抗菌聚己內(nèi)酯/聚乳酸納米纖維膜的制備及其性能

王英灃,殷茂力，楊 釗,李廣滔,周勝武

(安徽工程大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

皮膚作為人體最大的器官，是人體機(jī)能維持和保護(hù)最重要的屏障，也是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的組成部分。由于各種外傷或病理性因素導(dǎo)致皮膚的損傷或缺失，會對人體的健康造成影響，嚴(yán)重時甚至危及生命。因此,需要開發(fā)一種具有優(yōu)良性能的創(chuàng)傷敷料，以利于皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。靜電紡絲技術(shù)由于其操作較為簡單，成本較低，非織造網(wǎng)狀的多孔結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷敷料的制備過程。相較于天然高分子材料，合成高分子材料具有易于加工、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，從而被廣泛應(yīng)用于靜電紡絲法制備的醫(yī)用敷料中。此外，醫(yī)用敷料使用后的環(huán)保問題同樣是必須考慮的因素。因此，可降解高分子材料在醫(yī)用敷料領(lǐng)域受到了越來越多的關(guān)注。

聚己內(nèi)酯(PCL)是一種二元醇引發(fā)組合，并由己內(nèi)酯聚合形成的一種線型高分子化合物。PCL材料具有良好的柔韌性和加工性能，被廣泛應(yīng)用于可降解材料、醫(yī)療衛(wèi)生、納米纖維紡絲、塑料材料等領(lǐng)域。但作為靜電紡絲材料，純PCL的纖維成形性和均勻度較低，無法符合醫(yī)用敷料的相應(yīng)使用需求?；诖?，需要添加一種可紡性能優(yōu)異的可降解高分子材料以改善PCL可紡性差的問題。聚乳酸(PLA)是一種通過乳酸的共沸脫水縮聚形成的聚合材料，相關(guān)原料可由木薯、小麥、玉米等農(nóng)作物中獲得，是一種理想的可再生環(huán)保降解材料。基于此，可以通過對PCL和PLA共混靜電紡絲制備可降解的醫(yī)用敷料，達(dá)到材料性能互補(bǔ)的作用。為了保證復(fù)合納米纖維膜的抗菌性能，在靜電紡絲過程中常常摻雜抗菌劑進(jìn)行共混紡絲，達(dá)到賦予材料抗菌性能的目的。鹵胺由于其高效、抗菌持久、抗菌性能可再生等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于靜電紡絲材料中。

研究中采用PCL和PLA作為靜電紡絲材料，通過添加鹵胺小分子制備具有優(yōu)異抗菌性能的復(fù)合納米纖維膜。系統(tǒng)探究了材料的儲藏穩(wěn)定性能及降解性能的變化規(guī)律，并對材料的抗菌性能進(jìn)行了分析和研究，為醫(yī)用可降解敷料的制備和研究提供了一些新的思路和方向。

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器與試劑

聚己內(nèi)酯(PCL，重均分子量15萬，上海百靈威科技有限公司)；聚乳酸(PLA，重均分子量8萬，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1,3-二氯-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲(DCDMH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；LB營養(yǎng)瓊脂、LB MILLER肉湯、胰酪大豆胨瓊脂及胰酪大豆胨肉湯,均購自北京奧博星生物科技有限公司；甲醇、氯仿、無水乙醇等其他藥品,均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 復(fù)合納米纖維膜的制備

(1)稱取一定量的PCL和PLA固體(w/w，1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1)，分批溶解于20 mL氯仿/甲醇混合溶液中(v/v，2∶1)，采用磁力攪拌的方式室溫攪拌6 h(200 r/min)，配制濃度均一的澄清溶液。為保證實(shí)驗條件一致，配制的PCL/PLA紡絲溶液濃度為10 wt%；紡絲工藝：紡絲電壓15 kV，紡絲距離25 cm，紡絲速度2 mL/h，針頭往返移動距離100 cm，接收輥筒轉(zhuǎn)速150 r/min。

