液具有較高的抗氧化活性，濃度小于0.02 mg/mL時，DPPH自由基清除率優(yōu)于抗壞血酸，當(dāng)粗提液為0.1 mg/mL時，其DPPH自由基清除率為94.9%。