糖尿病性周?chē)窠?jīng)病理性疼痛中circ-SCN9A 的作用與臨床價(jià)值*

劉 磊 席 鵬 李文舉 雷舒煜 李亦梅

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，烏魯木齊 830011）

神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛，主要分為周?chē)窠?jīng)病理性疼痛和中樞神經(jīng)病理性疼痛[1]。糖尿病性周?chē)窠?jīng)病理性疼痛 (diabetic peripheral neuropathic pain, DPNP) 是指由糖尿病或糖尿病前期病變導(dǎo)致的周?chē)窠?jīng)病理性疼痛[2]。目前，DPNP 的發(fā)生率逐年升高，已成為亟待解決的醫(yī)學(xué)難題之一。本研究致力于進(jìn)一步明確DPNP 的發(fā)病機(jī)制并尋找其可靠的診斷標(biāo)記物。鈉電壓門(mén)控通道α亞單位9 (sodium voltage-gated channel alpha subunit 9, SCN9A) 基因編碼的蛋白 (Nav 1.7) 參與組成神經(jīng)細(xì)胞中的痛覺(jué)感受器[3,4]。該基因的突變可以導(dǎo)致多種以疼痛為主的疾病[5]。微小RNA (microRNA, miRNA)可通過(guò)降低編碼基因mRNA 的表達(dá)來(lái)抑制其蛋白質(zhì)的翻譯。例如，miR-30b 可通過(guò)降低SCN9A 基因mRNA 的表達(dá)來(lái)抑制Nav 1.7 蛋白翻譯，從而降低NP 實(shí)驗(yàn)大鼠疼痛的嚴(yán)重程度[4]。

在基因的轉(zhuǎn)錄成分中，環(huán)狀 RNA (circular RNA, circRNA)缺乏線性轉(zhuǎn)錄本的 “poly (A) 尾”，通過(guò)首尾末端的相接形成環(huán)化結(jié)構(gòu)[6,7]，可結(jié)合各種 miRNA，抑制其功能，發(fā)揮 miRNA“海綿”的作用[7]。人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)中高豐度的circRNA 可通過(guò)多種途徑游離于外周循環(huán)系統(tǒng)[8,9]。最新研究證實(shí)circRNA可通過(guò)內(nèi)源性miRNA“海綿”機(jī)制參與疼痛性疾病的發(fā)生[10,11]。例如，circRNA_9119 可以通過(guò)吸附miR-26a 減輕進(jìn)行性的熱痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏[12]。circAnks1a 對(duì)miR-324-3p 的吸附可提高背角神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)損傷引起的疼痛程度[13]。DPNP 病人血清circHIPK3 水平顯著高于健康人群，敲減circHIPK3 則可減輕糖尿病大鼠的NP 程度[14]。

由于circRNA 分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不容易受RNA 外切酶影響，在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)豐度高且具有一定的時(shí)序和疾病特異性，這使得circRNAs 有巨大潛力成為疼痛類(lèi)疾病的診斷標(biāo)志物。本研究在前期通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SCN9A 基因區(qū)域可以轉(zhuǎn)錄生成多個(gè)circRNA 分子，創(chuàng)新性地探討了它們?cè)贒PNP 中的作用和臨床價(jià)值。通過(guò)擬合臨床樣本、生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等多種技術(shù)手段對(duì)其在DPNP 發(fā)生中的潛在診斷價(jià)值和可能作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期推動(dòng)該病的臨床診斷治療。

