NGS檢出腦脊液樣本中布尼亞病毒1例報道及文獻復(fù)習(xí)

石玉如， 馮 剛， 岳 莉， 谷 妍， 劉 楊， 戚應(yīng)杰

（1.安徽省立醫(yī)院感染病院，安徽 合肥 230022；2.安徽省金寨縣人民醫(yī)院，安徽 金寨 237300）

發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是由布尼亞病毒[又稱發(fā)熱伴血小板減少綜合癥病毒（Severe fever with thrombocytopenia virus，SFTSV）]導(dǎo)致的以發(fā)熱伴血小板減少為主要臨床特征的感染性疾病。在流行區(qū)域該病毒感染率為1%～3%，病死率為6%～30%，平均病死率約為10%[1]。該病毒可通過蜱蟲、飼養(yǎng)或野生動物、人與人血液或分泌物傳播[2]，好發(fā)于疫區(qū)農(nóng)民，患者大多住在丘陵或森林地帶。該病主要流行于5～7月，5月為發(fā)病高峰期。繼中國后，韓國、日本、美國等國也有相關(guān)報道，SFTSV感染的防治已成為全球性公共衛(wèi)生問題，不可忽視[3]。本研究采用高通量下一代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)對1例疑似SFTSV感染重癥患者的腦脊液樣本進行測序，明確病毒病原體，并結(jié)合臨床特征及相關(guān)實驗室檢查結(jié)果，提高對SFTSV感染重癥的認識，同時探討NGS在腦脊液病原體感染診斷中的價值。

1 病例資料

患者，女，50歲，漢族，安徽安慶地區(qū)居民。2018年4月4日采茶時被蟲咬傷左髖部，未經(jīng)特殊處理，隨后出現(xiàn)腹瀉、頭昏、乏力、高熱和畏寒癥狀，最高體溫39 ℃。4月6日至當(dāng)?shù)劓?zhèn)醫(yī)院檢查發(fā)現(xiàn)血小板偏低，轉(zhuǎn)至縣醫(yī)院消化科住院，檢查發(fā)現(xiàn)白細胞和血小板進一步降低，血壓降低，4月7日轉(zhuǎn)至市級醫(yī)院檢查發(fā)現(xiàn)血小板36×109/L，白細胞2.02×109/L，D-二聚體＞20 μg/mL，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1 034 IU/L，肌鈣蛋白24 pg/mL，予以抗感染、保肝、補液擴容等對癥處理后，仍有胸悶、氣促等癥狀，4月10日以“發(fā)熱伴血小板減少”收入安徽省立醫(yī)院。入院時昏迷狀態(tài)，體溫36.8 ℃，全身多處皮下瘀斑，呼吸急促，雙肺少量濕啰音；腹平軟，腸鳴音存在。4月11日予以腰椎穿刺進行腦脊液NGS、細菌培養(yǎng)及常規(guī)檢查，并立即行升壓、保護臟器及抗感染等對癥治療，嚴密監(jiān)測生命體征，患者仍出現(xiàn)抽搐、意識障礙現(xiàn)象；4月12日上午患者再次出現(xiàn)抽搐，伴有血氧飽和度下降，對癥治療后，抽搐好轉(zhuǎn)；4月13日心電監(jiān)護提示血壓低，心率約110次/min，行氣管內(nèi)插管呼吸機輔助通氣過程中，血乳酸明顯升高，氧分壓低，腦脊液壓力極低，積極予以維持血壓、抗休克、氣管插管呼吸機輔助通氣、深靜脈置管、擴容、補液等對癥支持治療，白細胞和血小板上升，但仍需大劑量升壓藥物維持，仍存在意識障礙，偶見自主睜眼。不同時間點的實驗室檢查結(jié)果見表1。

表1 患者不同時間相關(guān)實驗室檢查結(jié)果

2 實驗室檢查

2.1 腦脊液NGS結(jié)果

檢出SFTSV HB29，檢出序列數(shù)最多為1 321。檢測到SFTSV HB29唯一比對序列數(shù)為112條，覆蓋度達97.82%，見圖1。

圖1 SFTSV HB29覆蓋度（97.82%）

2.2 SFTSV核酸檢測結(jié)果

SFTSV核酸檢測試劑盒購自上海之江生物公司，以自帶標(biāo)準品（S0=0拷貝/mL、S1=1.0×104拷貝/mL、S2=1.0×105拷貝/mL、S3=1.0×106拷貝/mL、S4=1.0×107拷貝/mL）繪制標(biāo)準曲線，患者樣本檢測結(jié)果為5.2×108拷貝/mL。見圖2。