(2)選取步驟(1)中最佳PCL/PLA紡絲比例，分批溶解于20 mL氯仿/甲醇混合溶液中(v/v，2∶1)，于室溫下采用磁力攪拌的形式(6 h，200 r/min)配制濃度為10 wt%的均一澄清溶液。添加不同比例的鹵胺抗菌劑DCDMH(3 wt%、5 wt%、7 wt%、9 wt%、11 wt%)至上述溶液中繼續(xù)攪拌1 h。待DCDMH完全溶解后，采用相同紡絲工藝進(jìn)行紡絲，制備復(fù)合納米纖維膜。待紡絲完成后，將輥筒上鋁箔紙揭下，并置于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥12 h備用，所得到的納米纖維膜樣品分別標(biāo)記為：PCL/PLA-3、PCL/PLA-5、PCL/PLA-7、PCL/PLA-9、PCL/PLA-11。

1.3 復(fù)合納米纖維膜的含氯量測試

采用碘化鉀/硫代硫酸鈉滴定法對樣品的活性氯含量進(jìn)行標(biāo)定。樣品中的鹵胺結(jié)構(gòu)在水分子的作用下形成氯正離子，與碘離子反應(yīng)后形成單質(zhì)碘，并在淀粉的作用下生成藍(lán)色物。通過硫代硫酸鈉的作用將碘單質(zhì)氧化成碘離子，使溶液顏色消失，進(jìn)而標(biāo)定樣品中鹵胺活性氯的含量。具體操作方法如下：稱取一定量的樣品，剪碎后放入燒杯中，加入20 mL去離子水并于室溫下持續(xù)攪拌。30 min后，稱取2 g碘化鉀，與幾滴1 wt%的淀粉溶液一并加入上述燒杯中，繼續(xù)攪拌30 min。隨后采用硫代硫酸鈉對溶液進(jìn)行滴定，直至溶液褪色至無色，并記錄硫代硫酸鈉用量。樣品的含氯量計算公式如式(1)所示。

(1)

式中，

N

為硫代硫酸鈉當(dāng)量濃度(N)；

ΔV

為硫代硫酸鈉用量(L)；

W

為樣品質(zhì)量(g)。

1.4 復(fù)合納米纖維膜降解性能測試

裁剪一定大小的復(fù)合納米纖維膜，于45 ℃真空干燥箱中干燥1 d備用。對干燥后的樣品進(jìn)行稱重后，浸泡至PBS溶液中，并放入培養(yǎng)箱中恒溫37 ℃靜置。每隔一天對樣品中的PBS溶液進(jìn)行更換。待一定時間后(5 d、10 d、20 d、30 d)，將樣品從PBS溶液中取出，并使用大量去離子水沖洗，隨后使用濾紙吸干樣品表面水分。待放入冰箱中冷凍，并將樣品放入冷凍干燥機(jī)中干燥后，稱取相應(yīng)樣品重量。樣品的降解性能由式(2)計算得出；樣品表面形貌由掃描電鏡(SEM)進(jìn)行觀測。

(2)

式中，

m

表示樣品降解前質(zhì)量；

m

表示樣品降解后質(zhì)量。

1.5 復(fù)合納米纖維膜儲藏穩(wěn)定性能測試

裁剪一定大小的復(fù)合納米纖維膜，裝入自封袋避光保存。分別放置5 d、10 d、20 d、30 d后，取出相應(yīng)樣品，并使用硫代硫酸鈉滴定樣品中的活性氯含量。計算公式如式(1)所示。

1.6 接觸性抗菌性能測試

(1)細(xì)菌培養(yǎng)。用接種環(huán)刮取一定量的細(xì)菌，并加入裝有5 mL液態(tài)培養(yǎng)液(Broth)的玻璃管中；渦旋使細(xì)菌分散均勻，并將玻璃管置于恒溫?fù)u床中37 ℃震蕩培養(yǎng)(120 r/min)。待細(xì)菌培養(yǎng)18～24 h后，離心分離細(xì)菌，并采用5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)對細(xì)菌進(jìn)行洗滌。最后取0.1 mL上述分散均勻的細(xì)菌/PBS懸浮液，加入新的裝有Broth的玻璃管中，并放入振蕩箱中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，此為一代細(xì)菌。將上述細(xì)菌繁殖三代后備用。