方 法

1.樣本采集

收集2017 年1 月至2019 年12 月在我科收治的診斷為DPNP 的病人。

納入標(biāo)準(zhǔn)：自愿參加本研究并同意抽取其外周靜脈血樣；符合《糖尿病性周?chē)窠?jīng)病理性疼痛診療專(zhuān)家共識(shí)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；《ID Pain》評(píng)分> 2 分；年齡 ≥18 歲；疼痛數(shù)字評(píng)分法 (numerical rating scale, NRS)評(píng)分≥4 分，4～6 分為中度疼痛，7 分以上為重度疼痛；視覺(jué)模擬評(píng)分法(visual analogue scale, VAS)評(píng)分在6～10 分；意識(shí)清醒，可以進(jìn)行正確的溝通和言語(yǔ)表達(dá)；無(wú)腫瘤等其他嚴(yán)重軀體性疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡 < 18 歲；NRS < 4 分；急慢性胰腺炎；神經(jīng)系統(tǒng)損害性疾病；精神活性物質(zhì)濫用史；肝腎功能不全者。

共收集DPNP 病人60 例（男女各30 例），其中男性平均年齡為(70.8±5.3)歲，平均病程(6.1±0.6)年；女性平均年齡為(72.3±4.2)歲，平均病程(6.5±0.5)年。收集本院無(wú)NP 癥狀的2 型糖尿病病人60 例，男30 例，平均年齡(66.3±4.5)歲；女30 例，平均年齡(69.0±3.2)歲；收集的健康對(duì)照者為本院常規(guī)體檢確認(rèn)后的健康人群，男女各30 例，男性平均年齡(67.6±3.4)歲，女性平均年齡(70.0±4.5)歲。本研究所有內(nèi)容和實(shí)施過(guò)程均獲得了入組者的知情同意和本單位醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和監(jiān)督。

2.主要試劑與儀器

體液RNA 提取專(zhuān)用試劑TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)；EDTA 真空采血管及針頭（積水，日本）；circRNA 反向設(shè)計(jì)引物和線性內(nèi)參 (GAPDH) 引物（生工，上海）；構(gòu)建circRNA過(guò)表達(dá)專(zhuān)用試劑盒pHB-circBasic? circular RNA cloning kit （漢恒，上海）；特異性siRNA （銳博，廣州）；逆轉(zhuǎn)錄試劑ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO, Japan)；雙熒光素酶 (Luciferase, LUC)報(bào)告系統(tǒng)(Promega, USA)；Ribonuclease R (Epicentre, USA)；2×Power Taq PCR MasterMix（百泰克，北京）；胎牛血清 (Bovogen, Australian)；Anti-KCNJ6抗體（義翹神州，北京）、單克隆 Anti-GAPDH 抗體 (Sigma, USA)；適用于Real-time PCR 用的PowerUp?SYBR? Green Master Mix (Applied Biosystems, USA)；微量移液器 (Eppendorf, Germany)；細(xì)胞培養(yǎng)板 (Corning, USA)；Real-time PCR 自動(dòng)化分析儀 (Bio-RAD, USA)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo Scientific, USA)；超凈工作臺(tái)（智城，上海）；數(shù)顯電熱恒溫水槽、生化培養(yǎng)箱 （精宏，上海）；水平搖床（其林貝爾，江蘇）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) （新芝，浙江）。

3. 血清總RNA 提取與Real-time qPCR 分析

在上午空腹?fàn)顟B(tài)下，收集入組者外周血3 ml，然后置于冷凍離心機(jī)內(nèi)以3000 g 的速度離心10 min，收集上清，置于-80℃冰箱保存。按照TRIzol LS Reagent 的說(shuō)明書(shū)對(duì)血清內(nèi)的RNA 進(jìn)行提取，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀對(duì)所提RNA 進(jìn)行濃度和純度測(cè)定。取1 μg RNA 進(jìn)行cDNA 合成。利用circRNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.circbase.org/) 獲取所有來(lái)自SCN9A基因的已知circRNA 分子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和序列信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的反向引物。使用Real-time PCR 自動(dòng)化分析儀對(duì)血清樣本中的circRNA 進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析。使用△Ct 方法計(jì)算circRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

