不同亞型胃食管反流病患者呼氣中揮發(fā)性標(biāo)志物的篩選

阿麗葉古麗·艾皮熱阿卜杜喀迪爾 買(mǎi)買(mǎi)提·依斯熱依力 王儉 克力木·阿不都熱依木，

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是胃內(nèi)容物反流入食管引起不適癥狀和（或）并發(fā)癥的一種慢性消化系統(tǒng)疾病，燒心和反酸是其典型癥狀，也可以表現(xiàn)為非典型的食管外癥狀，如非心源性胸痛、慢性咳嗽、哮喘或咽喉炎等[1]。因此大部分患者早期選擇去心內(nèi)科、呼吸科或耳鼻喉科等科室就診，無(wú)法早期明確診斷，延誤治療時(shí)機(jī)。目前，GERD的診斷是要結(jié)合臨床癥狀、抑酸反應(yīng)、上消化道內(nèi)鏡檢查、食管pH值監(jiān)測(cè)及上消化道造影等客觀檢查結(jié)果來(lái)綜合診斷，此綜合診斷容易受到主觀因素的影響和具有侵入性，推廣具有一定的局限性，此外，醫(yī)療費(fèi)用也較高[2]。因此，大部分患者的配合度不高。目前，在臨床迫切需要研究一種簡(jiǎn)便、快捷、無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)的快速篩查方法。

人體呼氣分析是一種簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛的新興技術(shù)，可用于疾病診斷，療效評(píng)估，并可提供潛在的疾病發(fā)病機(jī)制線索。人體呼出氣體中有3 000余種揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs），它們直接或間接地與機(jī)體病理生理過(guò)程有關(guān)，這提供了窺視人體新陳代謝的“窗口”。近年來(lái)，隨著氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等代謝組學(xué)分析平臺(tái)的靈敏度、分離能力及穩(wěn)定性提高，呼氣分析在臨床疾病診斷中得到廣泛應(yīng)用[3-8]。因此，本研究利用固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）聯(lián)用GC-MS技術(shù)分析GERD及健康對(duì)照人群的呼氣成分，篩查GERD中的差異性VOCs，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)其對(duì)GERD診斷的價(jià)值，為GERD的早期診斷提供新的方法。

對(duì)象與方法

一、一般資料

收集2019年11月至2020年10于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院住院治療的97例GERD患者及29例健康體檢的人群作為研究對(duì)象。完整地記錄每位研究對(duì)象的胃鏡結(jié)果，24 h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果，年齡、性別、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）等相關(guān)臨床檢查結(jié)果及資料。所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。本研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)為2018D01C119）。

二、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.GERD納入標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)鏡結(jié)果不正常；有酸反流。

2.非GERD納入標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)鏡結(jié)果正常，食管24 h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果為生理性酸反流。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：賁門(mén)失弛緩癥；孕婦或哺乳期婦女；有嚴(yán)重的胃食管器質(zhì)性病變；有嚴(yán)重的心肺疾??；糖尿??；腎衰竭尿毒癥期或患有可引起GERD相關(guān)癥狀的其他疾??；拒絕簽知情同意書(shū)者。

三、分組方法

29例健康體檢的人群分為對(duì)照組。97例GERD患者分為糜爛性食管炎伴病理性酸反流（erosive esophagitis+24 h pH+，EE+24 h pH+）、糜爛性食管炎伴生理性酸反流（erosive esophagitis+24 h pH-，EE+24 h pH-）、非糜爛性反流病（nonerosive reflux disease，NERD）、Barrett食管（Barrett's esophagus，BE）

1.EE+24 h pH+組：內(nèi)鏡結(jié)果屬于EE，包括LA-A～D級(jí)[9]，食管24 h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果為病理性酸反流。

2.EE+24 h pH-組：內(nèi)鏡結(jié)果為EE，食管24 h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果為生理性酸反流。

3.NERD組：內(nèi)鏡結(jié)果為非糜爛性反流?。╪on-erosive reflux disease，NERD），食管24 h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果為病理性酸反流。

4.對(duì)照組：內(nèi)鏡結(jié)果正常，食管24h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果為生理性酸反流。BE組：內(nèi)鏡結(jié)果屬于Barrett食管（Barrett's esophagus，BE），BE是內(nèi)鏡下可見(jiàn)的食管柱狀上皮化生，病理結(jié)果為一種特殊的腸化生上皮[10]。賁門(mén)失弛緩癥、孕婦或哺乳期婦女、有嚴(yán)重的胃食管器質(zhì)性病變、有嚴(yán)重的心肺疾病，糖尿病，腎衰竭尿毒癥期或患有可引起GERD相關(guān)癥狀的其他疾病、拒絕簽知情同意書(shū)者均排除。