(2)抗菌性能測試。將樣品裁剪成2.54 cm×2.54 cm大小備用。在無菌操作臺中將一片樣品放置于培養(yǎng)皿表面，滴加25 μL細(xì)菌懸浮液；將另一片樣品以“三明治”的形式覆蓋在樣品表面，并使用無菌重物壓緊，以保證菌液與樣品的充分接觸。待一定時間后(1 min、5 min、10 min、30 min)，將兩片樣品放入5 mL 0.02 N的硫代硫酸鈉溶液中，以猝滅樣品表面殘存的活性氯。將上述淬滅后溶液渦旋10 s后，采用100 mmol/L PBS溶液進(jìn)行連續(xù)稀釋，并均勻滴加至固體培養(yǎng)皿表面。待培養(yǎng)皿于37 ℃下培養(yǎng)24 h后，對樣品的菌落數(shù)進(jìn)行測定，并計算抗菌率?？瞻讟硬僮髋c上述實(shí)驗樣相同，接觸時間采用30 min。樣品的抗菌性能通過如下公式進(jìn)行計算：

(3)

細(xì)菌對數(shù)減少值=

LogN

-

LogN

,

(4)

式中，

N

為樣品細(xì)菌菌落數(shù)；

N

為空白樣細(xì)菌菌落數(shù)。

1.7 測試與表征

復(fù)合納米纖維膜制備采用匯智電紡設(shè)備，并于實(shí)驗室自行組裝完成，靜電紡絲所用高壓直流電源來自東文高壓電源(天津)股份有限公司。樣品形貌分析采用掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S4800)對樣品表面進(jìn)行觀察；樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)采用傅里葉紅外光譜分析儀(FT-IR，Nicolet iS5)對樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，掃描范圍為500～4 000 cm。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合納米纖維膜化學(xué)結(jié)構(gòu)及微觀形貌分析

聚乳酸和聚己內(nèi)酯的不同性能使得它們在不同的溶劑體系中的溶解狀況發(fā)生不同的變化，進(jìn)而導(dǎo)致紡絲后出現(xiàn)多種不同的纖維形貌。前期研究發(fā)現(xiàn)，聚己內(nèi)酯在純氯仿溶劑體系中很難通過靜電紡絲制備細(xì)度分布均勻的納米纖維膜?；诖?，我們采用氯仿/甲醇體系作為方式的溶劑體系，制備所需的納米纖維膜。

靜電紡絲制備的納米纖維膜的表面形貌圖像如圖1所示。由圖1可知，所有納米纖維均呈現(xiàn)一定的光滑、無規(guī)則的纖維形態(tài)，并沒有珠結(jié)點(diǎn)產(chǎn)生。當(dāng)溶質(zhì)體系中PCL用量增加時，納米纖維膜的均勻度遭到一定破壞，納米纖維之間發(fā)生粘結(jié)現(xiàn)象，納米纖維的取向度以及纖維的均勻度仍然較差。實(shí)驗中對各樣品的直徑進(jìn)行了分析和統(tǒng)計，不同比例PCL/PLA(1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1)的單根纖維直徑分別為：518 nm、251 nm、486 nm、1 008 nm、438 nm。其中PCL/PLA紡絲比例為5∶5時，纖維的整體形貌最好，纖維直徑尺寸最細(xì)，更有利于后期研究及應(yīng)用。因此，選取纖維均勻度和表面形貌最佳的PCL/PLA比例(PCL∶PLA=3∶7)進(jìn)行后續(xù)的靜電紡絲研究工作。