4. 環(huán)狀RNA 鑒定與細(xì)胞亞定位分析

用含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y，細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)為5% CO2、37℃。Ribonuclease R (RNase R) 是一種核糖核酸外切酶，可以從3'-5'方向切割降解RNA，能夠消化幾乎所有的線性RNA 分子，但不易消化呈環(huán)形的RNA。本研究以3 U RNase R/μg RNA 的比例對(duì)細(xì)胞總RNA 進(jìn)行Rnase R 消化處理(37℃，10 min)，然后以處理過(guò)的RNA 作為模板合成cDNA，與常規(guī)的cDNA 分別進(jìn)行線性SCN9A 基因和SCN9A 來(lái)源的circRNA 進(jìn)行表達(dá)測(cè)定比較。細(xì)胞的亞定位往往決定circRNA行使生物學(xué)功能的類(lèi)型，按照核質(zhì)分離試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程對(duì)篩選出的circRNA 進(jìn)行了細(xì)胞亞定位分析。

5.篩選SCN9A 來(lái)源circRNA 的互作miRNA

在轉(zhuǎn)染前24 h，以5×103/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板中。利用circRNA 生物信息學(xué)分析工具(http://www.circbase.org/和https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)預(yù)測(cè)可能與上述篩選出的circRNA 結(jié)合的miRNA，合成它們的類(lèi)似物。將含有備選circRNA 結(jié)合位點(diǎn)片段的報(bào)告質(zhì)粒和這些miRNA 類(lèi)似物共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。在48 h 后按照說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定LUC 活性。最后，與陰性對(duì)照進(jìn)行比較，計(jì)算每個(gè)miRNA 類(lèi)似物所致LUC 活性的改變倍數(shù)。針對(duì)上述LUC 實(shí)驗(yàn)篩選出的miRNA分子，在細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染上述circRNA 的過(guò)表達(dá)載體和siRNA 化合物，繼而檢測(cè)這些miRNA 表達(dá)水平受到circRNA 調(diào)控的影響程度。

6. SCN9A 來(lái)源circRNA 在DPNP 中的潛在診斷價(jià)值和分子作用機(jī)制分析

接受者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）是評(píng)估臨床指標(biāo)敏感性和特異性的常用邏輯回歸模型。在本研究中SCN9A來(lái)源circRNA 的表達(dá)分為健康對(duì)照組、無(wú)NP 癥狀的2 型糖尿病病人組和DPNP 病人組，其中DPNP病人組又分為中度疼痛病人亞組與重度疼痛病人亞組。整合KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、DIANA-mirPath 和TargetScan 等多個(gè)數(shù)據(jù)分析工具對(duì)SCN9A 來(lái)源circRNA 結(jié)合的miRNA生物學(xué)作用通路進(jìn)行挖掘和分析，揭示從circRNA表達(dá)到靶向功能基因改變等復(fù)雜調(diào)控的分子機(jī)制。采用分子互作圖形化展示工具Cytoscape 3.4.0 構(gòu)建 DPNP 相關(guān)SCN9A 來(lái)源circRNA 的最相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；谏鲜龌A(chǔ)，利用免疫印跡技術(shù) (Western blotting, WB) 檢測(cè)SCN9A 來(lái)源circRNA 分子對(duì)靶向蛋白的調(diào)控作用，驗(yàn)證circRNA 影響DPNP 發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。

7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)使用Excel 進(jìn)行錄入和整理，采用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件 (Statistical Product and Service Solutions, SPSS) 17.0 版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < 0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. SCN9A 來(lái)源的circRNA 在DPNP 病人血清中存在顯著的差異表達(dá)

通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)檢索，在人體內(nèi)SCN9A基因共發(fā)現(xiàn)14 條circRNA 分子，本研究發(fā)現(xiàn)其中hsa_circ_0117953 (circ-SCN9A) 在DPNP 病 人 血 清中的水平顯著高于健康對(duì)照組（P < 0.001，見(jiàn)圖1A），hsa_circ_0117948 則在病人血清中較健康對(duì)照組降低（P < 0.05，見(jiàn)圖1A）。示意圖顯示了circ-SCN9A的生物信息學(xué)序列分析結(jié)果，其是由母基因線性轉(zhuǎn)錄本的第二至第七外顯子剪切后首尾相接形成。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示了circ-SCN9A 具有抵抗RNase R 切割的circRNA 生物學(xué)特性，主要分布于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞質(zhì)中（見(jiàn)圖1C, D）。