四、研究方法

采用無(wú)菌鋁箔復(fù)合膜呼氣采集袋（東莞市康迪包裝公司）收集呼氣標(biāo)本，受試者當(dāng)天零點(diǎn)開(kāi)始禁食水，晨起后到收集向集氣袋吹氣直至氣袋充滿(mǎn)為止（勿深呼氣，勿斷續(xù)吐氣）。SPME萃取頭（PDMS/DVB 65 μm PK3，北京康林科技有限責(zé)任公司）每次使用前加熱預(yù)處理，在250℃條件下加熱30 min以除去殘留物質(zhì)；在室溫萃取20 min，萃取過(guò)程中標(biāo)本放入60℃的水浴加熱；立即接到GCMS聯(lián)用儀器（美國(guó)Agilent 7890-5975C）進(jìn)樣本；色譜條件為 Agilent HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm，北京飛美斯分析科技有限公司），高純氦氣（純度：99.999%）載氣，柱流量1.0 ml/min。程序升溫條件初始柱溫40℃，保留2min，以3℃/min升溫至250℃，維持10 min。進(jìn)樣口溫度為250℃，不分流。質(zhì)譜條件為電離方式EI，碰撞能量為70 ev，離子源溫度230℃，全掃描（30～800 m/z）。將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MPP軟件（Agilent G3835AA MassHunter Mass Profiler Professional）進(jìn)行分析。定量分析方法使用目前應(yīng)用較廣泛的內(nèi)標(biāo)比值法，統(tǒng)一將CO2的峰面積作為基數(shù)，把其他VOCs的峰面積定量化（I'm=Im/ICO2×109）。Im代表某VOCs的峰面積，I'm為歸一化后的相對(duì)定量數(shù)據(jù)[11]。

五、評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.主成份分析（principal component analysis，PCA）分析：用于不同亞型GERD與非GERD組別間的區(qū)分。

2.診斷效果評(píng)價(jià)采用受試者工作特征（ROC）曲線分析：測(cè)出指標(biāo)曲線下面積，確定CUT-OFF值和約登指數(shù)，得出診斷指標(biāo)的靈敏度和特異度。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)；靈敏度和特異度用于檢驗(yàn)診斷模型價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、納入本研究的一般臨床資料

本研究共納入126例研究對(duì)象，其中EE+24 h pH+組24例，EE+24 h pH-組28例，NERD組36例，對(duì)照組29例，BE組9例。GERD不同亞型組患者體重、BMI與對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），（見(jiàn)表1）。

表1 各組基礎(chǔ)資料與對(duì)照組比較

二、GC-MS結(jié)果

1.PCA分析：從各組數(shù)據(jù)的PCA得分圖可以看出，EE+24 h pH+組、EE+24 h pH-組、NERD組、BE組與對(duì)照組之間分離較好，樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)（見(jiàn)圖1）。

圖1 各組樣本PCA得分圖

2.GERD-組與對(duì)照組間的差異性代謝物：MPP軟件分析GERD組與對(duì)照組所有樣品，共檢測(cè)到184個(gè)化合物。其中，兩組間有差異的化合物有4個(gè)。將化合物帶回Masshunter軟件，篩選出峰形較好、差異顯著的化合物，利用NIST14（http://webbook.nist.gov/chemistry）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)可能的標(biāo)記物做鑒定，匹配度大于90%的鑒定結(jié)果較為可信（見(jiàn)表2）。

表2 GERD差異代謝物鑒別結(jié)果

3.不同亞型GERD組與對(duì)照組間的差異性代謝物：MPP軟件分析EE+24 h pH+組與對(duì)照組所有樣品，共檢測(cè)到164個(gè)化合物。組間比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，找到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異化合物4個(gè)（P＜0.05）。EE+24 h pH-組與對(duì)照組樣品共檢測(cè)出161個(gè)化合物，其中差異性化合物有3個(gè)。NERD組與對(duì)照組樣本共檢測(cè)到153個(gè)化合物，其中有差異化合物4個(gè)。BE組與對(duì)照組樣本共檢測(cè)到126個(gè)化合物，但無(wú)差異性化合物。將所有化合物帶回Masshunter軟件，篩選出峰形較好、差異顯著的化合物，利用NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)可能的標(biāo)記物做鑒定，匹配度大于90%的鑒定結(jié)果較為可信（見(jiàn)表3）。

表3 不同亞型GERD的差異代謝物鑒別結(jié)果

三、驗(yàn)證差異性VOCs對(duì)GERD診斷的可行性

本研究在GERD中鑒定出了正十二烷、正十六烷、5-甲基-十一烷、5-乙基癸烷等4種差異性VOCs。通過(guò)受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線評(píng)價(jià)它們用于診斷GERD的價(jià)值。5-乙基癸烷診斷GERD的靈敏度可達(dá)80.9%，特異度可達(dá)47.61%，曲線下面積0.603，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。5-甲基-十一烷診斷GERD的靈敏度可達(dá)88.40%，特異度可達(dá)48.4%；正十二烷和正十六烷診斷GERD的靈敏度可達(dá)91.20%，特異度可達(dá)53.86%（見(jiàn)表4和圖2）。因各GERD亞型組樣本量較少，無(wú)法進(jìn)一步評(píng)估其VOCs在診斷GERD亞型中的作用，需要大樣本研究來(lái)進(jìn)一步評(píng)估。