圖2 SFTSV核酸擴增曲線

3 討論

本病例采用NGS在腦脊液中檢出SFTSV，提示此病毒感染可以致腦炎，并成為發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病因。本病例臨床特點包括：（1）在山林地區(qū)采茶被蟲叮咬后起?。唬?）除了在感染初期出現(xiàn)發(fā)熱伴血小板減少、消化系統(tǒng)反應(yīng)等癥狀外，隨病情發(fā)展，患者陸續(xù)出現(xiàn)全身臟器衰竭、意識障礙和抽搐等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀；（3）凝血功能、肝功能和心肌酶等指標(biāo)異常增高；腦脊液送檢結(jié)果符合無菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎的特點，血壓升高，白細胞輕、中度升高，以淋巴細胞為主，腦脊液蛋白升高，糖正常；腦脊液培養(yǎng)陰性；NGS明確SFTSV HB29感染，SFTSV核酸檢測結(jié)果為5.2×108拷貝/mL；血培養(yǎng)陰性，多項病毒抗體檢測陰性；（4）無特效藥，一般采取對癥治療；有文獻報道體外利巴韋林有抑制病毒的作用[4]，但無體內(nèi)研究數(shù)據(jù)證實；（5）重癥患者的預(yù)后極差。本病例是通過NGS鑒定出SFTSV，同時通過SFTSV核酸檢測驗證了NGS結(jié)果，提示SFTSV感染可以侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其感染具有較高的致殘、致死率[5-6]，應(yīng)引起臨床重視。

SFTSV為一類有包膜的負鏈RNA病毒[7]，電鏡下病毒顆粒呈球形或橢圓形，直徑為80～100 nm，其基因組由大、中、小3個單股RNA片段組成[8]。劉秀蘭等[9]報道2010—2016年我國基因型的分離株主要為C基因型，C2基因亞型為流行優(yōu)勢株，占分離株的50%以上，該基因型與C3、C4基因亞型和J基因型在我國多個地區(qū)交替流行。SFTSV易感性高、起病急，患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、白細胞下降、血小板減少和消化道癥狀，重癥患者可出現(xiàn)多器官功能衰竭等[10]。

自2009年我國首次發(fā)現(xiàn)SFTSV以來，韓國、美國、日本等國也陸續(xù)有文獻報道。KANEKO等[11]報道1名53歲的日本男子由于高熱、腹瀉8 d被送入醫(yī)院，實驗室檢查結(jié)果顯示白細胞和血小板減少、肝功能和心肌酶譜持續(xù)性上升，被診斷為嚴重發(fā)熱伴血小板減少，隨后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)在血液中檢測到SFTSV拷貝數(shù)為1.46×106拷貝/mL，并且隨病情的發(fā)展不斷上升至1.41×109拷貝/mL，骨髓檢查發(fā)現(xiàn)吞噬性淋巴細胞增多，同時患者出現(xiàn)意識障礙及類似腦炎癥狀，患病第13天死亡，尸檢結(jié)果顯示全身（包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)）吞噬性淋巴細胞增多。韓國2013年的全國發(fā)熱伴血小板減少監(jiān)測結(jié)果顯示，有25個地區(qū)的35例住院病例為SFTSV感染，其中16例（46%）患者隨后死亡，年齡和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（包括意識水平下降和言語不清）與患者死亡有關(guān)[12]。宋世會等[13]對20例重癥SFTSV感染患者進行研究發(fā)現(xiàn)，重癥患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征、血小板及白細胞進行性下降、心肌酶譜及血淀粉酶和脂肪酶明顯升高、電解質(zhì)顯著異常、白蛋白低下，預(yù)后差。因此對SFTSV感染的患者應(yīng)早發(fā)現(xiàn)、早診斷，以及時采取綜合治療措施。

對于SFTSV感染，目前采用的實驗室診斷方法主要有病毒分離、病毒核酸檢測和血清抗體檢測等。病毒分離雖然是金標(biāo)準，但操作繁瑣、技術(shù)要求高、耗時長、病毒分離率低，不適用于臨床快速診斷；病毒核酸檢測主要是針對病毒S、M、L 基因片段的普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；血清學(xué)抗體檢測是應(yīng)用免疫學(xué)原理檢測患者血清中相應(yīng)病毒的抗體，進行初步診斷，可直接觀察結(jié)果，但特異性不強[15]。

NGS用于中樞系統(tǒng)的SFTSV檢測具有優(yōu)越性。（1）快速檢測。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測依賴于培養(yǎng)法，但病原體培養(yǎng)時間普遍較長，且許多病原體不易培養(yǎng)。SFTSV的培養(yǎng)耗時、耗成本，技術(shù)含量高，而早診斷、早治療是提高患者存活率的關(guān)鍵，采用病毒培養(yǎng)的方法無法滿足臨床需要，快速檢測的方法是大勢所趨。（2）高通量檢測。目前臨床病原體檢測的常用方法主要為聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗，僅可針對某種特定病原體進行檢測。在臨床表現(xiàn)未能提示特定病原體的情況下，聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗均不適用，而NGS可廣泛篩查無靶向的病原體。本病例血、腦脊液培養(yǎng)以及各種抗體檢測均為陰性，查找不到病原體，采用NGS解決了確定病原體這一難題，使治療更有針對性。（3）獲得更多的病原信息。NGS可以同時獲得病原體的具體類型和生物學(xué)信息。本病例通過測序確定SFTSV為HB29型，可以了解到更多的病原信息，而這一點是其他方法無法實現(xiàn)的。

總之，對于SFTSV感染的治療，關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷，以及時確診并予以對癥治療。若診斷不及時，錯過了最佳治療期，患者極易發(fā)展為重癥，預(yù)后不佳，甚至死亡。因此，及時確定病原體對治愈疾病有著重要的意義。NGS作為新的檢測技術(shù)，取代常規(guī)的腦脊液檢測方法，在病原微生物感染的快速診斷中意義重大。