2.多個(gè)miRNA 受到circ-SCN9A 的吸附

針對(duì)circ-SCN9A 的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行miRNA 結(jié)合能力預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了37 個(gè)可能結(jié)合circ-SCN9A的miRNA 分子。本研究采用LUC 報(bào)告分析系統(tǒng)與37 個(gè)miRNA 類(lèi)似物的文庫(kù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)其中6 個(gè)miRNA (miR-661、miR-1324、miR-877-3p、miR-1256、miR-153-3p、miR-1264)對(duì)LUC 的活性抑制率超過(guò)了30%（見(jiàn)圖2A）。將circ-SCN9A 過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)這6 個(gè)miRNA 的表達(dá)均不同程度地受到抑制（見(jiàn)圖2B）。敲減circ-SCN9A 后，這6 個(gè)miRNA 的表達(dá)均明顯上調(diào) （見(jiàn)圖2C），這說(shuō)明circ-SCN9A 可以調(diào)控這6 個(gè)miRNA 的表達(dá)水平從而影響它們生物學(xué)功能的發(fā)揮，其中hsa-miR-1256與circ-SCN9A 之間的相互作用關(guān)系最為顯著（見(jiàn)圖2）。

3.血清circ-SCN9A 水平在DPNP 中的臨床診斷價(jià)值

圖1 SCN9A 來(lái)源的circRNA 在DPNP 中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位(A) 在SCN9A 來(lái)源的14 條circRNA 分子中，hsa_circ_0117953 (circ-SCN9A)在DPNP 血清中呈現(xiàn)出顯著的高表達(dá)(n = 60)，*P < 0.05，***P < 0.001，與健康對(duì)照組相比；(B) circ-SCN9A 在染色體的位置和轉(zhuǎn)錄剪切模式；(C)與線性SCN9A 轉(zhuǎn)錄本相比，circ-SCN9A 具有抵抗RNA 外切酶的生物學(xué)特性，**P < 0.01；(D)核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ-SCN9A 主要是分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，*P < 0.05，***P < 0.001Fig. 1 Expression and intracellular localization of SCN9A-derived circRNA in DPNP(A) Among 14 circRNA molecules from SCN9A, hsa_circ_0117953 (circ-SCN9A) showed significantly high expression in DPNP serum (n = 60), *P < 0.05, ***P < 0.001, compared with healthy control group; (B) circ-SCN9A in chromosome position and its transcriptional and cleaved pattern; (C) Compared with linear SCN9A transcript, circ-SCN9A has biological characteristics of resistance to RNA exonuclease, **P < 0.01; (D) Nucleocytoplasmic separation experiments confirmed that circ-SCN9A was mainly distributed in the cytoplasm, *P < 0.05, ***P < 0.001.

本研究發(fā)現(xiàn)血清中circ-SCN9A 的水平在DPNP病人和健康對(duì)照者之間存在顯著性差異（見(jiàn)圖1A）。ROC 曲線模型是分析連續(xù)變量特異性和敏感性的指標(biāo)，曲線下的面積越大，則變量的診斷價(jià)值越大。本研究采用該模型來(lái)分析circ-SCN9A 在DPNP 中的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示ROC 曲線的線下面積達(dá)到了0.89，敏感性為0.81，特異性為0.83（見(jiàn)圖2D）。為排除糖尿病本身導(dǎo)致circ-SCN9A 變化的影響，本研究比較了circ-SCN9A 在無(wú)NP 癥狀的2 型糖尿病病人組和健康對(duì)照組之間變化，未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)圖 3A）。DPNP 伴有中度疼痛病人的血清circ-SCN9A 水平顯著低于重度疼痛病人組（P < 0.01，見(jiàn)圖 3B）。這些結(jié)果說(shuō)明circ-SCN9A的表達(dá)變化并不受糖尿病狀態(tài)的影響，而是與其導(dǎo)致的DPNP癥狀相關(guān)，暗示血清中circ-SCN9A 的水平有望作為該病具有診斷價(jià)值的潛在外周生物學(xué)標(biāo)志物。