表4 正十二烷、正十六烷、5-甲基十一烷、5-乙基十一烷的診斷價(jià)值

圖2 正十二烷、正十六烷、5-甲基十一烷、5-乙基十一烷的ROC曲線

討 論

GERD是由功能性或器質(zhì)性因素導(dǎo)致胃食管連接處抗反流屏障的減弱或破壞，導(dǎo)致的食管暴露于酸性反流物中，并對(duì)食管造成器質(zhì)性損傷的疾病。這不但影響患者的日常生活質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引發(fā)包括BE，乃至食管腺癌、賁門(mén)癌等多種惡性消化系統(tǒng)疾病[1，12-14]。GERD根據(jù)內(nèi)鏡和組織病理學(xué)表現(xiàn)可分為NERD、EE及BE三種不同表型，其中，NERD最常見(jiàn)，占約60～70%，其次為EE（30%）和BE（6%～12%）[2]。GERD診斷一般是結(jié)合臨床癥狀、抑酸反應(yīng)、內(nèi)鏡檢查、食管pH監(jiān)測(cè)以及上消化道造影等客觀檢查結(jié)果來(lái)綜合診斷。其中，GERD調(diào)查問(wèn)卷法是患者對(duì)典型癥狀“反酸、燒心”的自我描述，結(jié)果易受到主觀因素的影響。胃鏡作為進(jìn)一步明確診斷GERD的傳統(tǒng)檢查手段，雖然特異度較高，但是敏感性較低，特別是對(duì)NERD患者診斷存在一定的局限性，同時(shí)胃鏡是侵入性檢查，易引起患者不適。食管24 h pH監(jiān)測(cè)雖然能補(bǔ)充內(nèi)鏡檢查的缺點(diǎn)等，但是仍屬于侵襲性檢查，需堅(jiān)持24 h，患者的配合度不高，而且醫(yī)療費(fèi)用較高[2]。因此，臨床迫切需要研究一種簡(jiǎn)便、快捷、無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)的快速篩查方法。

本研究利用GC-MS技術(shù)檢測(cè)GERD及健康對(duì)照人群呼氣樣本，共鑒定出正十二烷、正十六烷、5-甲基-十一烷、5-乙基癸烷等4種差異性VOCs。在不同亞型GERD患者中，EE+24 h pH+中鑒定出正十四烷、正十六烷、5-甲基-十一烷及5-丙基壬烷等4種差異性代謝物，其中正十六烷和5-甲基-十一烷與GERD組結(jié)果重疊，而正十四烷和5-丙基壬烷在此組中特異的差異性VOCs，因此初步可以認(rèn)為正十四烷和5-丙基壬烷為EE+24 h pH+的標(biāo)志性代謝物。EE+24 h pH-鑒定出5-甲基-十一烷、5-丙基壬烷及5-乙基癸烷等3種差異性代謝物，其中5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷與EE+24 h pH+患者呼氣結(jié)果一致，而5-乙基癸烷在EE+24 h pH-中獨(dú)有，因此初步可以認(rèn)定5-乙基癸烷是EE+24 h pH-的標(biāo)志性VOCs。說(shuō)明5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷無(wú)論有無(wú)pH+，在EE中均表現(xiàn)出差異性，故5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷可能是EE的標(biāo)志性VOCs。在NERD中共鑒定出了鄰三氟甲基苯甲酸、2-甲基-十一烷及正十二烷等3種差異性VOCs。其中正十二烷跟GERD組與對(duì)照組結(jié)果一致。因此，NERD可能的標(biāo)志性VOCs可能是三氟甲基苯甲酸和2-甲基-十一烷。BE未篩選出差異性的VOCs，可能是與樣本量有關(guān)。

人體產(chǎn)生的內(nèi)源性VOCs主要包括烷烴類(lèi)、烯醇類(lèi)、芳香族類(lèi)等，這與體內(nèi)腸道菌群改變有關(guān)[15]。在GERD中檢測(cè)的特異性VOCs的病理生理機(jī)制目前尚未明確?？赡芘cGERD患者體內(nèi)微生物代謝的改變有關(guān)，因此它也可能是GERD中VOCs產(chǎn)生的機(jī)制之一。

本研究對(duì)篩選出來(lái)的4種VOCs作ROC曲線，評(píng)價(jià)這4種VOCs的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示5-乙基癸烷診斷GERD的靈敏度和特異度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此5-乙基癸烷在診斷GERD中無(wú)參考價(jià)值。5-甲基-十一烷、正十六烷這2種標(biāo)志性VOCs診斷GERD的敏感性良好，但是它們特異度均較低，曲線下面積在0.6～0.7之間，診斷價(jià)值較低。只有正十二烷靈敏度較高，曲線下面積大于0.7，參考價(jià)值中等，因此5-甲基-十一烷，正十二烷和正十六烷可作為早期篩選GERD及健康人群的標(biāo)志性VOCs，其中正十二烷可能作為早期診斷GERD的新參考指標(biāo)。