圖1 納米纖維膜的SEM圖像及直徑分布

基于上述最佳工藝，添加不同量的DCDMH至PCL/PLA納米纖維膜中，相關(guān)氯含量的影響和紅外光譜圖測試如圖2所示。基于鹵胺結(jié)構(gòu)的特性，鹵胺化合物的抗菌性能的高低可由氯含量的大小決定。前期研究發(fā)現(xiàn)，鹵胺改性納米纖維膜類材料的活性氯含量高于0.1 wt%時，樣品即可具備較好的抗菌效果?；诖耍謩e對PCL/PLA-3、PCL/PLA-5、PCL/PLA-7、PCL/PLA-9和PCL/PLA-11的氯含量進(jìn)行測試。由測試結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，納米纖維膜的氯含量隨著DCDMH的添加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。當(dāng)DCDMH添加量從5 wt%調(diào)整至7 wt%時，樣品氯含量增加率最高；PCL/PLA-7的氯含量可達(dá)到0.17±0.01 wt%。因此，從抗菌效果及經(jīng)濟(jì)化角度考慮，選取PCL/PLA-7作為最佳比例的復(fù)合納米纖維膜。

DCDMH添加對PCL/PLA納米纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)影響如圖2b所示。由于PCL、PLA以及DCDMH化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，位于2 945 cm及2 865 cm處的強(qiáng)衍射峰是由于甲基和亞甲基的對稱及非對稱伸縮振動引起的；于1 725 cm處出現(xiàn)的強(qiáng)衍射峰屬于羰基的伸縮振動峰。由圖2b可以看出，PCL/PLA-7樣品的羰基衍射峰明顯強(qiáng)于PCL/PLA，這是由于DCDMH中的酰胺及酰亞胺結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了該處吸收峰的強(qiáng)度。

圖2 DCDMH添加對PCL/PLA納米纖維膜的影響

為了進(jìn)一步證明鹵胺小分子混入納米纖維膜中，對PCL/PLA以及PCL/PLA-7的XPS能譜進(jìn)行測試，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入DCDMH后，PLC/PLA-7的譜圖中明顯地出現(xiàn)了N元素(N 1s：399.54 eV)及Cl元素(Cl 2p:199.54 eV)的衍射峰。由于PCL和PLA結(jié)構(gòu)中不存在N元素和Cl元素，所以這是由DCDMH中的酰胺結(jié)構(gòu)和鹵胺結(jié)構(gòu)所引入的。結(jié)合紅外光譜測試結(jié)果可以證明，DCDMH成功地混入了PCL/PLA納米纖維膜中，并且對鹵胺結(jié)構(gòu)未造成影響。

2.2 復(fù)合納米纖維膜的降解性能

基于復(fù)合納米纖維膜的應(yīng)用領(lǐng)域，對樣品(PCL/PLA-7)在模擬人體體溫及體液條件下的降解性能進(jìn)行測試。復(fù)合納米纖維膜的降解性能如圖4所示。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，樣品在前10天降解速度較快，樣品降解率在10 d時達(dá)到了5.4 wt%。隨后樣品的降解趨于平緩，于30 d后樣品的降解率達(dá)到7.4 wt%，樣品的降解速率相對恒定。PCL/PLA-7可以在無酶環(huán)境下實(shí)現(xiàn)緩慢的降解，分子結(jié)構(gòu)中的酯鍵發(fā)生斷裂造成高分子分解，進(jìn)而分解成二氧化碳和水。對降解30 d后的PCL/PLA-7的表面形貌進(jìn)行觀測，其掃描電鏡圖像如圖5所示。對比原樣可以發(fā)現(xiàn)，纖維表面光潔度及均勻度出現(xiàn)了極大的下降，纖維的表面形貌遭到了一定破壞；但是，降解30 d后的樣品仍然具備一定的纖維及非織造材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)，說明樣品在經(jīng)過一段時間降解后，仍能保持一定的結(jié)構(gòu)和物理性能。