4. DPNP 相關(guān)circ-SCN9A 可通過(guò)調(diào)控miR-1256影響下游靶基因的表達(dá)

圖2 DPNP 相關(guān)的circ-SCN9A 對(duì)miRNA 的調(diào)控作用和臨床價(jià)值分析(A) LUC 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)篩選出多個(gè)與circ-SCN9A 具有結(jié)合能力的miRNAs；(B) 與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circ-SCN9A 可顯著抑制上述miRNAs 的表達(dá)，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；(C) 與陰性對(duì)照組相比，敲減circ-SCN9A 的表達(dá)水平可顯著提高上述miRNAs 的水平，**P < 0.01，***P < 0.001；(D) ROC 曲線分析顯示血清中circ-SCN9A 水平在DPNP 中具有較好的潛在診斷價(jià)值Fig. 2 The regulatory role of DPNP-related circ-SCN9A on miRNA and its clinical value analysis(A) A number of miRNAs with binding ability to circ-SCN9A were screened by LUC reporter gene assay; (B) Compared with negative control, upregulated circ-SCN9A in cells significantly inhibited the expression of the above miRNAs, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; (C) Compared with negative control, downregulated circ-SCN9A expression can significantly improve the levels of the above miRNAs, **P < 0.01, ***P < 0.001; (D) ROC curve analysis showed that the serum level of circ-SCN9A had good potential diagnostic value in DPNP.

KEGG 是一個(gè)基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫(kù)，用于從分子水平來(lái)了解細(xì)胞和生物系統(tǒng)的高級(jí)功能，為更高層次和更復(fù)雜各種細(xì)胞活動(dòng)和生物體行為作出可靠的計(jì)算推測(cè)。為探究DPNP 相關(guān)circ-SCN9A的神經(jīng)生物學(xué)病理機(jī)制，本研究聯(lián)合多個(gè)生物信息學(xué)分析工具對(duì)circ-SCN9A 互相作用的多個(gè)miRNA進(jìn)行KEGG 生物學(xué)作用通路分析顯示，與circ-SCN9A 存在調(diào)控作用關(guān)系的6 個(gè)miRNA 均共同參與了5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse) 作用通路 （見(jiàn)圖 4A）。對(duì)它們?cè)谠撏分械恼{(diào)控關(guān)系進(jìn)行圖形化展示發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與之有關(guān)的靶向作用蛋白基因（見(jiàn)圖4B）。鑒于其中miR-1256 與circ-SCN9A的作用關(guān)系最為密切（見(jiàn)圖2），本研究采用WB實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-1256 在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶基因鉀向內(nèi)整流通道亞家族J6 (potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 6, KCNJ6) 進(jìn)行蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ-SCN9A 的表達(dá)可以顯著影響下游基因KCNJ6 的蛋白水平（見(jiàn)圖4C）。

討 論

神經(jīng)病變是糖尿病病人常見(jiàn)的并發(fā)癥，20%左右病人有DPNP 的癥狀，嚴(yán)重影響病人日常生活工作及心理健康，相應(yīng)醫(yī)療支出也迅速增加[2,15,16]。高血糖可以使神經(jīng)元處于顯著的氧化應(yīng)激狀態(tài)，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)而釋放組胺、前列腺素、細(xì)胞因子等多種細(xì)胞介質(zhì)[2]。這些介質(zhì)可以作用于神經(jīng)細(xì)胞外膜上的痛覺(jué)感受器使其敏化，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜上離子通道異常開(kāi)放，增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而使得神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度興奮，最終使機(jī)體產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏或超敏狀態(tài)[2]。在痛覺(jué)傳輸?shù)倪^(guò)程中，編碼離子通道蛋白的基因發(fā)揮著重要的作用。SCN9A 基因編碼的離子通道蛋白Nav 1.7 是維持神經(jīng)元興奮性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的傷害感受器神經(jīng)元和大腦皮層下的結(jié)構(gòu)中高度富集表達(dá)[17]。Nav 1.7 的功能獲得性突變與DPNP 等獲得性疼痛病有密切聯(lián)系[17,18]。然而，對(duì)于SCN9A 基因的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本在疼痛相關(guān)的疾病中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，亟待明確。

圖 3 血清circ-SCN9A 水平與疾病臨床特點(diǎn)之間的相關(guān)性比較(A) 血清circ-SCN9A 水平在DPNP 病人組、無(wú)NP 癥狀的2 型糖尿病病人組和健康對(duì)照組之間比較，***P < 0.001；(B) 伴有重度疼痛的DPNP 病人血清circ-SCN9A 水平顯著高于中度疼痛病人組，**P < 0.01Fig. 3 The correlation between serum circ-SCN9A level and clinical characteristics of the disease(A) Serum circ-SCN9A level among DPNP group, type 2 diabetic patients without NP symptoms and healthy controls, ***P < 0.001; (B) The serum circ-SCN9A level of DPNP patients with severe pain was significantly higher than that of patients with moderate pain, **P < 0.01.

本研究對(duì)來(lái)源于SCN9A 基因的circRNA 在DPNP 中的表達(dá)譜進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分circRNA存在顯著的差異表達(dá)，尤以circ-SCN9A 的差異最為顯著（見(jiàn)圖1A）。通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)circ-SCN9A 可以在神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)吸附多個(gè)miRNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)這些miRNA 的生物學(xué)功能（見(jiàn)圖2、3）。在circRNA 與疼痛疾病的研究中發(fā)現(xiàn)circHIPK3 不僅在DPNP 病人的血清內(nèi)高表達(dá)，而且上調(diào)程度與神經(jīng)病理性疼痛分級(jí)呈正相關(guān)[14]。這提示circRNA具有作為DPNP 臨床生物學(xué)標(biāo)志的潛力。本研究利用ROC 模型發(fā)現(xiàn)circ-SCN9A 在外周血血清中的水平具有較好的鑒別DPNP 和健康者的價(jià)值（見(jiàn)圖2D），且不受糖尿病本身狀態(tài)的影響并與DPNP 伴發(fā)的疼痛程度相關(guān)（見(jiàn)圖3），有望成為DPNP 新的客觀生物學(xué)指標(biāo)。為探究其中的分子病理學(xué)基礎(chǔ)，本研究對(duì)circ-SCN9A 所調(diào)控的多個(gè)miRNA 的功能進(jìn)行了生物信息學(xué)集合分析，發(fā)現(xiàn)它們可共同地作用于Serotonergic synapse（5-羥色胺能突觸）通路（見(jiàn)圖3A），調(diào)節(jié)多個(gè)重要功能蛋白（見(jiàn)圖3B）。這其中KCNJ6 基因編碼一種由G 蛋白控制的ATP 敏感的內(nèi)向整流鉀通道[18,19]。已發(fā)現(xiàn)KCNJ6基因的突變可以降低個(gè)體對(duì)痛覺(jué)的敏感性[19]，提示該基因?qū)τ谌祟?lèi)痛覺(jué)閾值的維持具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)circ-SCN9A 的表達(dá)對(duì)于KCNJ6 基因的蛋白水平具有顯著的調(diào)節(jié)作用 （見(jiàn)圖3C）。這一重要發(fā)現(xiàn)從分子神經(jīng)病理學(xué)機(jī)制層面證明了DPNP 相關(guān)的高表達(dá)circ-SCN9A 可抑制miR-1256的基因沉默作用，從而促進(jìn)KCNJ6 基因的蛋白表達(dá)，進(jìn)而使得DPNP 病人痛覺(jué)閾值降低，導(dǎo)致疼痛性臨床癥狀的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于進(jìn)一步深入理解DPNP 發(fā)生的分子神經(jīng)病理學(xué)機(jī)制具有重要的推動(dòng)作用。