圖3 復(fù)合納米纖維膜XPS圖 圖4 復(fù)合納米纖維膜的降解性能

圖5 體外降解前和30 d后樣品表面的SEM圖

2.3 復(fù)合納米纖維膜儲藏穩(wěn)定性能

復(fù)合納米纖維膜儲藏穩(wěn)定性也是實(shí)際應(yīng)用中較為重要的性能指標(biāo)。因此，對PCL/PLA-7室溫避光保存情況下的氯含量進(jìn)行測試，以此來檢測樣品的抗菌性能的穩(wěn)定性。樣品存儲穩(wěn)定性能測試如圖6所示。由圖6可以發(fā)現(xiàn)，樣品的含氯量在10 d內(nèi)下降較為迅速，這是空氣中的水分子與樣品中的鹵胺結(jié)構(gòu)反應(yīng)，N-Cl鍵分解造成的。鹵胺結(jié)構(gòu)可在合適的條件下與水分子發(fā)生反應(yīng)并水解，生成次氯酸結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致含氯量的降低。在隨后的存儲時間內(nèi)，樣品的含氯量并未發(fā)生大幅降低的情況；30 d后PCL/PLA-7的含氯量可達(dá)到(0.12±0.01) wt%?；谇捌谘芯浚琍CL/PLA-7在存儲30 d后，仍然具備較好的抗菌性能。

圖6 樣品存儲穩(wěn)定性能測試

2.4 復(fù)合納米纖維膜的抗菌性能

抗菌性能是醫(yī)用敷料的重要性能指標(biāo)之一；優(yōu)良的抗菌性能不但能保證樣品表面的清潔程度，同時可以減少患者被感染的概率，極大地減少患者的痛苦。實(shí)驗中采用“三明治式”接觸法對樣品的抗菌性能進(jìn)行測試。實(shí)驗中采用的金黃色葡萄球菌的接種濃度為3.75×10CFU/sample，大腸桿菌O157:H7接種濃度為2.25×10CFU/sample，樣品氯含量為(0.17±0.01) wt%。樣品的抗菌性能如表1所示。由表1可知，PCL/PLA-7展現(xiàn)了優(yōu)異的抗菌性能，分別可在接觸時間為5 min及10 min內(nèi)完全殺滅數(shù)量級為7的大腸桿菌O157:H7和金黃色葡萄球菌，且樣品對大腸桿菌O157:H7的抗菌效果要略高于金黃色葡萄球菌。造成上述結(jié)果的原因主要有兩點(diǎn)：①金黃色葡萄球菌的整體細(xì)菌濃度要高于大腸桿菌O157:H7，大腸桿菌O157:H7的細(xì)菌濃度僅為金黃色葡萄球菌的60%；②細(xì)菌表面主要由肽聚糖組成，而大腸桿菌O157:H7的肽聚糖細(xì)胞膜的厚度(7～8 nm)要比金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜厚度(20～80 nm)薄，因此更容易發(fā)生溶解進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。值得注意的是，PCL/PLA樣品在與細(xì)菌接觸30 min后，細(xì)菌同樣發(fā)生了一定的減少，這是由于樣品在與細(xì)菌渦旋分離時，部分細(xì)菌粘附在樣品表面。以金黃色葡萄球菌為例，通過培養(yǎng)皿的直觀顯示了PCL/PLA-7的抗菌效果如圖7所示。

表1 樣品抗菌性能測試

圖7 樣品對金黃色葡萄球菌抗菌效果圖

3 結(jié)論

可降解材料的抗菌性能和降解性能是材料應(yīng)用過程中最為主要的性能之一?；诖耍狙芯客ㄟ^靜電紡絲的形式，制備了負(fù)載鹵胺抗菌劑的復(fù)合納米纖維膜。PCL和PLA高分子在甲醇/氯仿體系中可以充分互溶，得到直徑均勻的納米纖維膜。采用綜合性能最佳的納米纖維膜(PCL∶PLA=3∶7)與鹵胺小分子抗菌劑(MCDMH)結(jié)合，制備具有抗菌性能的復(fù)合納米纖維膜。當(dāng)MCDMH添加量為7 wt%時，材料即可獲得較佳的抗菌效果，可在5 min和10 min內(nèi)殺死100%的大腸桿菌O157:H7和金黃色葡萄球菌。材料儲藏穩(wěn)定性良好，30 d避光保存后仍可達(dá)到材料的抗菌要求。降解測試表明，材料在模擬體液中存在較好的降解行為，降解30 d后降解率為7.4 wt%，且材料仍保持一定的物理結(jié)構(gòu)和性能。上述研究為可降解材料的抗菌性能領(lǐng)域提供了新的思路及方向，在醫(yī)用材料領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。