圖4 DPNP 相關(guān)的circ-SCN9A-miRNAs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用通路篩選和分子機(jī)制(A) KEGG 分析顯示circ-SCN9A 所調(diào)控的6 個(gè)miRNAs 均作用于5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse)通路；(B) 構(gòu)建circ-SCN9A-miRNAs-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展示circ-SCN9A 在該通路中的基因調(diào)控關(guān)系；(C) circ-SCN9A 的表達(dá)可以顯著影響上述調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中下游基因KCNJ6 的蛋白水平Fig. 4 The pathway screening of DPNP-related circ-SCN9A-miRNAs regulatory network and their molecular mechanism(A) KEGG analysis showed that the 6 miRNAs regulated by circ-SCN9A all acted on the Serotonergic synapse pathway; (B) The regulatory network of circ-SCN9A-miRNAs-mRNA was constructed to demonstrate the gene regulatory relationship in this pathway; (C) Expression of circ-SCN9A can significantly affect the protein level of the downstream gene KCNJ6 in the above regulatory network.

DPNP 的臨床診斷主要依靠于病人的糖尿病病史和臨床表現(xiàn)，一直缺乏有臨床價(jià)值的生物標(biāo)記物，對(duì)于DPNP 病情的客觀評(píng)估造成一定的困難。目前多項(xiàng)研究已證實(shí)circRNA 在外周血中具有較高的穩(wěn)定性和表達(dá)豐度，有望作為神經(jīng)疾病診斷和治療的潛在生物標(biāo)記[20]。外周血血清circRNA 的檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、快速和低成本的優(yōu)點(diǎn)，本研究中DPNP 血清高表達(dá)的circ-SCN9A 不僅參與了DPNP 的發(fā)生發(fā)展并有望具備作為該病潛在的生物學(xué)診斷標(biāo)志的臨床價(jià)值。目前，雖然部分具有5-羥色胺再攝取抑制作用的藥物（如度洛西?。?duì)于DPNP 的治療顯示出較為肯定的療效，但其詳細(xì)作用機(jī)制卻未能完全闡明[2,15]。本研究揭示DPNP 中高表達(dá)的circ-SCN9A 可作用于5-羥色胺能突觸通路，這強(qiáng)烈提示在DPNP 發(fā)生過(guò)程中該通路被阻滯或許是此類(lèi)藥物發(fā)揮DPNP 治療效果的分子藥理學(xué)基礎(chǔ)之一。然而，此類(lèi)藥物對(duì)于5-羥色胺能突觸通路的下游基因靶點(diǎn)的阻斷不具有選擇性，因此常存在諸多不良反應(yīng)和治療風(fēng)險(xiǎn)。

本研究的不足之處在于缺乏活體動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證上述臨床發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞學(xué)機(jī)理，然而本研究為后續(xù)開(kāi)發(fā)針對(duì)DPNP 中5-羥色胺能通路的上游和下游靶點(diǎn)更加特異性的靶向藥物提供了前期基礎(chǔ)，具有重要的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)價(jià)值。

綜上所述，本研究首次闡述了人類(lèi)疼痛相關(guān)基因SCN9A 來(lái)源的circRNA 與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血清中circ-SCN9A 有望作為DPNP 的潛在臨床生物學(xué)標(biāo)記，為更深入理解DPNP 發(fā)生的分子病理學(xué)機(jī)制提出了新的思路，對(duì)后續(xù)該病特異性靶向治療策略的提出具有重要的推動(dòng)意義。